奶牛乳房炎链球菌的刃天青微量板快速诊断与药敏试验

本研究以刃天青钠取代链球菌选择培养基EN的溴甲酚紫指示剂,建立了奶牛乳房炎链球菌快速诊断与药敏试验用微量板。将不含指示剂EN的培养基分装到96孔板,接种不同细菌或其感染模拟奶样,培养2h加入优化浓度的刃天青指示剂,结果表明能显示无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌生长,不能显示大肠杆菌和葡萄球菌生长;检测三种奶牛乳房炎链球菌总敏感性达105cfu/m L,能在10h内获得诊断结果。60份临床奶样诊断结果显示,刃天青微量板法检测链球菌阴性奶样特异性达100%,检测链球菌单阳性奶样敏感性为100%,检测链球菌混合阳性奶样敏感性达97.1%。用矫正浓度的10种抗生素包被微量板,分别用10株链球菌纯培养、感染模拟奶样和9份链球菌阳性奶样进行刃天青微量板法快速药敏试验,所获结果与标准纸片扩散法完全一致。试验结果表明,本研究建立的刃天青微量板法可取代标准方法用于奶牛乳房炎链球菌的快速诊断及药敏试验。     

奶牛大肠杆菌乳房炎快速鉴别及药敏试验用选择培养液的培养特性研究

由于抗生素的长期和盲目使用，奶牛乳房炎病原菌耐药性问题日益严重。我们以麦康凯培养基为基础，研制出奶牛大肠杆菌乳房炎快速鉴别及药敏试验用MQQ选择培养液。本研究结果显示，在此选择培养液中，除大肠杆菌生长良好外，葡萄球菌、粪链球菌、枯草杆菌等革兰氏阳性菌和沙门氏菌、变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、绿脓杆菌、痢疾志贺氏菌等革兰氏阴性菌均不生长；只要接种10μL奶样并于37℃培养24h，即可根据培养液是否浑浊和颜色变化判断奶样中有无大肠杆菌，检测灵敏度为50个细菌；经与标准纸片扩散法药敏试验对比证明，MQQ选择培养液对部分用于奶牛乳房炎治疗的5类8种抗生素的抑菌活性有不同程度的影响，通过调整抗生素使用量可获得与标准方法一致的结果，只要向合适当浓度抗生素的选择培养液中接种10μL奶样并于35℃培养24h，即能根据培养液是否浑浊和颜色变化判断奶样中大肠杆菌对所试抗生素的敏感性，具有简单、快速、价廉和不需专门设备等优点，特别适合我国中、小型奶牛场和基层兽医站使用。     

奶牛乳房炎病原菌诊断技术研究进展

奶牛乳房炎是影响世界奶牛业发展的最主要疾病之一,不仅给奶牛养殖业带来严重的经济损失,而且还影响牛奶的产量和质量,危及人类健康。引起奶牛乳房炎的病因很复杂,但最主要的病因是病原微生物感染,其中葡萄球菌、链球菌和肠道菌感染是引起奶牛乳房炎的最主要病原菌。为有效治疗奶牛乳房炎,对奶牛乳房炎病原菌的早期快速诊断至关重要。作者对目前用于奶牛乳房炎病原菌诊断的常规微生物生化鉴定法、全自动微生物鉴定系统、刃天青微量板法、免疫诊断法、核酸探针杂交、16S rRNA基因序列测定、PCR、基因芯片及环介导等温扩增技术等的研究进展进行了综述,并比较分析了这些方法的优缺点,同时对未来奶牛乳房炎病原菌诊断的研究方向和前景进行了展望,以期为进一步开发快速、特异、敏感的奶牛乳房炎病原菌诊断技术提供理论依据。     

