桃金娘鞣质抗猪流行性腹泻病毒作用研究

为测试桃金娘鞣质对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的影响,体外试验以PEDV感染PK细胞为模型,采用细胞病变(CPE)效应法、MTT比色法检测细胞存活率,测定桃金娘鞣质抑制PEDV增殖的半数有效浓度(EC_(50))和治疗指数(TI),同时设利巴韦林对照组;体内试验以PEDV感染昆明种小鼠为模型,60只昆明种小鼠随机均分为6组,设桃金娘鞣质高剂量组、中剂量组、低剂量组、利巴韦林对照组、病毒对照组、健康对照组,采用实时荧光定量PCR法检测肠系膜淋巴结PEDV含量,观察桃金娘鞣质抗PEDV增殖能力。结果显示,桃金娘鞣质能明显抑制PEDV引起的细胞病变,半数有效浓度为0.021 mg/mL,不如利巴韦林0.0098 mg/mL(P0.05);治疗指数为361.9,优于利巴韦林214.28(P0.05);桃金娘鞣质能影响PEDV在小鼠体内的增殖数量,并呈现一定量效关系;桃金娘鞣质各剂量组小鼠肠系膜淋巴结PEDV含量均低于病毒对照组(P0.05),高、中剂量组小鼠肠系膜淋巴结PEDV含量均低于利巴韦林对照组(P0.05),小鼠肠系膜淋巴结PEDV含量在桃金娘鞣质高、中、低剂量组间也存在显著差异(P0.05)。试验表明,桃金娘鞣质具有体外、体内抗PEDV药理活性,有进一步开发抗病毒药物的价值。     

牛蒡苷元对猪圆环病毒2型感染仔猪体内病毒复制及组织病理影响

为了评价中药活性成分牛蒡苷元(arctigenin,ACT)对猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)人工感染仔猪体内病毒的复制及组织病变的影响,选取16头30日龄健康断奶仔猪,随机分为空白对照组、攻毒对照组、给药组1(20μg·kg~(-1))和给药组2(50μg·kg~(-1))。两个给药组连续肌内注射给药3 d(空白和攻毒对照组注射生理盐水)后进行攻毒,在攻毒前2 d和攻毒后0、7、14、21 d分别采集仔猪外周血进行PCV2定量检测;攻毒后21 d将试验仔猪全部剖杀,采集腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、扁桃体、肺和脾组织进行PCV2定量检测和组织病理学观察。结果显示,两个给药组均能显著降低攻毒后7、14和21 d仔猪外周血病毒核酸拷贝数(P 0. 05或P 0. 01);攻毒后21 d,给药组1(20μg·kg~(-1))能显著抑制腹股沟淋巴结(P 0. 05)、肠系膜淋巴结(P 0. 05)组织中PCV2的增殖,给药组2(50μg·kg~(-1))能显著抑制腹股沟淋巴结(P 0. 001)、肠系膜淋巴结(P 0. 01)、扁桃体(P 0. 05)和肺(P 0. 05)组织中PCV2的增殖;并且两个剂量均能减轻PCV2感染造成的上述器官组织的病理损伤。ACT对PCV2在人工感染仔猪体内的增殖有明显的抑制效果,并能减轻由PCV2感染引起的病理变化。     

猪细小病毒分离株感染初孕母猪的病毒组织分布和病理学观察

本研究旨在研究猪细小病毒分离株感染初孕母猪后母猪和胎猪的病毒组织分布和组织病理学变化情况。试验选用妊娠35d的初孕母猪接种PPV—BQ株第15代细胞毒,以接种RPMI1640的母猪作为对照。攻毒40d后剖杀,采集母猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、子宫内膜和腹部淋巴结,胎猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和小肠,进行组织病毒载量测定和组织病理学检测。实时定量PCR检测结果显示,攻毒组母猪的心脏、脾脏、肺脏、肾脏和子宫内膜存在病毒复制,子宫内病毒含量最高;胎猪的心脏、脾脏、肺脏中存在病毒复制。对照组脏器中无病毒复制。病理切片结果显示,攻毒组母猪肺脏出现细支气管性肺炎,脾脏出现淋巴细胞减少,心脏、肝脏、肾脏、扁桃体、子宫内膜和腹部淋巴结未见明显的组织病理学变化;胎猪的脏器未见明显的病理损伤。对照组未发现组织病理学变化。     

猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立敏感、特异的评价猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗中病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法,参照中国猪瘟石门株兔化弱毒全长序列,在猪瘟兔化弱毒活疫苗基因组5'非编码区设计1对标准品引物、1对特异性引物和1条探针,建立检测猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法.该方法检测的敏感度达1.20×10⁵拷贝/mL;对猪繁殖与呼吸综合征、猪乙型脑炎、仔猪副伤寒和猪伪狂犬病4种活疫苗基因组扩增结果均为阴性;重复性试验结果显示,批内变异系数为0.29%～0.39%,批间变异系数为0.32%～0.61%.应用此方法对6个不同厂家生产的7种猪瘟兔化弱毒活疫苗中病毒含量进行了检测,发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量存在较大差异.结果表明,建立的猪瘟兔化弱毒疫苗实时荧光定量RT-PCR方法能特异地检测疫苗病毒含量,可用于初步评价猪瘟兔化弱毒疫苗抗原含量.     

