鹌鹑早期原始生殖细胞迁移和聚集规律的研究

本研究旨在观察鹌鹑早期原始生殖细胞的迁移和聚集规律,为分离PGCs,并将其应用于转基因技术提供依据。运用QH1单抗标记特异性的识别鹌鹑的PGCs,检测早期各个阶段PGCs的分布和数量。研究表明:鹌鹑的原始生殖细胞(PGCs)起源于胚盘暗区,而后逐渐迁移至明区、生殖新月区。孵化27h,已有少量PGCs分布于明区的血管中。到孵化36h时,有大量的PGCs聚集在明区血管网中,左右两侧都有。孵化45h时,从头部到脐肠系膜PGCs均有散在和聚团分布,并主要聚集在头部间充质的血管中。PGCs在各个时期的数量存在差异,有2个增殖高峰期,即原条期(孵化6h)和十体节期(孵化36h)。QH1单抗可鉴定早至未孵化期的鹌鹑原始生殖细胞,PGCs在早期胚盘中是随机散在分布的,而且具有2个增殖高峰期。     

兔原始生殖细胞体外培养的研究

旨在探索兔原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）体外分离培养的最佳条件,从而建立成熟稳定的兔PGCs体外分离培养方法。本研究首先通过两种不同的体外分离法（胰酶消化法、机械法）和3种不同的传代法（胰酶消化法、机械法、连同饲养层消化法）探索第14~18天胎兔的PGCs体外分离传代的最佳方式,另将培养液分为A、B、C、D 4组,以D组为对照组,探究不同细胞因子浓度对兔PGCs形态变化及集落形成的影响。其次,利用碱性磷酸酶染色（alkaline phosphatase staining,AKP）法对兔PGCs进行鉴定染色;实时荧光定量（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）检测转录因子Oct-4的表达。结果表明,机械法分离得到的兔PGCs集落数量是酶消化法分离的2.2倍,而兔PGCs经不同的消化法传代发现,酶消化法、连同饲养层消化法、机械法在兔胚胎成纤维细胞（rabbit embryo fibroblast,REF）饲养层上分别成功传至P2、P2、P4代。B组PGCs培养液（基础液+10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）+2 ng·mL^-1转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）+4 ng·mL^-1碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）+10 ng·mL^-1白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF））所获得的集落数量最多,具有较好的集落形态,保持未分化的时间较长。AKP染色结果显示,PGCs集落呈红黑色; RT-PCR结果显示,体外分离培养的兔PGCs表达转录因子Oct-4。结果显示,兔原代PGCs最适采用机械分离法和机械传代法进行体外分离传代,适宜浓度的细胞因子添加至兔PGCs培养液中有利于兔PGCs在体外保持较多的集落数量和较长时间的未分化状态。本研究通过筛选和优化兔PGCs体外培养方法,为进一步建立稳定成熟兔PGCs细胞系奠定技术基础。     

鹌鹑PGCs的传代培养及鉴定

试验采用鸡胚胎制作的成纤维细胞饲养层培养细胞,成功实现鹌鹑原始生殖细胞(PGCs)的传代培养;并通过对比试验,验证了生长因子LIF、SCF、bFGF能够显著提高PGCs存活率和抑制其分化。     

第十九期鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存

采用Ficoll密度梯度离心,提取第 19期(孵化 72h)性腺中的PGCs,对其应用不同的冷冻保护液和不同的平衡方法进行冷冻保存,并于复苏后进行体外培养。复苏后的PGCS用台盼蓝染色检测其存活率,结果发现:从第 19期性腺中获取的PGCs在同一种冷冻保护液下,采用不同的平衡方法进行冷冻,对PGCs的存活率有显著影响(P<0.05)或极显著影响(P<0.01);平衡方法相同,在不同冷冻保护液之间存在显著(P<0.05)或极显著 (P<0.01)差异。PGCs经体外培养 24h后再进行冷冻保存,复苏后其存活率、体外培养存活时间均极显著(P<0.01)短于分离后直接冷冻的PGCs。     

