桑叶穿孔病病叶表面的微生物分离鉴定和微型害虫调查

桑叶穿孔病是近年来新发现的桑树病害之一,目前尚未明确其病原物。2015年8月在四川省绵阳市三台县发生桑叶穿孔病的桑园观察桑树感病症状后,将采集的桑树病叶带回实验室分离、鉴定病叶上分布的微生物菌株以及微型害虫种类。采用细菌和真菌的常规分离方法,从病叶样本中分离并依据菌落特征初步鉴定的细菌有5种43株,基于细菌菌株的16S r DNA序列鉴定为成团泛菌(Pantoea agglomerans)23株、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)10株、栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)2株、Pseudomonas argentinensis 3株以及醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)5株;分离并依据菌落特征和菌株ITS r DNA序列初步鉴定的6种真菌分别是黑孢菌(Nigrospora sp.MF01)、稻黑孢菌(Nigrospora oryzae MF02)、球黑孢霉(Nigrospora sphaerica MF03)、白腐真菌(Phanerochaete sordida MF04)、拟茎点霉(Phomopsis sp.MF05)和黑附球菌(Epicoccum nigrum MF06)。另在显微镜下观察到病叶叶面有桑蓟马(Pseudodendrothrips mori)、桑粉虱(Pealius mori)、叶螨(Tetranychus sp.)和叶甲(Chrysomeloidea sp.)4种微型害虫,这些微型害虫危害桑叶的创伤可能有利于病原菌感染致病。上述结果为进一步探究桑叶穿孔病的发生机制及致病菌的鉴定积累了重要的基础信息。     

一株紫花苜蓿内生菌的分离及特性研究

从紫花苜蓿中分离出一株内生菌Y23,评价其对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑制作用。经过16S r DNA序列分析,结合菌落形态,鉴定Y23属于不动杆菌。在平板对峙实验中,该菌株对尖孢镰刀菌有抑制作用,其抑菌率为27.70%。该菌株发酵液对尖孢镰刀菌菌丝及孢子的生长也有抑制作用,可以使尖孢镰刀菌菌丝和孢子的数量明显减少,菌丝体断裂、扭曲,菌丝顶端膨大。对该菌株嗜铁素合成量进行检测,其值为0.725。结果表明,该菌株对尖孢镰刀菌有一定的抑制效果。     

微白黄链霉菌对红豆草壳二孢的拮抗效果评价

红豆草壳二孢叶斑黑茎病(Ascochyta onobrychidis)是红豆草(Onobrychis viciaefolia)最重要的病害之一,在分离此病菌的同时得到一种对此病菌具有较强抑制作用的微生物,为评价此拮抗菌的开发利用前景,本研究采用形态学、分子生物学和生物化学方法鉴定了其分类地位,并测定了其对红豆草壳二孢的抑菌效果。通过构建系统发育树并结合其形态特征和生理生化特性,将该拮抗菌鉴定为微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavu),在高氏一号培养基上菌落为黄白色,可产生黄白色水溶性色素,孢子丝钩状,顶端螺旋形;在平板对峙试验中该菌的菌落对红豆草壳二孢菌落的相对抑制率达74.33%,同时该菌发酵液对红豆草壳二孢菌丝生长和孢子萌发的抑制率分别为80.95%和93.87%。该菌具有生物防治红豆草壳二孢的开发和利用价值。     

奶牛粪中一般微生物的研究

奶牛粪中微生物很丰富,根据细菌的种类、形态和大小,采用革兰氏染色后,直接镜检,测定细菌的数量.同时,制作培养基对细菌进行培养,鉴定细菌的种类,研究细菌的致病性.共测得细菌8类.其中大肠杆菌数达到1.38× 107个/g,瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、溶纤维丁酸弧菌数达到105个/g,芽孢杆菌、双歧杆菌、粪肠球菌、反刍兽甲烷短杆菌数达到106个/g.菌落的溶血性致病性试验结果表明所检测的八类菌都为非致病菌群.结果表明奶牛粪微生物含量很丰富,种类很多,大多数的菌落都为非致病菌,是有益菌群.     