直接提取病原菌DNA检测奶牛隐性乳房炎试验

为研究奶牛隐性乳房炎主要致病菌的快速检测方法,本试验选取山西省太原市小店区某规模化奶牛场39头隐性乳房炎患牛,利用Chelex-100方法直接提取奶样金黄色葡萄球菌、大肠杆菌及停乳链球菌DNA进行检测。结果表明,利用Chelex-100方法直接提取奶样中病原菌DNA检测奶牛隐性乳房炎,具有简单、快速、经济、无污染、PCR敏感性高等优点,对PCR快速检测奶牛隐性乳房炎具有重要意义。     

奶牛临床型乳腺炎病原菌分离鉴定与药敏试验建议

探究奶牛临床型乳房炎病原菌分离鉴定与药敏试验建议.选择某地患有临床型乳房炎病牛的奶样30份,分别进行病原的分离鉴定与药敏试验.其中大肠杆菌和热带假丝酵母菌是最主要的两种病原菌,菌株数达到34株,占79.06%,并且两种及其以上菌所造成混合感染的奶样共有11份.本次所分离的热带假丝酵母菌对抗真菌药物高度敏感的主要是酮康唑和制霉菌素,敏感性比较低主要是氟康唑、两性霉素B以及伊曲康唑.通过对奶牛临床型乳房炎病原菌进行必要的分离鉴定与药敏试验.有助于将其中最主要的病原菌类型和合理的抗生素药物准确的筛选出来,进而可以为临床用药提供必要的指导,乳房炎的发病率也可以得到有效的降低,从而有助于奶牛业的长远发展.     

奶牛乳房炎病原菌分离鉴定及药敏试验——以甘肃天水为例

[目的]为了解甘肃天水奶牛乳房炎病原菌种类及对药物的敏感性。[方法]选取甘肃天水3个奶牛场40头患有临床乳房炎奶牛乳样,分别采用培养基法和生化分析法进行病原菌分离和鉴定;采用Kirby-Bauer纸片扩散法对分离得到的病原菌进行体外药物敏感性试验。[结果]在分离的140株病菌中,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌数量最多,分别占32.1%、27.2%和14.3%。药敏试验结果显示,分离得到的45株大肠杆菌对青霉素均呈现耐药,耐药率高达100%,而大肠杆菌对万古霉素的敏感性最高,45株菌株中未检测到耐药性。[结论]为甘肃天水奶牛乳房炎的防治提供一定的理论依据。     

奶牛乳房炎性大肠杆菌的分离鉴定及其特性研究

乳房炎是奶牛养殖业中最常见、防治最困难、花费最多的疾病之一,给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失,本实验大肠杆菌是奶牛乳房炎的主要致病菌.本试验旨在对新疆昌吉州及周边地区规模化奶牛场的乳房炎奶牛乳汁进行细菌分离培养与鉴定,调查其中的大肠杆菌在奶牛场的分布情况;同时,进行该菌的药敏试验和耐药检测,获得大肠杆菌对哪种抗生素敏耐药并提出合理的预防措施。无菌采集奶样,冰盒保存,12h内送到实验室进行病原菌的分离鉴定,对大肠杆菌进行药敏试验和耐药监测。结论:通过分离鉴定的大肠杆菌,预期测定对大肠杆菌敏感的药物,对牛场防治奶牛乳房炎提供的重要线索。     

广东一奶牛场临床乳房炎致病菌分离及其药敏试验

为了解广东某牛场奶牛乳房炎的细菌感染情况及其对常用药物的敏感性,本试验对从8头临床乳房炎患牛采集的8份奶样中分离细菌,纯化、鉴定后再进行药敏试验。结果表明,8份奶样中分离出3株大肠杆菌、5株金黄色葡萄球菌和3株链球菌。其中分离得到的大肠杆菌和链球菌对硫酸头孢喹肟最敏感,金黄色葡萄球菌对复方氨苄西林和阿莫西林同样敏感。本试验可为临床乳房炎治疗用药提供参考。     