IBRV在MDBK细胞中的增殖规律研究

为了探讨牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)在MDBK细胞上的增殖规律,试验用100 TCID_(50)剂量的IBRV接种MDBK细胞,在不同时间点用倒置显微镜观察细胞病变效应(CPE),同时用TaqMan荧光定量PCR技术对病毒DNA含量进行检测,绘制病毒增殖曲线。结果表明:病毒6~12 h增殖缓慢,24~72 h增殖快,72~144 h增殖不明显;48小时时细胞出现病变,120小时时单层细胞基本脱落。说明IBRV可以在MDBK细胞中增殖并引起细胞病变,而且CPE情况与病毒的增殖规律相吻合。     

猪痘病毒江西株(SWPV-JX01株)的分离鉴定

本试验利用PK15细胞从江西省某猪场疑似猪痘的保育猪皮肤痘痂中分离到1株病毒,该分离毒株在PK15单层细胞上能连续盲传培养,不产生明显的细胞病变,通过PCR扩增猪痘病毒P35基因,扩增序列与猪痘病毒参考株(AF410153.1)P35基因的核苷酸同源性为97.9%,表明该分离病毒为猪痘病毒,并命名为SWPV-JX01。将SWPV-JX01株F5代细胞培养液经肌肉和皮下注射感染兔和小鼠,人工感染80 h后,通过PCR检测不同组织的猪痘病毒P35基因,从兔的肾脏、脾脏、皮肤、心肌、淋巴结均能扩增到P35基因,且扩增序列与SWPV-JX01株同源性为100%。试验结果表明,SWPV-JX01株能在兔体内增殖,但不能在昆明鼠体内增殖。     

猪痘病毒江西株(SWPV-JXO1株)的分离鉴定

本试验利用PK15细胞从江西省某猪场疑似猪痘的保育猪皮肤痘痂中分离到1株病毒,该分离毒株在PK15单层细胞上能连续盲传培养,不产生明显的细胞病变,通过PCR扩增猪痘病毒P35基因,扩增序列与猪痘病毒参考株(AF410153.1)P35基因的核苷酸同源性为97.9％,表明该分离病毒为猪痘病毒,并命名为SWPV-JX01.将SWPV-JX01株F5代细胞培养液经肌肉和皮下注射感染兔和小鼠,人工感染80 h后,通过PCR检测不同组织的猪痘病毒P35基因,从兔的肾脏、脾脏、皮肤、心肌、淋巴结均能扩增到P35基因,且扩增序列与SWPV-JX01株同源性为100％.试验结果表明,SWPV-JX01株能在兔体内增殖,但不能在昆明鼠体内增殖.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4-F112株在Marc-145细胞上最佳增殖条件的研究

为了在Marc-145细胞上获得更高滴度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HuN4-F112株,优化了细胞培养条件、病毒接种剂量、收毒时间和病毒液冻融次数等条件。结果证明Marc-145细胞在MEM培养基、新生牛血清含量8%、细胞接毒密度1.5×105个/mL、pH7.1条件下生长状态最好;PRRSV HuN4-F112株的最佳接种剂量为3.0×105 TCID50/mL,收毒时间为接种后70～72小时,在-18℃冻融3次,PRRSV HuN4-F112株增殖效果最好。该结果为HuN4-F112株PRRSV疫苗的生产提供了依据。     

中药制剂对禽流感病毒H9N2、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和鸡毒支原体的攻毒保护试验

采用以野菊花、穿心莲、柴胡等10味中药提取的中药制剂,连续给22日龄SPF鸡口服5 d后,以禽流感病毒H9N2、新城疫病毒F4、传染性支气管炎病毒强毒株M41和支原体S6强毒分别攻击,观察SPF鸡临床症状、发病率、病理学变化和分离病毒。结果表明,此中药制剂75 mg/只口服组,新城疫病毒、禽流感病毒和传染性支气管炎病毒攻击后发病率分别为12.5%,0%,10%;37.5 mg/只剂量口服组发病率分别为50%,10%,10%,且低剂量组病毒分离阳性。攻击支原体后,以上两个剂量组SPF鸡病变指数分别3.5和5.5,研究证实本中药制剂可以控制以上4种病原所致的家禽呼吸道病的发生。     