鸡胚19期原始生殖细胞慢速冷冻和玻璃化冷冻保存的研究

本研究对发育至第19期的鸡胚性腺原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)分离提纯后，在DMEM中添加冷冻保护剂DMSO（二甲基亚砜）、EG（乙二醇）、蔗糖、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）分别组成6种慢速冷冻保护液和6种玻璃化冷冻保护液，进行超低温冷冻保存。复苏后苔盼蓝染色测定细胞存活率，体外接种培养、传代。结果：①慢速冷冻保存中，PGCs在慢速冷冻液V（10％EG+10% FBS+0.1 mol/L蔗糖）条件下复苏后存活率最高（92.20%），且与慢速冷冻液I（10％ DMSO+10% FBS）存活率之间差异显著（P<0.05）。②玻璃化冷冻保存中，PGCs在玻璃化冷冻液I（10% DMSO+10% EG+20% FBS+10% PVP）条件下复苏后存活率最高（84.15%），且与其余5种玻璃化冷冻液下复苏后存活率之间差异均极显著（P<0.01）。③培养传至第3代的慢速冷冻复苏后PGCs细胞和培养传至第2代的玻璃化冷冻复苏后PGCs细胞，PAS染色、AKP染色呈阳性并保持完整的二倍体核型。     

鸡胚原始生殖细胞的冷冻保存和体外培养

采用Ficoll密度梯度离心,提取第19期(孵化72h)鸡受精蛋性腺中的原始生殖细胞(primordialgermcells,PGCs),用不同的冷冻保护液对PGCs采用提纯后直接冷冻保存和在培养体系中培养24h后再进行冷冻保存,7d后复苏,用台盼蓝染色检测其存活率,并用PAS染色对冷冻后的PGCs进行特异性鉴定。复苏后的PGCs在培养体系中培养5d后,更换为培养体系继续培养,进行体外分化试验。结果如下分离后直接进行冷冻保存的PGCs复苏后存活率最高为(85.93±1.24)%;复苏后的PGCs在培养体系中培养48h后进行了PAS染色鉴定,结果PGCs呈PAS阳性(细胞核不着色,细胞质呈红色),表明PGCs的染色特性没有因冷冻保存和体外培养而发生改变;复苏后的PGCs在培养体系中培养可形成细胞克隆,当把PGCs更换到培养体系培养5d后,PGCs克隆有的仍保持克隆状态,但体积缩小,克隆中细胞排列紧密,颜色较深,有的克隆由鸟巢状变为不规则形,且在克隆周围形成类神经细胞样细胞。而经体外培养后再进行冷冻保存的PGCs,复苏后存活率最高为(42.26±1.36)%。     

不同冷冻剂对鸡胚PGCs的保护效应

发育至第19期和第28期的鸡胚性腺原始生殖细胞（PGCs）分离提纯后，在DMEM中添加冷冻保护剂DMSO（二甲基亚砜）、EG（乙二醇）、蔗糖进行超低温冷冻保存，比较冷冻保护剂在单独或联合使用条件下对PGCs的冷冻保护效果，复苏后台盼蓝染色测定细胞存活率，体外接种培养、传代。结果表明：（1）第19期PGCs冷冻保存中，10％EG＋10％FBS＋0．1mol／L。蔗糖条件下细胞存活率最高为（92．20±2．18）％，且与10％DMSO＋10％FBS的存活率差异显著（P〈0．05），其余各冷冻保护液间存活率差异不显著；第28期PGCs冷冻保存中，5％DMsO＋5％EG＋10％FBS＋0．1mol／L。蔗糖条件下细胞存活率最高为（92．41±2．82）％，但各冷冻保护液间存活率差异均不显著（P〉0．05）。（2）解冻后体外培养的PGCs，在饲养层和3种细胞因子（I。IF、SCF、bFGF）的共同作用下，可持续增殖，传至第3代的PGCs，PAS染色、AKP染色均呈阳性并保持完整的二倍体核型，仍处于未分化状态。     

鸡胚胎生殖嵴中原始生殖细胞的分离培养研究

在鸡胚孵化的 19期以Ficoll密度梯度离心和酶解离两种方法分离生殖嵴中的原始生殖细胞 (PGCs)。探索在生殖嵴中PGCs分离、培养的适宜方法 ,以获得较多数量 ,较高活力的PGCs作介导生产转基因鸡。在倒置显微镜下进行形态观察 ,台盼兰染色比较存活时间 ,PAS特异染色法识别鉴定PGCs。结果表明两种分离方法均能分离到一定数量的PGCs细胞。与Ficoll密度梯度离心法相比 ,酶解离法分离到的PGCs的相对数量较多 ,存活时间较长 ,是一种较可行的分离方法。在鸡胚孵化的第 19期 ,PGCs大量聚集在肢体后端的生殖嵴原基处 ,此时的生殖嵴大小已达一定程度 ,分离其中的PGCs操作简便 ,有较强的可操作性 ;提取出的PGCs为转基因鸡的生产提供了介导材料     