奶牛隐性乳房炎病原菌的分离鉴定及药敏试验

导致奶牛隐性乳房炎的因素很多，但病原微生物是导致隐性乳房炎的主要病因[1]，其中以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，但各地病原感染情况不尽相同。本试验通过对柳州市部分奶牛场采集奶样进行细菌的分离及药敏试验，为奶牛隐性乳房炎的防治、用药提供可靠依据，以促进柳州市奶牛养殖业的发展。     

新疆铁门关地区奶牛乳房炎病原菌分离鉴定及主要病原菌药敏试验

本试验从新疆铁门关地区采集166份乳房炎患牛的奶样,进行了细菌分离鉴定并对主要病原菌进行药敏试验。结果表明,从奶样中共分离出12种267株细菌,其中主要病原菌为:金黄色葡萄球菌86株,检出率33.6%;大肠杆菌68株,检出率25.5%;停乳链球菌33株,检出率12.4%;无乳链球菌25株,检出率9.4%。临床型乳房炎大部分为混合感染(混合感染的感染率为61.4%),隐性乳房炎大部分为单独感染(单独感染的感染率为88.5%)。选择16种抗生素采用K-B纸片法对分离出的病原菌进行药敏试验,4种主要病原菌对头孢曲松钠、头孢哌酮、克林霉素、氟苯尼考敏感。该试验为本地区奶牛乳房炎的防治提供了理论依据。     

A Resazurin Microplate Assay for Quick Diagnosis and Antibiotic Sensitivity Measurement of Bovine Mastitis-causing E.coli

To establish a microplate assay for quick diagnosis and antibiotic sensitivity measurement of bovine mastitis-causing E.coli,the phenol red indicator in E.coli selective medium was replaced with resazurin and the resazurin microplate assay was established by determing of optimization of indicator concentration,bacterial inoculation dose and culture time.The testing results of different bacteria and their infection-mimicking milk samples showed that the microplate assay had a strong selective property for E.coli and the definite diagnostic result could be obtained within 10 h with a capability of reflecting infection strength of dairy cow mammary gland.The results of 89 mastitis-positive milk samples showed that the microplate assay had a detection sensitivity of 100%,and the negative milk samples specificity was 94.9%,95.5% agreement to the conventional culture-based method.The micoplates were coated with rectified concentrations of 10 different antibiotics and the quick drug sensitivity assay was performed using 10 E.coli strains,infection-mimicking milk samples and 10 E.coli-positive milk samples.The obtained results had a complete agreement with that of standard disc diffusion method.These data suggested that the resazurin microplate assay established in this study could replace the conventional methods for quick diagnosis and antibiotic sensitivity measurement of bovine mastitis-causing E.coli.     

The effect of dietary spray-dried bovine colostrum and plasma on the response of pigs to enterotoxigenic E. coli challenge after weaning

Twenty four, 21-d-old female pigs were fed diets containing either skim milk powder (CON+), spray-dried bovine colostrum (7.5%, BC+) or spray-dried bovine plasma (7.5%, BP+) and were dosed orally with 1 × 10⁹ CFU of E. coli O149:K88. Another group of 8 unchallenged pigs was fed the skim milk powder diet (CON−). On d 19 of the experiment all piglets were euthanased. Adverse effects of the E. coli challenge were observed variously throughout the small intestine in pigs consuming either the BC+ or BP+ diets. In this experiment, similar responses to the E. coli challenge were observed in both plasma and colostrum fed pigs, which suggests that spray-dried bovine colostrum may be a potential alternative to spray-dried bovine plasma.     

