犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank上发表的犬细小病毒（CPV）VP2蛋白基因序列，设计并合成1对引物，通过PCR扩增VP2基因全长。将其克隆到pET一30a载体中，构建了原核表达载体pET—VP2，转化大肠杆菌Rosetta，表达并纯化了重组蛋白，Western—blotting证明该重组蛋白具有免疫原性。利用重组蛋白为抗原，通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被量为15．8ng／孔，血清的最佳稀释倍数为1：100，建立了检测CPV血清抗体的间接ELISA方法。     

犬细小病毒NY株VP2蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

试验旨在制备犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）VP2蛋白多克隆抗体。构建pET28a-CPV-VP2重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化目的蛋白与佐剂混合、乳化制备后作为免疫原,免疫家兔制备VP2蛋白多克隆抗体;采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）检测抗体的免疫活性、抗体滴度、病毒滴度及中和活性。结果表明,重组VP2蛋白（rVP2）以包涵体形式存在,分子质量约为72 ku;所制备的多克隆抗体滴度为1 600倍,病毒滴度为10⁷ TCID₅₀ /mL,中和效价为1∶2 884,该抗体与体外培养的CPV呈特异性反应,CPV VP2蛋白的多克隆抗体免疫活性和特异性良好,且中和活性高,为CPV基因工程疫苗的研究和临床治疗奠定了基础。     

犬细小病毒SH14株VP2基因原核表达及免疫原性分析

根据犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)SH14株基因序列设计引物,采用PCR方法扩增CPV VP2基因,经Bam HⅠ、XhoⅠ双酶切后,将其克隆至p GEX-4T-1载体,构建重组表达载体p GEX-4T-VP2,经酶切鉴定和测序验证正确后转化大肠杆菌BL21中进行诱导表达,应用SDS-PAGE法检测蛋白的表达。然后,使用纯化的重组VP2蛋白制备其兔源多克隆抗体,分别应用蛋白免疫印迹、间接免疫荧光检测该抗体的免疫原性。结果表明,p GEX-4T-VP2能在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,所制备的兔抗CPV-VP2抗体能与重组蛋白和病毒蛋白发生特异性反应。本研究为研发CPV亚单位疫苗、检测技术及致病机理研究等奠定了物质基础。     

犬细小病毒VP2蛋白的表达及间接ELISA方法的建立

以犬细小病毒(Canine parvovirus virus,CPV)VP2基因的原核表达产物为抗原建立检测CPV抗体的间接ELISA方法.在分析CPV VP2基因稀有密码子(大肠杆菌系统)的基础上,克隆去除5'和3'端的稀有密码子的VP2基因,构建了VP2蛋白原核表达载体pET28a-VP2和pET32a-VP2,利用HIS标签对融合表达产物进行纯化.经SDS-PAGE和Western-blot检测证实该基因获得表达,并存在低相对分子质量产物,其中纯化后的pET28a-VP2具有良好的免疫学活性.以pET28a-VP2蛋白为基础,建立检测VP2抗体的iVP2-ELISA方法:抗原包被质量浓度为17.8 mg/L,血清最佳稀释度为1:20,阳性判定标准初步定为:待测样品D值>0.367,且待测样品D值/阴性样品D值>2.0.采用iVP2-ELISA对20份背景清晰的犬血清样品进行检测,结果显示,iVP2-ELISA与HI试验的阴阳性符合率一致,但不呈现正比关系.本试验为犬场CPV抗体水平检测和进行CPV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.     

犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化

参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,对CPVVP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM—T载体,获得重组质粒pGM—T—VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a—VP2,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E．coli Rosetta（DE3）中,获得了基因工程菌株E．coli Rosetta（CVP2）,并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化。结果表明纯化样品中含有87kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带。E．coli Rosetta（CVP2）以包涵体形式表达出了CPV—YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础。     

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒（canine parovirus,CPV）VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPV VP2基因插入原核表达载体pET-32a（+）中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 755 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导5 h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64 ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

猪细小病毒VP2蛋白的原核表达及其免疫原性评估

利用原核表达载体pET28a和pColdⅠ与猪细小病毒VP2基因分别构建重组表达质粒，并采用与伴侣蛋白共表达和低温诱导表达猪细小病毒VP2蛋白，并以电镜观察、血凝效价测定等进行鉴定。结果显示，2个表达载体均能对重组蛋白进行可溶性表达。冷休克载体组pColdⅠ-VP2蛋白在上清中表达效率更高且杂蛋白较少，诱导时不需要额外添加L-阿拉伯糖，表达过程工艺相对更简单。纯化后的pColdⅠ-VP2蛋白具有一定的免疫反应性，能在体外组装成病毒样颗粒(virus-like particles, VLPs),且具有血凝活性，使用206佐剂混合乳化重组蛋白免疫豚鼠后，血清中能检测到高滴度血凝抑制抗体。上述结果为进一步研究新型安全高效的猪细小病毒疫苗提供了数据支持。     

犬细小病毒南京株VP2蛋白免疫原性片段的克隆表达

以Protean软件对犬细小病毒南京株(CPV-GN)VP2蛋白的分子结构进行分析,从中筛选出具有良好免疫原性潜能的部分片段(VP2′片段),利用PrimerPremier5.0软件设计一对引物,用以该片段的扩增。将PCR扩增产物克隆入pMD18-T载体,构建了pMD-VP2′重组质粒。双酶切回收目的条带,将之亚克隆入表达载体pET32a(+),构建了重组表达质粒pET32-VP2′。转化宿主菌BL21,经IPTG诱导后成功表达了分子量约为34ku的融合蛋白。免疫转印显示,目的蛋白可被CPV-2b抗血清所识别,证明其具有与特异性抗体结合的抗原性,为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究打下基础。     

犬细小病毒核酸疫苗、重组活载体疫苗与弱毒疫苗免疫犬实验研究

分别用犬细小病毒（CPV）核酸疫苗（pVCPV-VP2）、CPV重组活载体疫苗（CAV2／CPV）与CPV弱毒疫苗对犬进行了免疫试验,以检测不同CPV疫苗的免疫原性。采用CPVELISA、CPVHI与CPV微量中和试验检测免疫犬的体液免疫水平,采用淋巴细胞转化试验检测犬的细胞免疫水平。结果,pVCPV—VP2和CAV2／CPV均能诱导机体产生抗CPVELISA抗体与抗CPV中和抗体,但是pVCPV-VP2不能诱导机体产生可检测的抗CPVHI抗体,而CAV2／CPV能够诱导机体产生抗CPVHI抗体。淋巴细胞转化试验结果,pVCPV-VP2和CAV2／CPV免疫犬的外周血淋巴细胞对ConA与CPV的刺激均出现明显的增殖反应。结果表明,pVCPV—VP2和CAV2／CPV免疫犬均能诱导机体产生抗CPV的特异性体液免疫反应和细胞免疫反应,两者所表达的VP2蛋白均具有较好的免疫原性。CAV2／CPV以及pVCPV—VP2和CAV2／CPV联合免疫犬的抗CPV体液免疫水平和细胞免疫水平均比用pVCPV—VP2单独免疫犬的体液免疫水平和细胞免疫水平高。但CAV2／CPV诱导机体产生的抗CPV特异性免疫反应仍然比CPV弱毒疫苗诱导机体产生的抗CPV特异性免疫反应弱。另外,CAV2／CPV还能诱导机体产生抗CAV-2的特异性免疫反应。     