肾型传染性支气管炎病毒对鸡嘌呤代谢的影响研究

用T株肾型传染性支气管炎病毒(IBV)人工感染14日龄非免疫土种鸡建立感染模型,于攻毒前、攻毒后48 h、72 h、96 h、120 h 采集血样,测定血浆黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD)活性,探索鸡嘌呤代谢变化与肾型IBV致病机理之间的关系.结果表明,与攻毒前相比较, 攻毒后48 h和72 h血浆XOD活性明显增强, 差异显著(P<0.01,P<0.05).结果提示,XOD活性升高引起的嘌呤代谢紊乱可能是鸡肾型IB的病理机制之一.     

中药复方连翘对感染法氏囊病毒雏鸡免疫功能的影响

160只7日龄健康岭南黄鸡随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组,每组40只,Ⅰ为正常对照组、Ⅱ为感染病毒组、Ⅲ为中药复方治疗组、Ⅳ为中药复方制剂组,Ⅱ、Ⅲ组均于8日龄感染传染性法氏囊病毒（IBDV）,Ⅲ、Ⅳ以20g&#183;kg^-1单剂量灌服中药复方连翘汤。分别于试验后第7、14、21、28日龄采外周血及免疫器官法氏囊和脾脏,测定血细胞的吞噬能力、外周血T淋巴细胞的百分率和T淋巴细胞的转化率,流式细胞仪测定鸡外周血和脾T淋巴细胞亚群CD3^＋、CD4^＋和CD8^＋T细胞的含量;放血致死称体质量、脾和法氏囊质量,计算免疫器官指数。在感染IBDV7d后取脾脏和法氏囊组织,制备组织样品进行组织学及透视电镜观察。结果表明：中药复方连翘制剂可使雏鸡外周血细胞的吞噬能力、T淋巴细胞的百分率和T淋巴细胞的转化率、法氏囊和脾脏的质量明显提高,对感染IBDV后免疫器官法氏囊和脾脏有明显的改善和恢复作用,提高外周血和脾淋巴细胞中CD3^＋、CD4^＋和CD8^＋T细胞百分率,改变CD4^＋／CD8^＋比值促进对机体免疫系统的调控。感染病毒组的上述指标显著下降,中药复方连翘治疗组与感染病毒组相比能显著提高上述指标。     

PRRSV NVDC-JXA1株在Marc-145细胞上增殖条件的优化

为了在Marc-145细胞上获得更高滴度的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)NVDC-JXA1株,优化了细胞培养条件、病毒接种剂量、病毒吸附时间、收毒时间和病毒冻融次数等条件。结果表明Marc-145细胞在MEM培养基、新生牛血清含量80 mL/L,细胞接种密度150 000个/mL,pH7.0条件下生长状态最好;PRRSV NVDC-JXA1株的最佳接种剂量为400 TCID50/mL,病毒吸附时间为30 min,收毒时间为接种后72 h,在-20℃冻融3次,PRRSV NVDC-JXA1株增殖效果最好。该结果为NVDC-JXA1株PRRSV疫苗的生产提供了依据。     

鸡传染性法氏囊病病毒BJQ902株在DF-1细胞系上增殖工艺研究

试验旨在通过DF-1细胞增殖获得高效价的鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）抗原。通过病毒接种量、收毒时间、接毒时间、温度和维持液血清浓度5个培养条件的筛选和优化,对IBDV BJQ902株在DF-1细胞上的增殖工艺进行了研究。结果表明,IBDV BJQ902株在DF-1细胞上最佳增殖条件为：在37℃条件下培养,接毒量在0.01%~0.1%之间,接种时间为细胞传代后生长48~72 h,维持液血清浓度为1%~2%,收毒时间为病毒接种后60~72 h。在此培养条件下增殖病毒毒价在10^8.3~10^8.7 TCID₅₀/0.1 mL之间。     

复方金银花对雏鸡法氏囊强毒抑制效果观察试验

本试验将240只海兰褐雏鸡随机分为8组,每组30只,分别为金银花复方制剂高剂量组、中剂量组、低剂量组、中药对照组、西药对照组、疫苗对照组、阴性对照组、健康对照组。将试验鸡人工感染法氏囊病毒(IBDV)强毒,观察药物对雏鸡保护效果。结果表明:金银花复方制剂可以减弱IBDV强毒对雏鸡免疫器官的损害,对法氏囊强毒感染雏鸡具有明显的保护作用。     

