番鸭破骨细胞的培养及鉴定

分离7日龄内番鸭长骨破骨细胞（osteoclast,OC）,倒置显微镜观察其活体形态。培养1、3、5、7d进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）,培养7d后进行骨吸收陷窝定量分析,观察番鸭OC数量、体外生存时间以及骨吸收功能。结果显示,倒置显微镜下观察,OC为多核巨细胞,有伪足并借助伪足的凹凸伸缩而改变形态、运动行走。玻片上OCTRAP染色阳性,培养7d的象牙片上产生明显吸收陷窝。直接分离OC的数量随培养时间延长而减少,单核细胞融合而成的OC数量随培养时间延长而增加;分离培养的鸭OC具有骨吸收活性,TRAP染色阳性。     

不同钙磷比例对体外培养番鸭破骨细胞生成及骨吸收功能的影响

从1～7日龄番鸭长骨骨髓分离破骨细胞（Osteoclasts，OC）进行培养，培养过程中添加不同摩尔浓度比例的钙磷双因子（CCa：Cp为2：1、1：1、1：2）。倒置显微镜观察细胞形态，于培养第1、3天进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP），培养7d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝，研究不同钙磷比例对番鸭OC生成及骨吸收功能的影响。结果显示，培养第3天时试验组TRAP阳性细胞多于对照组，差异极显著（P〈0．01）。试验组中除CCa：Cp=1：1组与CCa：Cp=2：1组之间无显著差异外（P〉0．05），其余各组间差异均极显著（P〈0．01）。扫描电镜观察，象牙片吸收陷窝程度与钙磷比例大小（CCA：Cp为2：1、1：1、1：2）成反比。证实合适比例的钙、磷（CCa：CP=2：1）通过抑制OC生成和活化，抑制OC的骨吸收活性。     

番鸭破骨细胞骨髓诱导培养体系的建立

无菌分离、冲洗7日龄内番鸭长骨骨髓,收集、培养破骨细胞（Osteoclasts,OC）。培养过程中对照组不添加钙、磷因子,试验组加入不同浓度比例的钙磷双因子（Ca∶P分别为2∶1、1∶1、1∶2）,进行破骨细胞骨髓诱导培养。倒置显微镜观察细胞形态,于培养1、3d进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（TRAP）计数,培养7d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝。结果显示,培养3d时试验组TRAP阳性细胞均多于对照组,差异极显著（P〈0.01）;试验2∶1组与1∶1组差异不显著（P〉0.05）,其余各组间均差异极显著（P〈0.01）;扫描电镜观察,象牙片吸收陷窝程度与钙磷比例大小（2∶1、1∶1、1∶2）成反比。当钙磷比例为1∶2时,破骨细胞数量最多,功能活跃。结果表明,鸭破骨细胞骨髓诱导培养体系已成功建立。     

鸭胚与小鼠的破骨细胞特性比较

本文分别采集鸭胚与小鼠的破骨细胞(osteoclast,OC),通过检测TRAP阳性细胞数及骨吸收陷窝面积,比较鸭胚与小鼠的OC形态、数目及活性。结果表明,鸭胚OC形状不规则、体积较大、核多且主要分布于胞质,而小鼠OC形状较规则、体积小、核多且大多分布于细胞边缘;随机选取视野中,鸭胚与小鼠OC数差异不显著;而鸭胚OC骨吸收陷窝面积显著大于小鼠OC骨吸收陷窝面积(P0.05)。表明鸭胚与小鼠OC均具有OC的普遍特征,但两者在骨吸收活性方面存在差异。     

骨保护素对破骨细胞活性的影响

旨在探讨骨保护素(osteoprotegerin,OPG)对破骨细胞(osteoclast,OC)活性的影响.采用小鼠原代OC模型,在体外培养的基础上添加不同浓度OPG,通过TRAP阳性细胞计数、细胞骨架F-actin染色、骨吸收功能检测等手段,观察OPG对体外培养OC的作用.结果发现,OPG能够直接作用于OC,减少其数量,破坏其F-actin环,减弱其骨吸收活性,且随OPG浓度的增加,对OC的影响更加明显.结果表明,OPG能够减少OC数量并抑制其骨吸收活性,呈现剂量效应.     

