IBRVgB基因TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank登陆的IBRV保守基因gB序列,利用分子生物学软件Primer Express3．0分别设计2对特异引物及其相应的TaqMan探针,优化反应体系后,建立牛传染性鼻气管炎病毒TaqMan探针荧光定量PCR检测方法。本方法利用10倍稀释的标准品进行扩增确定该方法的灵敏性,通过对伪狂犬病病毒（PRV）、马立克病病毒（MDV）等检测验证特异性,并进行临床检验。结果显示,建立的IBRVgB基因TaqMan探针荧光定量PCR检测方法的灵敏度为11个拷贝／μL,而且与PRV等非IBRV无交叉反应。本研究所建立的TaqMan探针荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏、准确、等优点,可用于IBRV的检测。     

猪伪狂犬病病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立

针对猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)gE基因保守区的核苷酸序列设计1对特异性引物和TaqMan探针,建立并优化了一种可快速、定量检测PRV野毒的TaqMan实时荧光定量PCR方法。应用该方法检测猪常见病毒性病原(猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型),PRV gE基因缺失株,以及健康猪的组织,结果均为阴性,证明该方法特异性良好。该检测方法能够检到的阳性质粒模板最低浓度为254 copies/μL,最低病毒浓度为4.22 TCID_(50)/100μL,比常规PCR敏感性高10倍;重复性试验结果表明该方法重复性良好;用TaqMan实时荧光定量PCR方法和常规PCR方法同时检测37份临床样品,其中前者检出阳性病料22份,阳性检出率为59.64%,后者检出阳性病料15份,阳性检出率为40.54%,2种方法的符合率为81.08%。综上所述,该方法的建立为PRV的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

伪狂犬病病毒实时荧光PCR的建立和应用

伪狂犬病是世界范围内严重影响养猪业发展的重要动物疫病,快速检测是有效防控该病的重要措施之一。为了建立该病的快速分子生物学检测方法,根据GenBank中登录的伪狂犬病病毒gD基因序列,选择高度保守区域设计引物和TaqMan荧光探针,通过对实时荧光PCR反应条件进行优化,建立了用于检测伪狂犬病病毒的实时荧光PCR方法。特异性试验结果表明,该检测方法只能检测到目的病毒,表明其具有良好的特异性。灵敏性试验发现,其最低检测限可达1.42pg/μL的总DNA,与PCR方法的灵敏度对比试验表明,其敏感度比PCR至少高10倍。对同一样品进行重复性检测,在组内及组间检测的荧光扩增曲线基本重叠,证实其重复性好。对180份临床样品进行伪狂犬病病毒核酸检测,结果发现有52份阳性样品。结果表明,所建立的实时荧光PCR方法可对伪狂犬病病毒进行准确、快速的检测,具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点,是开展伪狂犬病的临床检测和疫情监测工作的有力工具。     

猪细小病毒与猪伪狂犬病毒二重SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法的建立与检测

本研究旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪细小病毒与猪伪狂犬病毒的基于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增PRV gH基因与PPV NS1基因的部分片段。将测序正确的PRV gH基因与PPV NS1基因片段克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.9℃和86.5℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达248拷贝/μL和160拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。本次建立的猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PPV混合感染的临床病料进行快速诊断。     

猪伪狂犬病病毒野毒LNA探针real-time PCR检测方法的建立

本研究根据猪伪狂犬病病毒gE基因保守区域设计特异性引物和LNA-TaqMan探针,建立了基于LNA-TaqMan探针的猪伪狂犬病病毒野毒株荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的方法能够特异性的检测出猪伪狂犬病病毒野毒株;灵敏度更高,最低检测下限为10个拷贝/μL;批内变异系数和批间变异系数分别为0.43%~0.64%、0.44%~2.34%,重复性良好。对67份临床样品进行检测,病毒分离培养法检测出23份阳性样品,LNA-TaqMan探针荧光定量PCR方法检测出26份阳性样品,常规TaqMan探针法检测出21份阳性样品,与病毒分离法比较,LNA-TaqMan探针法的符合率为96%。本研究建立的基于LNA-TaqMan探针检测猪伪狂犬病病毒野毒株的荧光定量PCR方法,为猪伪狂犬病的诊断和流行病学调查提供了可靠的技术支持。     

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

为实现对伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRV gD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数（R²）分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。     

伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法的建立

为实现对伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株与gE基因缺失疫苗株的快速、敏感、特异的鉴别诊断,本试验针对PRVgD和gE基因设计了2套特异性引物和TaqMan探针,建立了PRV野毒株与gE基因缺失疫苗株的TaqMan实时荧光定量PCR鉴别方法,对引物和探针浓度、退火温度等进行了优化,对方法进行敏感性、特异性、重复性试验,并进行临床样品检测。结果显示,建立的针对gD、gE基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法线性相关系数(R2)分别为0.996和0.980,均呈良好的线性关系;检测限分别为39.4和12.1拷贝/μL;与圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应;重复性试验结果显示,针对gD基因的批内和批间变异系数分别为1.43%~1.86%、1.10%~2.07%,针对gE基因的批内和批间变异系数分别为0.98%~1.41%、1.12%~1.86%。应用建立的TaqMan实时荧光定量PCR与普通PCR分别对11份临床疑似感染样品进行检测,阳性率分别为36.4%和27.3%。结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好,可作为伪狂犬病病毒野毒株与gE基因缺失疫苗株的早期鉴别诊断和定量检测的有效手段。     