不同胚期分离的鸡原始生殖细胞(PGCs)遗传与培养特性比较

根据家禽原始生殖细胞(PGCs)的迁移路径,分别从孵化24h的鸡胚生殖新月(gcPGC)、2.5d的胚血(cPGC)和5.5d的生殖腺(gPGC)中分离PGCs,置于完全培养基中培养,表达干细胞标志物SSEA-1和生殖细胞特异标志物DAZL免疫荧光染色鉴定结果,表明纯化的细胞为PGCs。CCK-8法细胞增殖检测显示,BRL-3A饲养层细胞能明显促进PGCs的体外增殖,与无饲养层条件培养的PGCs间有显著性差异(P<0.05),但不同来源PGCs间无增殖速度的差异。检测这3种不同来源PGCs的集落形成能力,结果显示cPGCs的集落形成率最高,集落体积最大。real time-PCR结果显示多能性相关基因nanogv和pouV在gcPGCs中的表达量最高,而生殖相关基因dazl和cvh在cPGCs中的表达量最高。结果表明,体外培养的PGCs保持其体内遗传状况,即gcPGC的多能性最好,cPGC开始进入生殖系分化,而gPGC可能已部分进入减数分裂。而从培养特性上来看,gcPGC由于数量过少难以扩大培养,而gPGC混合的分化细胞过多,cPGC是体外培养和增殖分化研究的最佳细胞来源。     

四氯联苯对鸡胚生殖新月原始生殖细胞分布的影响

为了探索四氯联苯(2,2′,5,5′)对鸡胚生殖新月原始生殖细胞(PGCs)分布的影响,本试验将四氯联苯注入种蛋的胚盘(第X期)处,在38℃,相对湿度60%,每2h45度转蛋的条件下孵化至原条期,通过不同方法检测原条期生殖新月明区、暗区及血液循环中的PGCs,探讨四氯联苯对胚盘生殖新月区PGCs分布的影响。结果表明,四氯联苯明显降低了原条期明区和血液中PGSs的数量(P<0.01),但对暗区PGCs的数量影响不明显。这说明四氯联苯对血液中PGCs的影响是由于降低了生殖新月明区PGCs的缘故,和暗区的PGCs无相关性。     

奶牛发育各期乳腺肥大细胞的组织化学特性研究

本研究旨在对奶牛乳腺肥大细胞的组织化学特点进行研究。对奶牛发育各期乳腺进行取样,应用改良甲苯胺蓝染色法(MTB)和阿尔新蓝—番红鉴别染色法（AB-S）进行染色,观察肥大细胞的组织化学特点和数量变化特点。同时比较了甲苯胺蓝染色时两种固定液固定对乳腺肥大细胞着染的效果。奶牛不同发育时期乳腺肥大细胞只被阿尔新蓝染色,Carnoy氏液固定效果优于中性甲醛（NBF）,MTB的染色效果优于AB-S。奶牛乳腺肥大细胞的数量在泌乳各期和静止期有显著的变化。与静止期相比,泌乳期的乳腺肥大细胞数量明显减少(P＜0.05),分娩后60 d奶牛乳腺肥大细胞的数量最少。奶牛乳腺只存在黏膜型肥大细胞;用Carnoy氏液固定,用MTB法染色可以很好地显示肥大细胞;泌乳期乳腺肥大细胞数量与静止期相比,明显减少。     

口服ND弱毒苗对鸡十二指肠中2种神经多肽阳性细胞的影响

应用新城疫弱毒苗经消化道黏膜2次免疫鸡后,采用免疫组化的方法检测鸡十二指肠中生长抑素(Somatostatin,SS)阳性细胞和P物质(Substance P,SP)阳性细胞的分布及其数量变化。结果表明,动物首免后第3周,新城疫免疫组SS阳性细胞数量极显著增加(P<0.01),而SP阳性细胞数量显著减少(P<0.05);首免后第5周和第7周,新城疫免疫组和对照组中的2种阳性细胞数差异不显著。     

The influence of selected techniques of bovine leukocyte isolation on their viability and metabolism

The aim of the study was to assess the effect of selected isolation methods on the viability and metabolism of bovine leukocytes. The cells were isolated using a Ficoll 1077, Histopaque 1083 gradient and osmotic shock method, and Ficoll or Histopaque with osmotic shock. Evaluation were made of the total number of cells, viability after isolation and in 24h culture on RPMI 1640 medium and metabolism with NBT reduction assay. Microscopic and cytometric evaluation of the leukocytes revealed that the isolation methods applied had an influence on their number and viability. Based on the results it can be concluded that isolation methods of cells in a Histopaque or Ficoll yield highly pure cell fractions with high viability.     

