猪源艰难梭菌的分离鉴定及特性分析

为了解河南省规模化猪场猪源艰难梭菌的流行、耐药以及毒素基因携带情况,收集来自豫西地区5个养殖场中疑似艰难梭菌感染(clostridium difficile infection,CDI)猪的粪便标本(n=41)。采用厌氧培养法,用艰难梭菌选择性培养基环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂(cycloserine-cefoxitin-fructose agar,CCFA)完成分离培养。采用表型培养法进行菌株分离和鉴定,以多重PCR同时鉴定菌株并检测tcdA和tcdB毒素基因及二元毒素编码基因cdtA和cdtB。采用E-test法检测艰难梭菌对常用抗生素的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)值并判定菌株对药物的敏感性。结果从分离的41份样本中,经染色镜检及PCR鉴定,分离出符合艰难梭菌生长特性的菌株1株。药敏结果显示分离菌株对万古霉素和甲硝唑呈现高度敏感,对氟喹诺酮类药物以及四环素等表现出不同程度的耐药。艰难梭菌的研究大多集中在人源方面,本研究首次在河南省规模化养猪场中分离出艰难梭菌,对所分离菌株进行毒素基因检测,毒素A、B呈阳性,而无二元毒素基因。分离的猪源艰难梭菌对红霉素、万古霉素、甲硝唑、利福平均呈现高度敏感,对克林霉素、阿莫西林、左氧氟沙星、利奈唑酮和青霉素呈现不同程度的耐药。     

艰难梭菌毒素及致病基因的研究进展

艰难梭菌是一种革兰阳性厌氧芽胞梭菌,是人类肠道感染的主要致病菌,以肠道病理损伤及菌群失调为主的感染性疾病.使用抗菌药物后可导致艰难梭菌过度生长,分泌大量毒素A(肠毒素)和毒素B(细胞毒素),通过毒素介导致病.毒素A启动细胞损伤后,毒素B即可侵入肠黏膜,引起细胞病变,导致一系列与感染相关的临床表现.少数强毒株艰难梭菌还可以产生二元毒素,该毒素可以导致细胞骨架破坏,增强毒素A和毒素B的作用导致严重病变.研究发现,人和动物艰难梭菌之间具有同源性,成为人类感染艰难梭菌的传染源.对艰难梭菌产生毒素的致病机理进行综述,为治疗艰难梭菌感染提供依据.     

艰难梭菌毒素致病机理的研究进展

艰难梭菌是一种革兰氏阳性厌氧芽胞梭菌,是人类肠道感染的主要致病菌,其主要致病因素为毒素A(肠毒素)和毒素B(细胞毒素).毒素A引发细胞损伤后,毒素B即可侵入肠黏膜,引起细胞病变,导致一系列与感染相关的临床表现.同时,艰难梭菌毒素也是引起猪、鸡等畜禽发生腹泻的重要因素,因此探讨艰难梭菌毒素对机体的损伤作用,有利于揭示艰难梭菌的致病机理,为其防控提供理论依据.     

艰难梭菌毒素功能区的免疫原性及其疫苗应用的研究进展

随着人们对抗生素的使用日益普遍,艰难梭菌感染的发病率和疾病的严重程度在全球范围内呈大幅度上升趋势。目前国内外均出现同时耐特效药甲硝唑、万古霉素的艰难梭菌菌株,艰难梭菌的治疗难度加大。因此,探讨艰难梭菌毒素功能区的免疫原性,研制高效疫苗是进行艰难梭菌相关性疾病治疗及预防的关键。本文从艰难梭菌两种主要毒素tcdA和tcdB的基本性质、致病性和功能区免疫机制入手,综合阐述了几类特效疫苗的原理及应用。     