实时荧光定量PCR法检测猪伪狂犬病毒灭活疫苗抗原含量的研究

本研究根据GenBank公布的猪伪狂犬病毒gB基因保守序列设计引物和TaqMan探针,采用实时荧光定量PCR方法检测猪伪狂犬病毒灭活疫苗的抗原含量,并对方法的特异性和敏感性进行验证。结果显示:该方法灵敏度可达10~2 TCID_(50)/mL,只对猪伪狂犬病毒有特异性扩增曲线,其他4种对照病毒均为阴性;检测猪伪狂犬病毒灭活疫苗样品,结果可以反映出疫苗样品中病毒抗原含量有差异。     

伪狂犬病病毒野毒和疫苗毒双重RPA鉴别检测方法的建立和应用

为建立伪狂犬病病毒(PRV)野毒和疫苗毒的快速鉴别检测方法,本研究基于PRV gB和gE基因保守区域设计引物,建立了一种双重重组酶聚合酶扩增方法(RPA)。本研究所建立的双重RPA方法在38℃水浴锅中恒温反应20min,能够在同一个反应体系中实现对PRV野毒和疫苗毒的特异性鉴别检测,而与其它常见的猪病毒没有交叉反应。所建立的双重RPA方法对PRV gB和gE基因的检测限均为102拷贝,并且与荧光定量PCR方法检测限一致。通过对4株不同PRV株和37份临床样品的检测,结果表明双重RPA方法能够实现对不同PRV株的检测,对临床样品中PRV gB和gE基因的检出率均为45.9%(17/37),与荧光定量PCR方法检测的符合率为100%。本研究所建立的双重RPA方法反应快速、操作简便、结果可靠,可有效应用于对PRV野毒和疫苗毒的快速鉴别检测。     

猪伪狂犬病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及其冻干检测试剂的制备

猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染猪引起的一种传染病,目前在我国广泛流行。本研究针对GenBank中PRV的gE基因序列进行比较分析,在其保守区设计了特异性探针和PCR引物,通过优化反应条件,建立了可以区别野毒株和基因缺失疫苗株的TaqMan荧光定量PCR检测方法。该方法可特异性地检测出野毒感染,而对基因缺失疫苗株、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒无检测信号;对PRV检测的灵敏度可达10个模板拷贝数,是普通PCR的100倍。通过优化的冻干工艺制备出PRV全预混PCR试剂,室温25℃保存3个月或37℃保存15d,敏感性仍为10个拷贝,推测储存于4℃的有效期约为24个月;利用手持单通道荧光PCR仪,可在42 min时间内完成核酸诊断。本研究基于TaqMan荧光定量PCR检测方法,结合核酸扩增体系冻干工艺制备的PRV PCR冻干试剂具有耐保存,便于运输,准确性高等特性,对快速诊断PRV和病毒定量检测具有重要意义。     

猪伪狂犬病病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

本研究针对猪伪狂犬病病毒的gE基因序列进行分析比较,设计了一条TaqMan-MGB探针,建立了区别野毒株及基因缺失疫苗株的荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法检测猪伪狂犬病病毒特异性强,能很好的区分猪伪狂犬病病毒与其它病毒。用该方法对83份疑似样本进行检测,与常规PCR检测法符合率达到100%,表明该方法用于检测猪伪狂犬病病毒具有良好的实用性。     

猪伪狂犬病病毒套式PCR检测方法的建立与应用

对伪狂犬病病毒(PRV)国标PCR方法进行优化,建立一种高灵敏度的套式PCR方法。根据伪狂犬病病毒gD基因序列,设计并合成了2对引物,通过反应体系和条件的优化建立套式PCR方法。通过灵敏性试验、特异性试验、病料检测对比试验等验证建立方法的适用性。结果表明,建立的方法检测伪狂犬病病毒DNA的极限为2.6×10-7 ng/mL,灵敏度比国家标准方法提高了1 000倍,从疑似PRV感染组织病料中能大幅度提高阳性检出率。本研究成功建立了一种灵敏度高、特异性好的快速检测猪伪狂犬病病毒的套式PCR检测方法。     

猪伪狂犬病病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪伪狂犬病病毒（PRV）gE基因的序列（EF552427）,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增猪伪狂犬病病毒gE基因,将鉴定正确的gE基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒。以该阳性重组质粒为作为模板建立SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9999,最低检测的拷贝数为35.4拷贝/25μL,比常规PCR高10倍,特异性和重复性较好并能对样品进行定量检测等优点。本研究成功的建立了检测猪伪狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析猪伪狂犬病病毒感染程度奠定了基础。     