鸡破骨细胞分离和培养方法的改进

为获得大量有活力的鸡破骨细胞(Osteoclast,OC),本试验选取18日龄鸡胚,从长骨中提取骨髓细胞,用胰酶消化,40%和70%的percoll梯度离心分离骨髓间质细胞。在此基础上,用60 ng/mL核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、50 ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)诱导培养。采用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、骨吸收陷窝以及标志性蛋白TRAP、基质金属蛋白酶9(MMP-9)、组织蛋白酶K检测鉴定破骨细胞。结果显示,诱导后的TRAP阳性细胞剧增,TRAP、MMP-9和组织蛋白酶K蛋白表达极显著上调,可在牛骨上形成大量的骨吸收陷窝。研究表明,该方法是一种快速、实用、高效的鸡破骨细胞分离培养技术。     

磷对体外培养番鸭破骨细胞生成及骨吸收功能的影响

本试验旨在观察磷对体外培养番鸭破骨细胞(OC)生存、生成以及骨吸收功能的影响.分离1日龄番鸭长骨骨髓细胞,培养过程中分别加入不同比例的NaH2PO4、10-8 mol/L 1,25-(OH)2D3二因子、不同浓度的NaH2PO4单因子.倒置显微镜观察细胞形态,更换含磷培养液后6 h、12 h、18 h、24 h、30 h和7 d进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP),分别进行OC计数、形态观察;培养30 h内吖啶橙染色,观察OC凋亡情况,7 d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝情况.结果表明:在同一时间点,添加磷培养液均能抑制1,25-(OH)2D3诱导产生OC,并抑制OC的骨吸收活性,抑制程度与磷浓度成正比,3、5和7 mmol/L组OC数量均极显著少于对照组(P＜0.01);5 mmol/L组OC数量极显著少于3 mmol/L组(P＜0.01);5 mmol/L组与7 mmol/L组差异不显著;更换含磷液培养12、18、24和30 h,均可见磷含量达3 mmol/L时OC数量均极显著少于对照组(P＜0.01),磷浓度相同组,OC数量随着培养时间的延长而减少.添加磷培养液能够抑制体外诱导培养OC的生成及骨吸收活性,抑制体外培养成熟OC的生存.     

骨保护素和核因子κB受体活化因子配基对体外培养鸭破骨细胞的影响

探讨了核因子κB受体活化因子配基(Receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)和不同浓度骨保护素(Os-teoprotegerin,OPG)对鸭破骨细胞(Osteoclasts,OC)生成和活化的影响.从7日龄内番鸭长骨骨髓分离破骨细胞,添加1,25-(OH)2D3进行诱导培养15 h后,更换含不同细胞因子的培养液(对照组:不加细胞因子;30 μg/LsRANKL组;30 μg/L sRANKL+10 μg/L OPG组;10μg/L OPG组;50 μg/L OPG组;100 μg/L OPG组),继续培养.倒王显微镜进行OC形态学观察,比较各组培养3 d后抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)阳性OC数量、培养7 d后扫描电镜观察象牙片吸收陷窝.结果表明:50 μg/L OPG组、100μg/L OPG组OC数均极显著少于10 μg/LOPG组(P<0.01);添加OPG组OC数均极显著少于30μg/L sRANKL组(P<0.01),象牙片吸收陷窝随OPG添加浓度的增加而减少,面积减小,陷窝深度变浅.RANKL能够促进OC的生成及活化,而OPG可与RANKL竞争性地结合RANK抑制OC的生成和活化,从而抑制OC的骨吸收.     

维生素D介导鸡BMSCs和BMMs共培养体系中破骨细胞的形成

为探究1α, 25-(OH)_2D_3对鸡骨髓间充质干细胞(BMSCs)和骨髓单核巨噬细胞(BMMs)体外共培养体系中破骨细胞(OC)形成的影响,笔者对1α, 25-(OH)_2D_3处理后的细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)、骨吸收功能鉴定、OC标志基因mRNA和蛋白表达的检测。结果表明:1α, 25-(OH)_2D_3能够上调BMSCs中核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的表达,下调骨保护素(OPG)的表达。1α, 25-(OH)_2D_3处理共培养细胞5 d,OC数目较对照组明显增多,骨吸收活性较对照组极显著增强,基质金属蛋白酶9(MMP-9)、Ⅱ型碳酸酐酶(CAⅡ)、组织蛋白酶K(CtsK)及TRAP等标志性蛋白的mRNA和蛋白表达极显著高于对照组(P0.01),其中10~(-8) mol·L~(-1) 1α, 25-(OH)_2D_3效果最明显。结果表明,10~(-8) mol·L~(-1) 1α, 25-(OH)_2D_3能够介导鸡BMSCs和BMMs共培养体系中OC的形成,该OC具有骨吸收活性,为进一步研究OC在家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病中的作用机制奠定基础。     