In vitro comparison of bovine mastitis and fecal Escherichia coli isolates

In vitro methods were used to test the hypothesis that Escherichia coli from bovine mastitis are essentially no different from isolates from bovine feces. Fifty E. coli isolates from bovine mastitic milk, 50 from feces of mastitic cows and 50 from feces of healthy cows were compared with respect to biochemical properties and certain potential virulence factors. There were no significant differences among the groups in tests for biotype; production of colicins, colicin V, or Vero cell cytotocity; and growth in 90% gnotobiotic calf serum or 90% normal milk whey. Resistance to killing in 90% gnotobiotic calf serum varied from 66 to 84%. Most isolates grew in normal whey: the percentage in a group varied from 86 to 96. Mastitic milk isolates were significantly different from the fecal isolates in adonitol fermentation (P0.006), production of aerobactin (P0.026), and ability to grow in 90% mastitic whey (P0.00004). However, only 40% of mastitis E. coli fermented adonitol and only 20% produced aerobactin. Ninety-six percent of mastitic milk E. coli grew in mastitic whey, whereas 64% and 60%, respectively, of mastitic fecal and normal fecal isolates grew in this medium. It is concluded that none of the properties that were investigated constitute potential virulence factors or markers for ability to induce mastitis; the data are consistent with the hypothesis that mastitic E. coli are simply opportunistic pathogens.     

乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法的建立

本试验旨在建立一种乳品中大肠杆菌PMA-qPCR活菌检测方法.优化qPCR检测方法,探究菌浓度为1×10⁸ CFU/mL的大肠杆菌活菌悬液、热致死菌悬液细胞数来确定不同的PMA剂量、暗孵育时间、曝光时间对死菌抑制效果的影响,确定最佳PMA处理方案.结果表明,qPCR检测可特异性扩增大肠杆菌,1×10⁸ CFU/mL的大肠杆菌经90 ℃水浴30 s全部致死后,采用10 μg/mL的 PMA暗孵育15 min后冰上曝光10 min为最佳处理方案,这种处理方案可最大程度抑制死细胞信号,而对活细胞几乎没有影响,样品中微生物初始浓度不低于1×10⁸ CFU/mL时较稳定,得到标准曲线回归方程y=-3.356x+47.413,R²=0.9989,最低检测限为10³ CFU/mL,加标样本检测结果与实际相符.该方法为利用PMA-qPCR检测食品中的活大肠杆菌杆菌奠定了基础.     

Establishment of PMA-qPCR Assay for Detection of Viable E.coli in Milk

In order to detect viable E.coli in milk,a new PMA-qPCR method was established.The influences of different PMA concentration,dark incubation time,exposure time on dead bacteria inhibition effect were determined by detection of the cell numbers of viable and heat-killed E.coli suspensions at concentration of 1×10⁸ CFU/mL through fluorescence quantitative PCR (qPCR) method.The results showed that qPCR assay could specifically detect E.coli,and the viable E.coli must be exposed to 90 ℃ for 30 s in water bath to be lethal.The best treatment was 10 μg/mL PMA with 15 min of dark incubation time and 10 min of exposure time.This treatment could inhibit dead cell signals to a largest extend,while had little impact on aviable cells.The stability of PMA-qPCR assay was kept while the concentration of bacteria was more than 1×10⁸ CFU/mL.The regression equation of standard curve was y=-3.356x+47.413,R²=0.9989,the lowest detection limit was 10³ CFU/mL.The result of adding assay was agreed with the actual situation.This study laid a foundation for using of PMA-qPCR to detect the viable E.coli in food.     