犬细小病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

本研究以纯化的犬细小病毒(CPV)重组VP2蛋白为包被抗原,建立了检测CPV抗体的间接ELISA 方法,其抗原包被浓度为0.158μg/mL;待检血清稀释倍数为1:100,作用时间为60 min;羊抗犬酶标抗体稀释倍数为1:2 000,作用时间为60 min;底物作用时间为10 min;判定标准为S/P≥O.282时为阳性,S/P≤0.226时为阴性.该方法与犬瘟热、犬传染性肝炎、犬副粘病毒病、犬波特氏杆茵痛等4种犬常见传染病阳性血清无交叉反应,具有较好的特异性;批内、批间重复试验变异系数均小于15%,显示该方法具有良好的重复性;与商品化CPV ELISA试剂盒进行比较,符合率为96.5%.本研究为现地免疫犬群抗体监测和进行CPV流行病学调查提供了一种简便的血清学诊断方法.     

Preparation and Identification of Canine Parvovirus NY Strain VP2 Protein Polyclonal Antibody

This study was aimed to prepare canine parvovirus (CPV) VP2 protein polyclonal antibody.The recombinant expression vector pET28a-CPV-VP2 was constructed and transfromed into E.coli BL21 (DE3),the expression of recombinant proteins was induced by IPTG from which the fusion protein was identified by SDS-PAGE.The target protein was purified and emulsify with adjuvant,the prepared immunogen was inoculated into rabbit by subcutaneous injections to prepare of VP2 protein specific polyclonal antibody.The immuno-activity,titers,neutralization titers of the prepared polyclonal antibody were determined by immunoperoxidase monolayer assay (IPMA).The results showed that the expressed recombinant protein VP2 (rVP2) existed in the form of inclusion body with a molecular weight of 72 ku.The prepared polyclonal antibody titer was 1 600 dilution,the virus titer was 10⁷ TCID₅₀/mL,the neutralizing titer was 1∶2 884.The antibodies showed specific reaction with CPV.In conclusion,rVP2 specific polyclonal antibody showed wonderful immunocompetence,specificity and neutralizing activity,providing foundation for the development of genetic vaccine and clinical therapeutic method.     

白细胞介素-2基因表达质粒对犬细小病毒VP2DNA疫苗在小鼠的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒主要抗原蛋白。研究证实由VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为提高VP2DNA疫苗的免疫原性,本研究在小鼠体内尝试了利用犬白细胞介素2（cIL-2）基因增强VP2DNA疫苗免疫应答的研究。通过RT-PCR方法从犬脾淋巴细胞中分别扩增含终止密码子和不合终止密码子的cIL-2cDNA基因,然后将基因插入到真核表达载体pcDNA3．1中,分别构建成非融合的和与Myc／His融合的clL-2基因真核分泌型表达载体,pcDNA-cIL-2和pcDNA-cIL-2／MH。将pcDNA-oIL-2／MH表达栽体通过磷酸钙方法转染HEK293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达栽体能否介导cIL-2在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2表达载体（pcDNA-CD5sp-VP2,本室构建）单注射和VP2／IL-2表达载体共注射对小鼠进行免疫（用pcD-NA3．1栽体作为阴性对照）。免疫后通过ELISA方法检测免疫后不同时期小鼠血清VP2的抗体水平,并通过细胞增殖试验检测免疫后小鼠脾脏淋巴细胞的增殖反应,用ELISA方法测定小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平。试验结果表明,扩增的小鼠cIL-2基因与GenBank的参考序列一致,构建的cIL-2表达载体能够介导重组cIL-2在HEK293T细胞中进行分泌表达。免疫结果显示,利用cIL-2／VP2表达载体共免疫小鼠,免疫后35d血清中VP2的抗体水平达到1：5120,明显高于VP2表达载体单免疫组（P〈0．01）。淋巴细胞增殖试验表明,2组免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于阴性对照组（P〈0．01）,共免疫组的刺激指数又明显高于单免疫组（P〈0．05）。共免疫小鼠淋巴细胞7干扰素的表达水平明显高于单免疫组和阴性对照组（P〈0．01）。由此可见,cIL-2表达载体可明显提高CPVVP2基因疫苗的免疫应答水平。     