鸭破骨细胞的培养及鉴定

健康动物的骨骼处于不断重建的过程,骨重建是旧骨被吸收和新骨形成这一动态平衡过程[1]。20世纪80年代中期,Chambers首先建立了体外破骨细胞的分离培养方法[2],从细胞水平上为骨相关性疾病的研究奠定了基础。已报道的破骨细胞多来源于鼠、兔等实验动物,也有来源于人的组织,但直接从鸭骨髓中分离培养破骨细胞尚未见报道。在规模化养禽生产中,各种因素引起的骨骼疾病造成的经济损失不容忽视[3-4]。因此,建立鸭破骨细胞体外培养体系,将为研究禽类骨营养不良性疾病发生机理提供基础。1材料1.1实验动物7日龄以内番鸭,购自江苏省水禽种质资源基因…     

TNF-α/IL-1α机制对破骨细胞形成和活化的影响

为了探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)/鼠重组白介素-1α(IL-1α)是否能独立于RANKL/RANK/ OPG机制之外直接刺激破骨细胞(OC)的形成和活化.提取4周龄C57雌性小鼠脾细胞,加入鼠巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)TNF-α(±IL-1α)进行体外培养,同时加入骨保护素(OPG)和可溶性NF-κB受体活化子配体(sRANKL)以区别RANKL/RANK/OPG机制.通过OC形态学观察、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、骨吸收陷窝方法鉴定OC的形成和活化水平.结果显示:TNF-α(±IL-1α)能诱导睥细胞融合产生TRAP阳性的多核细胞并在象牙片上产生吸收陷窝,加入OPG不能阻断其诱导破骨细胞形成和产生骨吸收陷窝.结果表明:在MCSF存在的情况下,TNF-α以一种独立于RANKL/RANK/OPG之外的机制诱导破骨细胞的形成和活化,而且IL-1α能显著促进TNF-α的诱导作用(P＜0.05).     

2种方法诱导形成的破骨细胞特性比较

采集ICR小鼠骨髓单核细胞在体外培养过程中加入25.0 μg/L M-CSF+50.0 μg/L RANKL诱导形成破骨细胞,同时选择RAW264.7细胞培养过程中添加100.0 μg/L RANKL诱导分化为破骨细胞.通过检测抗酒石酸碱性磷酸酶(Tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)染色阳性数及骨吸收陷窝,比较小鼠骨髓单核细胞和RAW264.7细胞株诱导形成的破骨细胞活性.结果显示,小鼠骨髓诱导的细胞TRAP阳性数显著低于RAW264.7细胞株(P＜0.05),而小鼠骨髓诱导的破骨细胞所形成骨吸收陷窝的面积显著大于RAW264.7细胞株(P＜0.05).结果表明,2种方法均可诱导形成具有典型特征的破骨细胞,骨髓单核细胞诱导形成的破骨细胞活性更强,但破骨细胞的数量和纯度明显低于RAW264.7细胞株.     

钙对体外培养鸭破骨细胞活性的影响

健康动物的骨骼处于不断重建的过程,骨重建(bone remodeling)是旧骨被吸收和新骨形成这一动态平衡过程[1]。20世纪80年代中期,Chambers等首先建立了体外破骨细胞的分离培养方法[2],从细胞水平上为骨相关性疾病的研究奠定了基础。目前,规模化养禽生产中,各种因素引起的骨骼疾病造成的经济损失不容忽视[3,4,5]。而Ca、P是体内必需的矿物元素,也是体内含量最多的矿物元素。维持血浆中的Ca、P特别是Ca浓度恒定,是预防动物骨代谢性疾病的关键。因此,本文在番鸭OC的培养鉴定基础上加入不同浓度Ca2 ,观察其对OC生成和骨吸收功能的影响,以便为…     

鸭疫巴氏杆菌亚单位成分的提取及免疫原性初步研究

将本室分离鉴定的鸭疫巴氏杆菌（ＰＡ）通过改良马丁肉汤增菌培养后．以较为成熟的提取方法获得其亚单位成分（包括细菌荚膜和外膜蛋白），经无菌、安全性检验和蛋白浓度测定后用于免疫雏鸭，攻菌试验表明ＰＡ亚单位成分具有一定的免疫原性。     