牛源大肠杆菌对秀丽隐杆线虫的致病性研究

为建立牛源大肠杆菌-秀丽隐杆线虫致病模型，本研究从广西南宁、桂林、柳州等地区收集的牛病料中分离出13株大肠杆菌，继而对这些大肠杆菌进行血清学鉴定及小鼠、秀丽隐杆线虫的致病性试验。采用玻片凝集法鉴定大肠杆菌的O血清型，并将13株大肠杆菌培养液以3.0×10⁹ CFU/mL、0.2 mL/10 g体重给小鼠腹腔注射，同时分别喂食N2野生型秀丽隐杆线虫。结果显示，大肠杆菌的O血清型为O127、O126和O44，其中O126为优势血清型（4/13）。致病性结果显示，有11株大肠杆菌能使小鼠致死（致死率为40%~100%），2株大肠杆菌对小鼠没有致死性（致死率为0）。对小鼠有强致病性的大肠杆菌，对线虫的致死率也较高，死亡率在第3~6天最为显著，半数致死时间为3~4.5 d，最长存活时间为9 d；对小鼠不致死的两株大肠杆菌对线虫的致死率也较低，线虫死亡率下降趋势缓慢，半数致死时间为5~6 d，最长存活时间为10~11 d。肠道细菌计数结果显示，大肠杆菌在线虫体内的数量与时间呈线性关系，大肠杆菌不断破坏线虫的免疫系统，从而导致了线虫的死亡。本研究结果表明，大肠杆菌对线虫和小鼠的致病力试验结果一致，说明成功建立了牛源大肠杆菌-秀丽隐杆线虫致病模型，为牛病防治与临床用药提供了依据。     

山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析

试验旨在了解山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的污染状况及耐药情况。选择山东省3个地区的规模化奶牛场共采集227份牛奶样品，采用细菌学方法对大肠杆菌进行分离鉴定，用微量肉汤稀释法检测分离菌对11种常规抗菌药物的敏感性，采用PCR方法对常见的13种耐药基因、8种毒力基因和Ⅰ类整合子基因盒结构进行分析。结果显示，从227份牛奶样品中共分离出71株大肠杆菌；大肠杆菌对1种及1种以上抗菌药耐药的菌株达到77.5%，多重耐药率为15.5%，其中对多黏菌素耐药率为52.2%，对阿莫西林-克拉维酸耐药率为39.4%，而所有菌株均对新霉素表现为敏感。PCR检测耐药基因、毒力基因和Ⅰ类整合子结果显示，β-内酰胺类耐药基因中bla_TEM基因携带率为100%，其中全部为bla_TEM-1基因，bla_CTX-M基因携带率为32.4%，其中主要为bla_CTX-M-15基因，没有检测到bla_SHV、bla_OXA基因；多黏菌素的耐药基因mcr-1携带率为29.6%；喹诺酮类耐药基因中aac（6'）-Ⅰb-cr基因携带率为29.6%，qnrB基因携带率为20.8%，没有检测到qnrA和qnrC耐药基因；对8种毒力基因检测分析结果显示，仅Hly毒力基因没有被检出，Ecs3703、Irp2基因的检出率较高，分别为90.1%和63.4%，71株大肠杆菌中共有11株携带Ⅰ类整合子，检出率为15.5%，11株大肠杆菌携带6种耐药基因盒结构，最主要的耐药基因盒排列为dfr17-aadA5。本研究结果表明，山东地区乳房炎牛奶中大肠杆菌的耐药现象严重，携带毒力基因Ecs3703、Irp2的大肠杆菌可能是引起奶牛乳房炎的致病菌，Ⅰ类整合子的检测在细菌耐药性与基因携带率方面发挥着关键作用，可为临床预防和治疗奶牛乳房炎大肠杆菌病提供理论依据。     

牦牛隐性乳房炎主要病原菌及耐药和毒力基因分布情况

为探明牦牛隐性乳房炎（SCM）主要病原菌及其耐药和毒力基因的分布情况，本研究自甘肃省甘南州夏季牧场收集无乳房炎临床症状牦牛乳样，通过兰州乳房炎试验（LMT）筛选SCM乳样，从中分离病原菌并纯化培养，利用16S rDNA鉴定主要病原菌，通过纸片扩散法判定其药物敏感性，并采用PCR方法对相关耐药及毒力基因进行检测。结果显示，共筛选出牦牛SCM乳样324份，检出率14.43%；主要病原菌为葡萄球菌属、埃希氏菌属和肠球菌属，其中葡萄球菌分离株对青霉素和四环素耐药率最高，分别为59.57%和47.52%；大肠埃希氏菌分离株对四环素和氨苄西林耐药率最高，分别为43.40%和20.75%；粪肠球菌分离株对四环素和红霉素耐药率最高，分别为25.00%和16.67%；59株耐青霉素金黄色葡萄球菌中共检出MRSA 12株，其中7株携带mecA基因，5株含mecC基因；四环素外排泵基因tetK、tetA携带率最高（85.45%、56.36%），核糖体保护基因tetM携带率最低（34.55%）；毒力基因中，clfA、clfB、fib、coa基因检出率较高（87.64%、84.27%、83.15%、82.02%）。研究表明，牦牛SCM的主要病原菌为金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌，均对青霉素类和四环素类抗生素耐药性较高，其中金黄色葡萄球菌的主要毒力因子为黏附因子和凝固酶。     