A型肉毒毒素基因的克隆及序列分析

目的:克隆肉毒梭菌(Clostridium botulinum)A型肉毒毒素(BoNTa)编码基因。方法:提取肉毒梭菌国际标准株(62A)基因组DNA,根据肉毒梭菌BoNTa基因(GenBank登录号M30196)序列设计引物,采用LA-PCR方法,扩增出目的基因片段,与pMD18-T载体连接,通过酶切鉴定、测序分析克隆到的A型肉毒毒素基因序列。结果:该基因片段与Genbank中的BoNTa基因序列(GenBank登录号M30196)一致性为100%,预测氨基酸序列一致性为100%。结论:成功克隆肉毒梭菌的A型肉毒毒素基因序列,为肉毒梭菌的快速检测,以及进一步用基因工程方法生产A型肉毒毒素奠定了基础。     

D型产气荚膜梭菌主要毒素基因的PCR检测

为了研究产气荚膜梭菌主要毒素基因,试验采用生物软件以NCBI上登录的产气荚膜梭菌α毒素、ε毒素作为参考,设计扩增D型产气荚膜梭菌α毒素与ε毒素的特异性引物,预期基因片段大小分别为1 110 bp、888 bp,进行PCR扩增。结果表明:设计的引物可以良好地扩增α毒素基因与ε毒素基因,基因片段大小与预期一致。     

动物源A型产气荚膜梭菌流行情况调查及α毒素基因分析

产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病原菌,在一定条件下可引起多种严重疾病。为了调查不同动物A型产气荚膜梭菌流行情况及α毒素基因同源性,本试验从不同地区共采集病料307份,其中鸡133份(包括肉鸡112份、蛋鸡21份)、鸭65份、犬31份、猪14份、兔子20份、小鼠9份、牛粪便18份、鸵鸟粪便17份。取肠道内容物和粪便进行产气荚膜梭菌分离鉴定和毒素基因分型,并检测cpe、β2毒素基因携带率;从不同地区、不同动物源A型产气荚膜梭菌分离株挑选18株进行α毒素基因扩增,将所得基因序列进行同源性比较。结果显示,307份样品中68份(22.1%)呈产气荚膜梭菌阳性,不同动物源产气荚膜梭菌阳性率介于5.9%～44.4%;68株产气荚膜梭菌分离株α毒素基因阳性率为100%,所有分离株毒素基因分型均为A型,未检测到cpe毒素基因,β2毒素基因总阳性率为63.2%;分离株与NCBI参考菌株α毒素基因相似性介于97.8%～100%。结果表明,不同动物α毒素具有很高的同源性,本调查为研发A型产气荚膜梭菌α毒素通用疫苗提供数据支持。     

携带非典型cpb2基因牛源A型产气荚膜梭菌重组α毒素的免疫保护性研究

为验证重组α毒素对携带非典型cpb2基因的A型产气荚膜梭菌的免疫保护性,本研究应用PCR技术,从某牛场牛源A型产气荚膜梭菌G1分离株中扩增出1 194 bp的α毒素编码基因(cpa)和795 bp的β2毒素编码基因(cpb2)。经BLAST分析显示,G1分离株携带的cpb2基因与14个菌株的非典型cpb2基因的氨基酸序列同源性为95.1%～98.9%,与典型cpb2基因(L77695)的氨基酸序列同源性为61.7%。这表明,G1的cpb2基因为非典型cpb2基因。同时分别将cpa和cpb2基因扩增产物克隆于原核表达载体中,构建重组表达质粒pET-a和pET-b2,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,将其纯化后单独及联合免疫小鼠进行免疫保护试验。结果显示,单独免疫重组α毒素蛋白组以及联合免疫重组β2毒素蛋白组的小鼠,均可以抵抗至少6倍最小致死量(MLD)的G1外毒素(包含α毒素和非典型β2毒素)的攻击,也可以完全抵抗至少6 MLD的G2外毒素(不包含β2毒素)的攻击。表明,重组α毒素蛋白对含有及不含有非典型β2毒素的A型产气荚膜梭菌均具有良好的免疫保护作用。     

腐败梭菌α毒素基因的克隆与序列分析

应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从腐败梭菌强毒株C55-1中,扩增出大小为1327bp的腐败梭菌α毒素全基因(csa1327基因),并将其克隆入pMD18-T载体中.转化至受体菌DH5α后,经Amp/IPTG/X-Gal选择培养,提取质粒,PCR和EcoRⅠ/PstⅠ双酶切鉴定,筛选阳性重组克隆.核苷酸序列分析证实,csa1327基因开放阅读框架由1320bp组成,编码440个氨基酸残基.与GenBank中登录的国外Fukushima 5株、Kagoshima 1株、Mie株和44株的α毒素全基因相比,核苷酸同源率分别为100%、99.47%、99.25%和97.67%,推导氨基酸的同源率分别达100%、100%、99.7%和97.06%.表明本实验所克隆的csa1327基因即为腐败梭菌α毒素基因.     