中药抗牛病毒性腹泻病毒研究进展

国内尚无用于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的特异性治疗药物,研制抗BVDV的治疗药物已成为当下兽医科研工作者的研究重点之一。研究证实,中药单体或复方可通过降低BVDV所致的细胞病变、抑制细胞内病毒增殖和调节机体细胞免疫等途径实现抗病毒作用,但缺乏关于中药抗病毒的作用靶点及分子作用机制的深入研究。综述单味中药及中药复方抗BVDV的研究概况,以期为创新研制高效的抗BVDV药物提供参考。     

RT-PCR法快速检测与鉴别诊断猪瘟病毒野毒株和三个兔化弱毒疫苗株的研究

基于猪瘟病毒基因组中富含T的插入序列建立起的简捷一步法RT-PCR技术,用于同步检测与鉴别野毒株和疫苗株。依据猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株3′NTR独立存在富含T的插入序列,设计特异性的扩增引物,使用简捷一步法RT-PCR或巢式PCR之后用琼脂糖凝胶电泳或多毛细管电泳方法进行分析,能检测到并且准确鉴别在临床标本中的古典猪瘟病毒野毒株和兔化猪瘟疫苗株。这些检测技术至少可用于3个兔化弱毒疫苗株LPC、HCLV和C-株的检测。野毒株RT-PCR检测限量是6.3TCID50/mL,巢式PCR检测限量是0.63TCID50/mL。在前一次研究中,在猪瘟兔化弱毒疫苗株的基因组的3′NTR发现有12～13nt的富含T的插入序列;本次研究中,在LPC/PRK和LPC/TS兔化疫苗株的基因组中发现2个长为42和36nt富含T的插入序列。这些长为12、36、42nt富含T的插入序列增加PCR片段的大小,有利于遗传标记对猪瘟病毒野毒型和不同兔化疫苗株间的快速检测和鉴别。     

猪瘟兔化弱毒疫苗株TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速鉴定猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的方法,本研究根据GenBank中登录的HCLV株基因组序列,在Erns基因序列区内设计一对引物和一条TaqMan探针,建立了检测HCLV的荧光定量RT-PCR(FQRT-PCR)方法。该方法检测的灵敏度可达3.84拷贝/μL;而对猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、牛病毒性腹泻病毒基因组扩增结果均为阴性。实验组批内变异系数为1.05%～1.84%,批间变异系数为3.70%～5.43%。通过对32批HCLV半成品抗原和9批成品疫苗,分别用经典的兔检法测定兔体感染量(RID)和新建立的FQRT-PCR方法进行检测比较,两者有较好的相关性。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异性强、稳定性好等优点,对HCLV生产配制及成品检验具有指导作用。     

荧光定量PCR方法检测IBV病毒在CEK细胞中的动态变化

为揭示鸡传染性支气管炎病毒（IBV）在鸡胚肾细胞（CEK）中复制增殖的动态变化规律,通过实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测IBV病毒感染CEK3、6、12、24、36、48、72h后病毒增殖量的动态变化。结果显示,随着时间增加,IBV病毒增殖出现规律性变化,3～12h时IBV增殖不明显,36h时IBV开始大量复制,48h时达到高峰,但72h后有所下降。试验表明IBV在细胞内复制增殖的最佳时间在接毒后48h,其复制增殖情况与细胞状态负相关。     

我国猪瘟病毒基因流行变异研究

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种高度接触性和致死性病毒性传染病,该病流行广泛,发病率和死亡率较高,是危害我国乃至世界养猪业的主要疫病之一。我国猪瘟病毒流行毒株主要分为猪瘟病毒基因Ⅰ群和基因Ⅱ群,且以基因Ⅱ群为主,尚未发现基因Ⅲ群。基于E2基因序列分析表明,我国猪瘟病毒的流行毒株正在向远离猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV株)方向变异;E0基因序列分析表明,流行株与疫苗株相比虽然发生了一定程度的变异,但是在RNase活性关键位点高度保守,未出现变异。     

鸽新城疫病毒在鸡胚上的增殖动态

采用红细胞凝集试验（HA），通过对鸽新城疫病毒（NDV）在鸡胚上增殖动态的研究表明，ND－gs01病毒经尿囊腔接种9－10日龄鸡胚、24h内病毒处于“掩蔽期”，24h后开始增殖，72h左右鸡胚死亡。新城疫病毒在尿囊膜、羊膜、尿囊液、羊水中含量较高，增殖动态趋于一致。卵黄、胚体中含量较低。上述结果，为该病毒的进一步研究和应用提供了科学依据。