同一养殖模式下不同地区猪源大肠杆菌耐药性比较

本试验旨在比较新疆相同养殖模式下不同地区猪源大肠杆菌的耐药情况。分别在某规模化养猪场呼图壁(207份)、玛纳斯(210份)和昌吉(210份)地区采集粪样,共计627份样品,各地区猪源大肠杆菌的分离率均为100.0%。采用微量肉汤稀释法对分离出的大肠杆菌进行临床常用抗菌药物的药敏试验,并通过卡方检验比较3个地区猪源大肠杆菌耐药率的差异。结果显示,呼图壁地区猪源大肠杆菌对安普霉素、阿米卡星、阿莫西林—克拉维酸和头孢噻呋的耐药率均极显著高于另外两地区(P< 0.01);玛纳斯地区猪源大肠杆菌对环丙沙星的耐药率显著高于另外两地区(P< 0.05),对诺氟沙星的耐药率极显著高于另外两地区(P< 0.01);昌吉地区猪源大肠杆菌对诺氟沙星的耐药率极显著高于呼图壁地区(P< 0.01),而对阿莫西林—克拉维酸和氨苄西林的耐药率均显著高于玛纳斯地区(P< 0.05)。呼图壁地区3~8耐菌株占94.7%,玛纳斯地区3~7耐菌株占89.5%,昌吉地区4~8耐菌株占82.4%。不同地区之间3~7耐菌株数差异不显著(P> 0.05)。结果表明,在相同的养殖模式下,不同地区猪源大肠杆菌的耐药情况不同。此外,养殖场猪源大肠杆菌的耐药问题严重,以多药耐药为主,耐药谱型呈多样化。     

大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤的研究

试验旨在研究大肠杆菌（E.coli）对奶牛子宫内膜上皮细胞（bovine endometrial epithelial cells,BEECs）的体外炎性损伤,探究大肠杆菌引发炎性反应的最佳浓度、作用时间及机制。首先,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵、1×10⁶、2.5×10⁶、5×10⁶ CFU/mL）诱导刺激细胞3、6和9 h,通过倒置显微镜观察细胞形态、CCK-8法测D_{450 nm}值,检测大肠杆菌对细胞活性的影响;其次,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵ CFU/mL）处理细胞3、6和9 h,用ELISA方法检测细胞上清液中白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌量;最后,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵ CFU/mL）处理细胞6和9 h,用Western blotting检测核因子κB抑制蛋白α（IκBα）和p65蛋白的磷酸化水平。结果显示,与对照组相比,大肠杆菌感染细胞9 h后,1×10⁶、2.5×10⁶和5×10⁶ CFU/mL大肠杆菌组细胞活性均极显著降低（P<0.01）,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组显著降低（P<0.05）;大肠杆菌感染细胞9 h后,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α极显著升高（P<0.01）;大肠杆菌感染细胞6 h后,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组IκBα、p65蛋白磷酸化水平和IL-6均极显著升高（P<0.01）,5×10⁴ CFU/mL大肠杆菌组IκBα和p65蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.05）。结果表明,大肠杆菌可以刺激奶牛子宫内膜上皮细胞产生炎性反应,且当细胞与5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌作用6 h或与5×10⁴ CFU/mL大肠杆菌作用9 h为最佳。