气肿疽梭菌CctA全长基因的克隆及生物信息学分析

为了解气肿疽梭菌(Clostridium chauvoei)细胞毒素CctA的生物学功能,参照GenBank中ATCC 10092株序列设计特异性引物,试验采用PCR技术扩增获得CctA基因。通过生物信息学分析软件DNAStar、EXPASY、Signal P、NetPhos Server V.3.1等程序,对CctA基因进行序列分析,并对其编码蛋白质的结构和功能进行预测。结果表明:CctA基因编码317个氨基酸;CctA基因编码蛋白质是一种偏酸性、稳定、亲水性蛋白,无跨膜区域,但存在信号肽,含有4个N-糖基化位点,1个O-糖基化位点,以及多个磷酸化位点,其中二级结构为混合型,无规卷曲最多,有22个优势的B细胞抗原表位。说明CctA基因是气肿疽梭菌的重要毒力因子,为预防黑腿病疫苗的候选抗原,本试验成功克隆CctA基因,并分析了其编码蛋白的特性,为进一步研究气肿疽梭菌CctA基因功能及其重组蛋白提供参考。     

产气荚膜梭菌α毒素C末端的二拷贝串联表达与免疫原性分析

本研究旨在获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)C末端(第247-370位氨基酸,CPA_C)二拷贝串联融合蛋白,并评价其免疫原性。对已知的A型产气荚膜梭菌CPA_C编码基因进行优化设计,将其以同向串连的方式串联成二拷贝基因(GCPA_(C2)),经人工合成获得基因片段GCPA_(C2)。将GCPA_(C2)克隆至原核表达载体pET-30a (+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rCPA_(C2)。利用Western Blot方法检测rCPA_(C2)与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,用rCPA_(C2)免疫家兔,并检测一免及二免后兔血清的中和抗体效价。在二免21 d后,经耳缘静脉注射1个家兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素,检测rCPA_(C2)对家兔的免疫保护效果。结果表明,rCPA_(C2)主要以包涵体的形式表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免和二免抗血清分别可中和30个和80个小鼠MLD的A型产气荚膜梭菌毒素。1个兔MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,rCPA_(C2)具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。     

CTB-CPA融合基因构建、表达及其产物的免疫原性

构建成含有编码霍乱毒素B亚单位 (CTB)和产气荚膜梭菌α毒素 (CPA)第 70～ 370位氨基酸的融合基因CTB CPA ,并在大肠杆菌中获得表达。经限制性内切酶鉴定和核苷酸序列分析表明 ,CPA基因在重组质粒中与CTB基因的连接向位是正确的 ,位于CTB基因的下游并与CTB基因处于同一阅读框架。重组菌株BL2 1(DE3) (pECTB CPA)经IPTG诱导后 ,其表达产物经SDS PAGE和Western blot检测表明 ,重组菌株可以表达CTB CPA融合蛋白。表达的产物以包涵体的形式存在 ,可分别被抗CT和A型产气荚膜梭菌抗毒素识别 ,表达量占菌体总蛋白的 2 2 7%。用表达产物免疫小鼠后 ,所产生的对A型产气荚膜梭菌毒素攻击的免疫保护力高于用单独的A型产气荚膜梭菌类毒素免疫的小鼠所产生的免疫力 ,证明所表达的融合蛋白中CTB起到免疫佐剂的作用 ,增强CPA的免疫原性     