规模化奶牛养殖场空气中可培养微生物的研究

为了了解唐山地区规模化奶牛养殖场空气中微生多样性及种群分布情况,试验采用自然沉降法采集唐山市郊某规模化牧场榨乳间(NT)、贮奶厅(M)和奶牛运动场(YDC)3个不同场所的空气微生物样本并进行纯培养,分离其中的细菌和真菌,运用16S rRNA基因测序鉴定纯培养物的种属,根据菌株形态和鉴定结果选取代表菌株进行种群分布与多样性研究。结果表明:榨乳间共纯培养出26株菌,运动场共纯培养出17株菌,贮奶厅共纯培养出13株菌;榨乳间的NA培养基上的菌落总数明显多于运动场,运动场的菌落总数明显多于贮奶厅,推测可能与采样时间、场所通风、卫生情况有关。其他培养基上的菌落总数在3个不同空间也有差异。56株代表菌株分别归属于18个属,榨乳间空气样本微生物种类最为丰富,分离到包含多种芽孢杆菌、葡萄球菌和曲霉菌等10个属21种微生物;贮奶厅有8个属12种微生物;运动场筛选到10个属16种微生物。芽孢杆菌属、葡萄球菌属和曲霉菌属为3个场所的优势菌属,但不同场所条件致病菌群也存在一定的差异性。说明奶牛养殖场空气微生物种类丰富,存在的条件致病菌对人和动物有潜在健康风险。     

益生素粉剂的研制

采用凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和扣囊拟内孢霉( Endomycopsis fibuligera)为菌种,研制含有四株活菌的复合微生物粉剂。对四株菌的拮抗性、检测、发酵培养条件、耐酸碱性及耐热性、固体粉剂的保存期以及动物饲喂效果等进行了研究。在所确定的发酵条件下,研制的复合微生物粉剂中有益活菌总数2.5×109 cfu/g,菌株间不发生拮抗,对酸、碱及热有一定的耐受性,在室温干燥条件下保存期长。对猪的饲喂试验表明,该粉剂可以作为替代抗生素的添加剂,并有明显的增重效果。     

东北林蛙体表两种常驻细菌的分离鉴定

以自然状态下健康东北林蛙(Rana dybowskii)体表常驻菌群为研究对象,用无菌水漂洗掉东北林蛙体表暂住菌后,用无菌拭子收集蛙体表常驻菌并进行培养,之后对单菌落进行分离纯化。通过对菌落形态观察、生化反应管等生化方法测定及16S rDNA序列检测,两方法同时鉴定出东北林蛙体表常驻细菌2种:醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)和产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes),属于环境常见革兰氏阴性细菌。根据结果推测东北林蛙体表常驻细菌来源于环境,并对其生物体起到一定的保护作用。     

硫酸粘杆菌素微生物检定法的改进

本文以大肠杆菌标准菌株(Escherichia coli CMCC(B)44103)为检测菌,对硫酸粘杆菌素的微生物检测方法进行了研究.研究结果表明,本方法检测限为0.2μg/ml,与国外所用的以博德特氏菌ATCC4617为检测菌的检测限基本一致,其质量控制样品的日内、日间变异系数均小于10%,平均回收率94%～100.8%,并且操作简便,是一种较好的替代方法,可用于硫酸粘杆菌素的药代动力学研究或进行残留检测.     

水牛性控精液微生物分析

研究针对目前分离水牛X和Y精子性别控制过程中,容易导致微生物快速繁殖进而污染性控精液的问题,对水牛新鲜及冷冻性控精液中的微生物进行分析研究,以期改进水牛分离精子保存方法。结果表明:新鲜采集的水牛精液、常规冷冻精液及分离后的冷冻精液中,平均菌落密度分别为10 619个/mL、293个/mL和18935个/mL,三者差异显著(P0.05)。新鲜精液检测到的菌落中,革兰氏阳性球菌占48%,阴性杆菌占41%,阳性杆菌占9%,霉菌占2%;性控冷冻精液中的菌落100%为革兰氏阴性杆菌。对性控冻精菌落药敏检测发现,菌落对妥布霉素和庆大霉素均呈现耐药性,而对丁胺卡那霉素以及药物环丙氟哌酸药物敏感性较强。本研究结果,为改进水牛分离精子稀释液以及冷冻保存液中的抗生素使用提供了有价值的参考。     