鸡骨髓源树突状细胞体外诱导

为了探讨鸡骨髓源树突状细胞（bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs）的体外诱导培养方法,并分析鸡树突状细胞（DCs）的主要生物学特性,将用淋巴细胞分离液分离的鸡骨髓细胞经差速贴壁纯化后获得单个核细胞,然后经粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4）体外诱导分化,细胞培养后第7天再加入脂多糖（LPS）继续培养48 h刺激成熟,分别于倒置显微镜和电子显微镜下进行形态变化观察,同时应用流式细胞仪对鸡骨髓源树突状细胞表面标志进行分析、鉴定。结果显示鸡骨髓细胞培养7 d后,细胞体积增大,细胞表面长出树突状小突起,细胞表面高表达MHCⅡ和CD11c分子,经LPS刺激后,突起伸长变粗,扫描电镜观察呈典型的树突状细胞形态,细胞表面MHCⅡ表达显著升高,依据上述方法成功获得大量而高纯度的鸡骨髓源树突状细胞,为进一步研究禽类DCs的生物学功能及其在某些疾病发生中的作用奠定了基础。     

滩羊骨髓间充质干细胞分离与培养

利用全骨髓法与差速贴壁法分离和培养滩羊骨髓间充质干细胞（BMSCs），观察细胞形态及成脂诱导分化实验进行鉴定。结果显示原代培养的细胞呈圆形或三角形，24h后大部分细胞均贴壁，7d左右可达80％-90％融合，体外成脂诱导分化获得脂肪样细胞，油红染色为阳性。因此，全骨髓法与差速贴壁法可有效分离培养滩羊的骨髓间充质干细胞，是一种比较理想的分离培养方法。     

破骨细胞分化因子可诱导鸡骨髓细胞形成破骨样细胞

研究了鸡破骨细胞分化因子（Chicken osteoclast differentiation factor，chODF）体外诱导鸡骨髓细胞形成破骨样细胞的能力。在无菌条件下取鸡股骨和胫骨，收集骨髓细胞。试验分设A、B、C、D、E、F、G7组。A组为对照组，不加细胞因子，其他各组为试验组，其中B组仅加chODF，C组只加巨噬细胞集落刺激因子（Macrophage-colony-stimulatingfactor，M-CSF），D、E和F组同时加不同浓度的chODF和M—CSF，G组同时加chODF、M-CSF和鸡护骨素（Chicken osteoprotegerin，chOPG）。通过抗酒石酸盐酸性磷酸酶（Tratrate-resistant acid phosphatase，TRAP）、HE、骨吸收陷窝甲苯胺蓝染色和显微、超微检查，观察和鉴定破骨样细胞（Osteoclastlikecell，OLC）的形成。结果表明，chODF可诱导形成典型的OLC，骨吸收陷窝清晰可见，其陷窝面积大，数量多，且TRAP阳性多核细胞的数目与ODF的浓度呈正相关，多组比较其差异显著（P〈0．05），但若加入chOPG，则阻断了OLC的形成和骨吸收。本试验建立了一种鸡骨髓细胞诱导破骨样细胞方法，既为体外研究鸡破骨细胞的分化发育和功能调节创造了条件，也为进一步研究OPG／ODF／RANK（NF-κB受体，Receptoractivator of NF-κB）在蛋鸡骨质疏松症等骨骼疾病的作用机制提供理论基础。     

应用PCR技术检测鸭疫里默氏杆菌的研究

根据已发表的鸭疫里默氏杆菌15型CVL110／89株编码42－kDa主要外膜蛋白的基因序列设计并合成一对引物，建立PCR方法，对7个血清型的鸭疫里默氏杆菌纯培养菌及野外病死鸭病科组织进行检测。结果表明，7个血清型的鸭疫里默氏杆菌纯培养菌DNA都可扩增出809bp的DNA片段，而对照的2株大肠杆菌和1株沙门氏菌纯培养物DNA扩增结果为阴性；在对24只不同鸭场病死鸭肝、脑的检测中，脑的检出率为19／24（高于细菌分离的13／24），肝脏的检出率为11／24（高于细菌分离的8／24）。由此可见，建立的PCR技术可用于鸭疫里默氏杆菌的鉴定和快速诊断（取脑组织）。但此方法是否对其他血清型的鸭疫里默氏杆菌也适用，有待于收集这些血清型的菌株进行验证。     

破骨细胞与奶牛产乳热

奶牛产乳热是奶牛围产期的多发病,在养殖生产中造成了重大危害。研究发现,产乳热的发生与分娩前后血钙浓度降低有关。甲状旁腺激素(PTH)、降钙素(CT)和1α,25-(OH)_2D_3可直接或间接地调控破骨细胞(OC)的形成、活化和骨吸收功能,从而调控骨钙动员和血钙浓度,很可能与产乳热的发生息息相关。本文就PTH、CT和1α,25-(OH)_2D_3在产乳热中调控OC的可能机制作一综述。