产气荚膜梭菌α毒素研究进展

α毒素是产气荚膜梭菌的主要毒素和致病因子之一。本文综述了产气荚膜梭菌α毒素的检测，基因的克隆，表达和调控以及毒素的结构与功能等方面的研究进展。     

产气荚膜梭菌α毒素C末端与中和抗原表位的串联表达及免疫保护性分析

为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的C末端(CPAC)与中和抗原表位NE(ARGFAK)的串联融合蛋白并评价其免疫原性,对已知的A型产气荚膜梭菌CPAC及NE的编码基因进行优化设计,并将两个基因的三拷贝序列串联,经人工合成获得基因片段GCPAC3NE3。将该片段克隆至原核表达载体p ET30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白。利用Western blot方法检测重组蛋白与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清的反应性。随后,以纯化的重组蛋白免疫家兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。在二免后21 d,以1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素对家兔进行攻毒。结果表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在表达且能与A型产气荚膜梭菌毒素抗血清反应。每毫升的一免抗血清可中和40个最小致死量(MLD)、二免抗血清可中和80个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到了100%(4/4)的保护。以上结果说明,重组蛋白具有良好的免疫原性,从而为A型产气荚膜梭菌病基因工程疫苗的研制提供了重要的实验数据。     

A型产气荚膜梭菌中国标准株α毒素基因的克隆与序列分析

应用聚合酶链式反应(PCR)技术,从 A 型产气荚膜梭菌中国标准株C57-1中,扩增出大小约1.2 kb的A 型产气荚膜梭菌α毒素全基因(cpa1254基因),并将其克隆入pMD18-T载体中.转化至受体菌DH5α后,经Amp/IPTG/X-Gal 选择培养,提取质粒,PCR和EcoRⅠ/PstⅠ双酶切鉴定,筛选阳性重组克隆.核苷酸序列分析证实,cpa1254基因阅读开放框架由1 194 bp组成,编码398个氨基酸残基.经GenBank数据库的BLAST检索比对分析,cpa1254基因序列与国外文献报道者同源性达99%,表明本实验所克隆的cpa1254基因即为A型产气荚膜梭菌α毒素基因.     

腐败梭菌无毒重组α毒素的表达与免疫保护性分析

本研究旨在获得腐败梭菌无毒重组α毒素,并评价其免疫保护性。对已知的腐败梭菌α毒素编码基因进行优化设计和人工合成,获得了缺少第212-222位共11个氨基酸编码序列的基因片段（GCSA_Δ11）。将该基因克隆至原核表达载体pET-30a（+）中进行表达与纯化。利用Western blot方法检测获得的重组α毒素（rCSA_Δ11）与腐败梭菌天然毒素抗血清的反应性,并采用小鼠检测其毒力。随后,以rCSA_Δ11制备疫苗免疫家兔,按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测家兔血清的中和抗体效价。结果表明,rCSA_Δ11可溶表达比例可达46%,且能与腐败梭菌天然毒素抗血清反应。进一步的试验结果显示,rCSA_Δ11丧失了对小鼠的毒力,0.1 mL的一免兔血清可中和8~12个小鼠最小致死量（MLD）的腐败梭菌天然毒素;二免兔血清可中和32~45个小鼠MLD的腐败梭菌天然毒素。1个家兔MLD的腐败梭菌天然毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100%（4/4）的保护。综上表明,无毒性的rCSA_Δ11保留了良好的免疫保护性,从而为腐败梭菌病基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的试验数据。     