蜡样芽胞杆菌显色培养基在饲料检测中的应用研究

为探讨蜡样芽胞杆菌显色培养基在饲料微生物检测中的应用,利用普通培养基和蜡样芽胞杆菌显色培养基,对60份饲料样品中蜡样芽胞杆菌进行分离培养,疑似阳性的菌落提取基因组DNA,利用PCR扩增蜡样芽胞杆菌gyr B基因进行测序验证。结果表明,普通培养基和显色培养基检出的阳性样品分别为13例(21.7%)和10例(16.7%)。通过gyr B基因测序验证普通培养基和显色培养基检测方法的假阳性率分别为76.9%和70.0%。蜡样芽胞杆菌显色培养基用于饲料中蜡样芽胞杆菌的检测,能够有效抑制其他杂菌的生长,降低普通培养基检测的假阳性率,适用于饲料中蜡样芽胞杆菌的检测。     

东方田鼠活动节律与菌落变化规律的研究

通过观察东方田鼠活动节律与空气中菌落数变化的关系以及空气中细菌种类的分布情况,旨在建立科学的东方田鼠生活环境标准。24h内每3h在不同测定点放置普通营养琼脂,暴露5m in后,37℃恒温培养48h,统计并分析结果;用血琼脂培养基检测空气中微生物并作出常规生化鉴定。结果表明:12∶00和21∶00时左右,东方田鼠饲养室内微生物数量最多;鼠笼Ⅰ日平均落下菌数为(13.95±1.41)个/皿,鼠笼Ⅱ为(18.38±1.36)个/皿,鼠笼Ⅲ为(16.67±1.26)个/皿,笼架为(14.19±1.46)个/皿。经常规生化鉴定,空气中微生物种类有嗜麦芽窄食单胞菌、表皮葡萄球菌、洛菲不动杆菌和金黄色葡萄球菌。东方田鼠经实验动物化后,其活动节律与环境条件和饲养条件密切相关,可采用人工措施调控空气中细菌数。     

基于宏基因测序的微生物饲料添加剂菌群结构及质量分析

随着饲料端全面禁抗，养殖端进入减抗、限抗时代，微生物饲料添加剂行业迎来了新的机遇。然而，如果在生产过程中控制不严，会造成产品的微生物污染，因此，需要对产品中的菌群结构进行分析，以保证产品质量。本文以4年采集的113个市售微生物饲料添加剂产品为研究对象，利用宏基因组测序、物种注释和统计学分析，研究微生物饲料添加剂产品的菌群结构和分布规律。结果表明：64.60%的微生物饲料添加剂样品存在非标识菌污染，主要表现在副地衣芽孢杆菌被误用为地衣芽孢杆菌、含有具有抑菌作用的贝莱斯芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌|污染菌中非致病菌主要是贝莱斯芽孢芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、副地衣芽孢杆菌、大肠杆菌、解淀粉芽孢杆菌、卷曲乳杆菌|致病菌主要是肺炎克雷伯菌，检出比例为5.98%|其次是蜡样芽孢杆菌，检出比例为12.82%。综上，宏基因测序技术可有效监测微生物饲料添加剂产品的菌群结构，非靶向检测产品中的污染菌。目前，产品存在检测菌种与标识不符、标识菌含量偏低、部分产品存在杂菌甚至致病菌的问题。本研究使用的非靶向研究方法和统计学得到的高频污染菌信息对微生物饲料添加剂产品的质量控制和行业监管具有重要参考意义。 [关键词] 微生物饲料添加剂|禁抗|宏基因组测序|菌群结构     