抗酵母表达犬细小病毒蛋白VP2的单克隆抗体的制备和鉴定

以纯化的酵母重组表达的犬细小病毒VP2单位免疫BALB／C小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,通过ELISA方法筛选,获得4株能稳定分泌抗犬细小病毒CPV结构蛋白VP2的单克隆抗体杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体中,2株属于IgG2b亚类,2株属于IgG1亚类,其腹水效价可达到1：51200和1：204800,细胞培养上清液效价可达1：256、1：512。ELISA分析表明,这些单抗仅与CPV及其VP2发生特异性反应,而与CDV和CAV-1及CAV-2没有交叉反应;荧光免疫染色病毒检测进一步表明单克隆抗体的特异性效果好。这些特异性单抗的制备为建立有效的检测犬细小病毒感染奠定了基础。     

犬细小病毒北京分离株VP2基因的表达与抗原性分析

本研究基于犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2基因序列设计引物,利用PCR技术扩增该基因。扩增的VP2基因连入表达载体pET-32a(+),经PCR及双酶切鉴定基因连入正确。重组表达载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导,SDS-PAGE及Western blotting分析表明有特异蛋白的表达,分子质量大小为87 ku。将表达的蛋白包被酶标板后用抗犬细小病毒单抗与其反应,表明表达的VP2蛋白可以与相应抗体特异结合。     

犬细小病毒北京分离株VP2基因的表达与抗原性分析

本研究基于犬细小病毒(canine parvovirus, CPV) VP2基因序列设计引物,利用PCR技术扩增该基因。扩增的VP2基因连入表达载体pET-32a(＋),经PCR及双酶切鉴定基因连入正确。重组表达载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导,SDS-PAGE及Western blotting分析表明有特异蛋白的表达,分子质量大小为87 ku。将表达的蛋白包被酶标板后用抗犬细小病毒单抗与其反应,表明表达的VP2蛋白可以与相应抗体特异结合。     

Cloning and Phylogenetic Analysis of VP2 Gene of Canine Parvovirus in Guiyang Area

This study was aimed to investigate popular genotype and phylogenesis of VP2 gene of canine parvovirus (CPV) in Guiyang area. Ten strains of viruses were isolated from Guiyang and the VP2 gene was amplified by PCR, cloned and sequenced. Results showed that the isolate virus grew could produce typical CPE in F81 cells, seven strains of CPV were CPV type 2a and others were CPV type 2c, named as GY-1 to GY-10. The nucleotide homologies of the isolated strains compared with 3 vaccine strains were 98.4% to 99.4%, with others reference strains nucleotide homologies within 97.7% to 99.9%.This research firstly reported the prevalence of CPV genotype was CPV type 2a in Guiyang area with such CPV type 2c, this was very important for monitoring the trend of CPV genetic variation and the development of vaccine.     

白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12（IL-12）基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基（P40）和小亚基（P35）cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点（IRES）序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12（P40和P35双亚基）基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫（用pcDNA3.1A作为对照）。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.01）,抗体水平在第35天高达1：5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组（P〈0.01）,VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.05）。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。     

贵阳地区犬细小病毒VP2基因的克隆及遗传进化分析

为研究贵阳地区犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）的流行基因型及其遗传进化情况,本试验对从贵阳市分离的10株CPV的VP2基因进行PCR扩增和克隆并进行序列分析。结果显示,分离的病毒能使F81猫肾细胞产生明显的细胞病变（CPE）,分离的10株病毒中,7株为CPV-2a亚型,3株为CPV-2c亚型,命名为GY-1~GY-10。10株CPV分离株与疫苗株VP2基因的同源性98.4%~99.4%,与其他国内外参考株的同源性为97.7%~99.9%。本试验首次报道贵阳市CPV的流行基因型为CPV-2a亚型并伴随CPV-2c亚型存在,对监测CPV遗传变异趋势及疫苗的研制具有重要意义。