绵羊自然感染贝氏莫尼茨绦虫对小肠黏膜免疫相关细胞的数量变化

运用组织学和组织化学染色法,分别对自然感染贝氏莫尼茨绦虫的成年绵羊（感染组）与正常成年绵羊（对照组）的小肠各肠段的上皮内淋巴细胞、浆细胞、杯状细胞和嗜酸粒细胞的分布和数量变化进行了比较研究。结果显示：感染组小肠各段上皮内淋巴细胞、浆细胞、杯状细胞和嗜酸粒细胞数量均显著高于对照组,其中感染组十二指肠、空肠和回肠的上皮内淋巴细胞数量分别比对照组增加了169.11%、230.38%和233.42%（P〈0.01）;嗜酸粒细胞数量分别比对照组增加了116.78%、123.87%和164.51%（P〈0.01）;浆细胞数量分别比对照组增加了127.34%、72.97%和328.26%（P〈0.01）;杯状细胞数量分别比对照组增加了33.40%、41.42%和133.17%。对照组和感染组上皮内淋巴细胞和杯状细胞从十二指肠到回肠均逐渐减少,相反,对照组和感染组嗜酸粒细胞数量从十二指肠到回肠均逐渐增多,对照组小肠固有层浆细胞数量从十二指肠到空肠增加,空肠到回肠减少,感染组小肠固有层浆细胞数量从十二指肠到回肠均逐渐增多;对照组十二指肠、空肠、回肠的上皮内淋巴细胞、上皮内杯状细胞、浆细胞和嗜酸粒细胞均差异极显著（P〈0.01）;感染组十二指肠、空肠、回肠的上皮内杯状细胞、浆细胞和嗜酸粒细胞均差异极显著（P〈0.01）,感染组上皮内淋巴细胞空肠与回肠差异极显著（P〈0.01）,但十二指肠与空肠差异不显著（P〉0.05）。研究结果表明,贝氏莫尼茨绦虫感染成年绵羊后,成年绵羊通过特异性黏膜免疫细胞上皮内淋巴细胞增生加强细胞免疫水平,浆细胞增生加强体液免疫水平,同时还通过非特异性黏膜免疫细胞,嗜酸粒细胞和杯状细胞的增生进一步加强黏膜免疫水平以抵抗贝氏莫尼茨绦虫对绵羊的感染。可见绵羊可以通过黏膜免疫相关细胞增生加强局部免疫力以监视虫体免疫逃逸来抵抗寄生虫的感染。     

不同培养方法对山羊瘤胃上皮细胞生长及角蛋白18表达量的影响

本试验旨在研究不同培养方法对山羊瘤胃上皮细胞生长及角蛋白18(CK18)表达量的影响。采集42日龄山羊的瘤胃上皮组织,分别采用酶消化法和组织块法对其进行体外培养。通过光学显微镜观察原代培养和传代培养阶段的细胞形态,检测第5代山羊瘤胃上皮细胞的生长曲线,并采用细胞免疫荧光法对山羊瘤胃上皮细胞进行鉴定。结果显示:1)经0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸消化获得的原代培养山羊瘤胃上皮细胞于2 d开始贴壁生长,5 d细胞开始明显增多,10 d细胞数量达到最大。2)经组织块法获得的原代培养山羊瘤胃上皮细胞于4 d开始"爬出"组织块,8 d细胞开始明显增多,14 d细胞数量达到最大。3)经免疫荧光染色显示2种方法获得的细胞胞浆内CK18均呈阳性表达且细胞纯度后者明显高于前者。4)组织块法获得的细胞CK18表达量显著高于酶消化法(P0.05)。综合得出,与酶消化法相比,应用组织块法可成功获得纯度更高的山羊瘤胃上皮细胞。     

Preparation and Identification of Monoclonal Antibody against Min-A Strain of Pseudorabies Virus (PRV)

With purified pseudorabies virus (PRV) to immune BALB/c mice, spleen cells from imunized mice were fused with SP2/0 myeloma cells by application of lymphocyte hybridoma technique, followed by double antibody sandwich ELISA screening, four times cloning by limiting dilution method to obtain two stable secreting anti-PRV monoclonal antibody hybridoma cell lines, 2C6E6 and 3D5F1.After identification, these two monoclonal antibodies belonged to IgG1 and IgG2a subtypes, respectively, the average number of chromosomes of hybridoma cells was 84, ELISA titers of these two hybridoma cell culture supernatants and mouse ascites monoclonal antibodies were 1:512 and 1:1 638 400, 1:1 024 and 1:819 200.These two monoclonal antibodies showed no cross-reaction with classical swine fever virus, porcine reproductive and respiratory syhdrome virus and porcine parvovirus, which indicated that they had high specificity.The hydridoma cells could passage for 30 generations which could still secrete monoclonal antibody against PRV, which indicated that these two monoclonal antibodies had good stability.The results in the assay laid the foundation for establishing rapid diagnostic methods of PRV.     