两株紫花苜蓿根际芽孢杆菌的筛选及生防效果研究

从紫花苜蓿根际土中分离出2株芽孢杆菌(Bacillus spp.)菌株CYY-6和CYY-42,并评价了其对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑制作用,及其对由尖孢镰刀菌引起的苜蓿根腐病的防治效果。经过形态观察、16S rDNA序列分析和生理生化鉴定,确定菌株CYY-6为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),CYY-42为短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)。同时检测发现这2株芽孢杆菌均能不同程度地合成嗜铁素。在平板对峙实验中,2株菌株均能对尖孢镰刀菌产生拮抗作用,并产生抑菌带,抑菌率分别为49.3%和56.3%。且其发酵液可以致使尖孢镰刀菌菌丝及孢子生长异常,出现菌丝扭曲、断裂、破碎,孢子数量明显减少等现象。在盆栽实验中,2株菌株对由尖孢镰刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的相对防效分别为57.55%和64.03%,在紫花苜蓿根腐病防治方面具有较好的应用潜力。     

利用微生物气溶胶评价鸡舍除尘间的应用效果

为研究除尘间对鸡场环境的改善状况,试验以红色荧光蛋白(RFP)基因标记大肠杆菌为指示菌,建立微生物气溶胶传播模型。利用自然沉降法在场区内均匀设置112个采样位点,每个采样位点均进行3次重复收集,以探究除尘间对环境的改善状况。结果显示:试验舍或对照舍散发出的标记菌,均可在场区70%左右布点位置收集到,其中60.94%的布点位置可收集到的标记菌菌落数,试验舍高于对照舍。除尘间内可收集到的平均标记菌菌落数高出对照舍相应位置303.82%(P<0.05)。综合结果,除尘间对舍内排出微生物气溶胶有蓄积作用,便于集中处理,建议在除尘间内加装独立喷淋降尘系统,更有效地减少微生物气溶胶污染。     

林蛙养殖场地土壤菌群结构及潜在病原菌分析

试验旨在了解林蛙养殖场地土壤菌群组成和结构特征、喷洒益生菌后的土壤菌群变化和潜在致病菌的种类与数量。试验设置3个组:养殖场地组、益生菌喷洒组和半人工养殖组,用高通量测序技术进行检测。3个试验组共获得191 588条有效序列,1 369个操作分类单元(operational taxonomic units,OTU),经分类学鉴定分属于438个属,29个门。3组样本菌群数量较大,多样性水平也相对较高。优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝细菌门(Cyanobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes);优势菌属为黄杆菌属(Flavobacterium)、热单胞菌属(Thermomonas)、Sphingopyxis、紫杆菌属(Porphyrobacter)、蓝细菌纲中未定种类(norank-c--Cyanobacteria)。各分组之间菌群多样性差异不显著,各组菌群结构相似度高。土壤中潜在的红腿病致病菌在属的水平有气单胞菌属(Aeromonas)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)。喷洒益生菌后土壤菌群变化不明显。本研究为全面了解东北林蛙养殖场地土壤微生物组成及变化、发掘有益微生物种类和东北林蛙疾病的预防和治疗提供理论依据。     

采用Illumina MiSeq测序技术分析断奶幼兔盲肠微生物群落的多样性

本试验旨在采用Illumina MiSeq测序技术分析断奶幼兔盲肠微生物群落的多样性。选取30窝同日出生、胎次相同和平均窝重相近的健康新生仔兔,于14日龄开始补饲,断奶当日(30日龄)从30窝仔兔中选取48只体重相近的健康幼兔作为试验兔,饲喂不添加抗生素的基础饲粮。分别于断奶当日及断奶后1、2和3周随机选取6只健康幼兔屠宰,无菌采集盲肠内容物,从中选取3个样本提取微生物基因组总DNA,采用Illumina MiSeq测序技术检测其中的微生物群落多样性。结果显示:1)健康幼兔盲肠微生物群落α多样性指数指标(ACE值、Chao1值、Shannnon值)随日龄的增长有升高的趋势(P0.10)。2)不同日龄健康幼兔盲肠微生物各菌门的相对丰度差异不显著(P0.05),且均主要由厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和疣微菌门组成;在科水平上,厚壁菌门主要由瘤胃球菌科和毛螺旋菌科组成,拟杆菌门主要由拟杆菌科和紫单胞菌科组成;在属水平上,拟杆菌属、Barnesiella、Akkermansia、普雷沃氏菌属和4种未知菌属为优势菌属;拟杆菌属和Parabacteroides在断奶当天的相对丰度较高,且与其他日龄组差异显著(P0.05)。3)健康幼兔盲肠中均存在乳杆菌属,且相对丰度在各日龄组间差异不显著(P0.05)。由此得出,断奶时健康幼兔盲肠微生物区系已基本建立,相对丰度最大的优势菌属为拟杆菌属,但断奶后随着日龄的增长,微生物组成趋于复杂。     