1株青海牦牛腹泻产气荚膜梭菌基因分型及cpa基因生物信息学分析

为了解1株从青海玉树地区牦牛腹泻中分离的牦牛源产气荚膜梭菌Qinghai-1的分子型和cpa基因编码蛋白的生物信息，首先利用16S rDNA扩增、毒素基因检测、MLST分型、基因克隆等分子生物学方法对菌株毒素基因和管家基因进行分析，随后通过对cpa基因双向高通量测序、生物软件分析等生物信息学方法对其编码的α毒素蛋白的一级结构、二级结构、三级结构、蛋白特殊区域、B细胞线性抗原表位及蛋白互作关系进行分析。结果显示，Qinghai-1菌株分型毒素仅含有α毒素，各管家基因的等位基因序号依次为colA:9、groEL:96、sodA:91、plc:44、gyrB:67、sigK:55、pgk:8、nadA:16;cpa基因全长1 197 bp,共编码398个氨基酸，与丹麦鸡源(EU839784.1)分离株plc基因差异性较小；其编码的α毒素蛋白分子式为C₂₀₃₆H₃₀₆₁N₅₃₃O₆₃₁S₁₂,相对分子质量为45.5 ku, pI=5.68,脂肪指数：61.36,不稳定指数：19.88,...     

产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体的免疫保护力评价

旨在获得产气荚膜梭菌ε毒素的重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。对已知的D型产气荚膜梭菌ε毒素编码基因进行了优化设计和人工合成,同时引入3个氨基酸点突变:第30和196位酪氨酸突变为丙氨酸,第106位组氨酸突变为脯氨酸。将该基因片段克隆至原核表达载体pET30a-(+)中进行表达,并纯化。利用Western blot方法检测纯化蛋白质与D型产气荚膜梭菌ε毒素抗血清的反应性,并检测其对小鼠的毒力。随后,以纯化的重组蛋白质免疫兔,根据《中华人民共和国兽药典》(2015年版)规定的方法检测兔血清的中和抗体效价。结果表明,ε毒素的重组突变体为可溶性表达,通过灰度扫描,其表达量比例可达40%;该蛋白质能与D型产气荚膜梭菌ε毒素抗血清反应,小鼠安全试验显示,6.25×106 ng·kg-1的蛋白质仍无毒力;免疫兔血清对D型产气荚膜梭菌ε毒素的中和效价在一免后可达50~60最小致死量(MLD),二免后可达400~450 MLD;用1个MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组4/4死亡,免疫组得到保护。由此表明,产气荚膜梭菌重组ε毒素突变体无毒力且保留了良好的免疫原性,为D型产气荚膜梭菌病新型疫苗的研制提供了重要的实验数据。     

关中奶山羊源D型产气荚膜梭菌全基因组序列测定及其分子特征分析

本研究自陕西省富平县某规模化关中奶山羊养殖场腹泻奶山羊肛门拭子中分离到5株产气荚膜梭菌,命名为21-D-1~21-D-5。毒素基因检测表明,其均为携带etx的D型产气荚膜梭菌,且21-D-5携带食源性致病毒素基因cpe。全基因组序列测定显示,5株D型产气荚膜梭菌基因组大小、GC含量和基因数量稳定;单核苷酸多态性（SNPs）分析显示,21-D-1和21-D-2以及21-D-3和21-D-4之间的SNPs差异极低（<25）,表明其大概率属于相同的产气荚膜梭菌菌株。分离的D型产气荚膜梭菌基因组中共检测到15种毒素基因,其中,毒素基因etx在分离的D型菌株中高度保守、基因环境相似,且在菌株21-D-5中毒素基因cpe位于etx下游。此外,包括噁唑烷酮类耐药基因optrA在内的9种耐药基因也在分离株中被检测到,并且erm（A）、optrA和fexA具有共同传播的可能性。本研究为国内首次对D型产气荚膜梭菌进行全基因组序列测定分析,结果对产气荚膜梭菌疾病的防治和基因组的进一步研究具有参考价值。     

犬产气荚膜梭菌的分离和PCR检测方法的建立

从12头疑似产气荚膜梭菌感染的猝死警犬中分离获得了18株病原菌，经生化试验及毒素中和试验，确定为A型和C型产气荚膜梭菌。参考GenBank中登录的基因序列，设计合成了针对产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、CPE和β2共6对分型毒素基因的引物，对以前昆明地区分离的1株产气荚膜梭菌进行了PCR扩增，结果扩增出了与预期大小相同的6个基因片段，分别为233、196、324、446、567和665 bp。建立的PCR方法能同时用于产气荚膜梭菌鉴定和毒素分型，较细菌毒素检测方法快速，与细菌分离鉴定的结果一致。