细毛羊毛囊干细胞分离培养方法比较研究

试验旨在对细毛羊毛囊干细胞的分离培养方法进行初步研究,建立细毛羊毛囊干细胞体外培养体系。采用两步酶消化法、机械分离法和两步酶消化法+机械分离法3种方法分离培养细毛羊毛囊干细胞,通过测定毛囊干细胞的数量、克隆形成率及毛囊干细胞的增殖能力等综合评估3种培养方法的优劣,寻求既能方便获得大量毛囊干细胞,又能减少其分化的理想培养条件。倒置显微镜下观察3种培养方法获得的细胞均为铺路石状,均表达角蛋白K19和整合素β1,表明成功获得细毛羊毛囊干细胞,建立体外培养体系。采用"两步酶消化法和机械分离法"相结合的方法获得毛囊干细胞体外培养效果最优。     

伪狂犬病病毒闽A株单克隆抗体的制备与鉴定

本试验应用细胞杂交瘤技术,取健康BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞进行细胞融合,经双抗体夹心ELISA筛选,4次有限稀释法克隆,得到2株能稳定分泌抗伪狂犬病病毒(PRV)的单克隆抗体杂交瘤细胞株:2C6E6、3D5F1。2株杂交瘤细胞培养上清的效价分别为1:512、1:1 024。鉴定结果显示这2株单克隆抗体分别为IgG1亚类和IgG2a亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数目为84条。用纯化的PRV免疫经产健康的BALB/c小鼠,采用ELISA方法检测获得的腹水的效价分别为1:1 638 400和1:819 200。经检测这2株单克隆抗体与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒均不发生交叉反应,特异性良好。杂交瘤细胞连续培养30代,仍能稳定分泌抗PRV的单克隆抗体,说明这2株单克隆抗体的稳定性良好。本试验研究结果为PRV的快速诊断方法的建立奠定了理论基础。     

Sera from pigs infected with Sarcocystis suicanis and cachectin decrease preadipocyte differentiation in primary cell culture

The macrophage-secreted hormone cachectin depressed lipoprotein lipase activity and lipogenic enzymes in adipose cells. Cachectin reduced differentiation of preadipocytes in cultures of stromal-vascular cells from rat adipose tissue. Differentiation was measured by two methods of estimating lipid accumulation. Adipocytes were separated from the stromal-vascular cells by centrifugation and staining (oil red 0) for intracellular lipid. Lipolytic activity was measured by using esterase histochemistry. Sera from pigs that were infected with Sarcocystis suicanis showed cachectin-like activity compared with sera collected from the same animals before infection. Cachectin and sera collected from infected animals specifically decreased fat cell number without decreasing the stromal-vascular cell number.     

Effect of sex, age, number of bronchoalveolar lavages and quantitation methods on the bronchoalveolar cell counts in rats.

This study was conducted to investigate the effect of sex, age, number of bronchoalveolar lavages and method of quantitation on the number of bronchoalveolar cells in rats. Forty Long Evans rats were divided into four age-sex subgroups of ten animals each. Nine consecutive bronchoalveolar lavages were done in every rat and the number of bronchoalveolar cells/mL in lavages 1-3 (L1), 4-6 (L2) and 7-9 (L3) were determined by hemocytometer and electronic cell counts (Coulter Counter). The sex or age of the rats did not show a significant effect (p less than 0.05) in the number of bronchoalveolar cells recovered from the lungs; however, there was a significant difference (p less than 0.05) in the number of cells/mL among lavages 1-3, 4-6 and 7-9 (L1 approximately equal to L2 greater than L3). A discrepancy of approximately 8% in the counts of bronchoalveolar cells was found between the hemocytometer and the Coulter Counter; however, these two methods of cell quantitation showed a significant (p less than 0.01) positive correlation (r = 0.89). No significant (p greater than 0.05) differences were found in the percentage of fluid recovery (overall mean = 94.5%) among lavages L1, L2 and L3. It was concluded that the electronic cell counting of bronchoalveolar cells is as reliable as manual counting. Although sex or age did not significantly affect the number of cells recovered from the lung, caution should be used in the number of lavages done per rat since this variable may significantly affect the results.