吖啶橙免疫荧光菌团培养法对沙门氏菌的快速检测

本实验通过用吖啶橙免疫荧光菌团培养法对快速检测沙门氏菌的特异性和敏感性进行了研究,对肉品模拟标本,通过先增菌再用菌团培养法进行检测,证明该检测方法对于34个菌/ml的沙门氏菌均可检出;与枯草杆菌、大肠埃希氏杆菌等八种杂菌均不形成菌团交叉。与杂菌的浓度比在1∶640之内均不受干扰。对125份样品进行检测,并与常规方法进行比较,相差不显著。运用本检测方法,30小时即可获得结果(而常规方法则一般需要4～6天),大大缩短了检测时间。所以吖啶橙免疫荧光菌团培养法对沙门氏菌的快速检测是一种敏感性高、特异性强、简便快速、所需仪器简单的检测方法。     

金昌市副猪嗜血杆菌的分离与鉴定

为确诊金昌市金川区某规模养猪场引起猪大量发病死亡的病因,以及时的找到有效的治疗方法,本研究针对该养殖场病死猪进行无菌采集组织病料,送往甘肃农业大学微生物实验室进行细菌学诊断的方法,对采集的病死猪肺脏、关节滑液、胸腔积液和心包积液进行了细菌分离纯化、染色镜检、生化鉴定和药物敏感试验等实验室检测,实验室检测结果显示组织病料抹片和细菌分离后染色镜检发现大量丝状革兰氏阴性杆菌,其生化试验结果与副猪嗜血杆菌生化特性一致,由此可以证实此次引起猪大规模发病死亡的病原微生物为副猪嗜血杆菌,经实验室药物敏感试验结果,可使用先锋霉素Ⅳ、阿米卡星等药物进行临床治疗。     

鸽乳中产纤维素酶和脂肪酶微生物的分离鉴定

旨在研究鸽乳中产纤维素酶及脂肪酶微生物的种类。通过筛选培养基分离出产酶菌株,观察其菌落形态,测定羧甲基纤维素酶、滤纸酶和脂肪酶活力,提取基因组DNA,扩增16S rDNA序列,测序结果经BLAST比对和相似性分析,构建系统发育树。结果:分离出产纤维素酶菌种4个,分别为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大肠杆菌(Escherichia coli)、吉氏库特氏菌(Kurthia gibsonii)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae);产脂肪酶菌种1个,为变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)。除吉氏库特氏菌外其他均为条件致病性菌。本试验结果将为鸽子消化道微生物多样性和产酶微生物的研究及应用奠定基础。     

培养温度、时间对饲用凝结芽孢杆菌菌数的影响

研究采用平板计数法,评估了两个团体标准（T/YNBX 024—2021,简称“云南团标”;T/CSWSL 022—2020,简称“北京团标”）操作步骤中微生物的培养温度、培养时间对饲用凝结芽孢杆菌制剂的菌数检测结果的影响,旨在为确定饲用凝结芽孢杆菌制剂菌数检测的培养温度和时间提供参考。结果显示：无论采用云南团标、还是北京团标,在40℃/24 h“低温、短时”培养条件下,平板上无菌落生长,无菌数检出数据;50℃/24 h“高温、短时”培养的检出菌数显著高于40℃/48 h“低温、长时”（P<0.05）,且50℃/24 h“高温、短时”与50℃/48 h“高温、长时”的检出菌数一致。本研究证明,平板计数法检测饲用凝结芽孢杆菌菌数受培养温度和时间影响,以培养温度为50℃、培养时间为24～48 h为宜。