伪狂犬病病毒野毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据伪狂犬病病毒gE基因的序列,设计和合成了一对特异的可用于检测伪狂犬病病毒野毒的PCR引物和一条Taqman荧光探针,采用Li ght Cycl e 480荧光定量PCR仪,建立了一种可实时定量检测伪狂犬病病毒野毒的荧光定量PCR技术。该方法的线性范围为1.0×102～1.0×1010拷贝,灵敏度可达4拷贝。检测速度快,仪器的运行时间仅为1 h。对13株猪伪狂犬病病毒野毒进行了检测,结果均为阳性;与伪狂犬病gE基因缺失疫苗、猪细小病毒和鸭瘟病毒无非特异性反应。与病毒分离培养比较,该方法具有快速、灵敏、特异、定量、重复性好等优点,可望用于临床上伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒的区分,伪狂犬病病毒野毒的检测和病毒分布的研究等。     

伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据猪伪狂犬病毒gD基因的序列,设计和合成了一对特异的可用于检测伪狂犬病毒的PeR引物和一条Taqman荧光探针,采用LightCycle 480荧光定量PCR仪,建立了一种可实时定量检测猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR技术。该方法的线性范围为1．0×10^1-1．0×10^10拷贝,灵敏度可达2拷贝,比常规PCR高100倍。该方法检测时间短,速度快,仪器的运行时间仅为1h,特异性明显高于常规PCR。对15株猪伪狂犬病毒进行了检测,结果均为阳性;与猪细小病毒和鸭瘟病毒无非特异性反应。与病毒分离培养和常规PeR相比较,该方法具有快速、灵敏、特异、定量、重复性好的优点,可望用于,临床上伪狂犬病的检测和病毒分布的研究等。     

猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。     

非洲猪瘟病毒多基因家族成员MGF360-12L RPA检测方法的建立

为建立一种简便、快速的针对非洲猪瘟病毒(ASFV)多基因家族成员MGF360-12L的分子检测方法,基于MGF360-12L基因序列,设计并合成引物,建立重组酶聚合酶扩增(RPA)等温检测方法。结果表明,于35℃恒温反应30 min,即可实现对目的片段的稳定扩增;以含有MGF360-12L基因的重组质粒为模板,RPA反应的检测限达到10~3个拷贝,同普通PCR方法检测限一致;此外,该RPA方法仅特异性扩增非洲猪瘟病毒MGF360-12L基因,对PEDV、FMDV、CSFV、PRRSV、PRV 和 PCV-2基因组cDNA或DNA没有扩增。本研究建立的RPA方法操作简单、反应快速、检测成本低,能够为ASFV相关基因缺失毒株的鉴别诊断提供一定技术支持。     

鉴别猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法的建立和应用

为建立猪伪狂犬病病毒(PRV)gE基因缺失疫苗和野毒感染的快速鉴别诊断方法,本研究根据猪伪狂犬病野毒具有gD表面抗原基因和gE毒力基因,而基因缺失疫苗只有gD基因无gE基因的特性,针对gD/gE基因的5'端核苷酸序列自行设计引物,建立鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,并进行了特异性、敏感性和重复性试验;利用所建立的检测方法对临床疑似样品进行了检测.结果表明,成功建立了鉴别PRV gE基因缺失疫苗和野毒感染的二重PCR诊断方法,该方法灵敏度高,最低检出限为100拷贝/μL;重复性好;特异性强,可特异性地扩增出PRV细胞毒中的gD和gE基因及gE基因缺失疫苗毒中的gD基因,但对PK-15细胞和猪流行性腹泻病毒等其他8种病原扩增不出任何条带;自835份临床疑似PRV感染病料中共检测出PRV gD和gE基因双阳性样品即野毒感染阳性样品267份,PRV gD基因单阳性样品28份,选取该方法检测出的26份PRV野毒感染阳性样品用于病原分离培养,两种方法的符合率为96.1%.说明本试验建立的二重PCR鉴别诊断方法快速、灵敏、特异,对于临床上疫苗毒和野毒感染的快速鉴别诊断具有重要意义.     

应用双重实时荧光定量PCR方法检测鸡马立克氏病血清1型病毒

本研究建立了鸡马立克氏病血清1型病毒（MDV1）绝对定量检测方法。研究中选择MDV1特有的Meq基因的一段保守序列作为检测对象，将其克隆到质粒载体中，作为阳性标准品；同时将管家基因．鸡卵铁转蛋白（Ovo）特异性基因片段克隆到质粒载体上作为内参照的标准品。经荧光定量PCR（FQ-PCR）法扩增获得MDV1的FQ-PCR两条标准曲线，建立了MDV1双重FQ-PCR检测方法。应用该方法绝对定量检测了实验攻毒鸡及吉林省某地发病鸡只的羽髓、淋巴细胞等组织样本中单位细胞病毒拷贝数，并与琼脂扩散（AGP）、常规PCR等检测方法进行比较。结果表明，不论实验攻毒鸡还是自然发病鸡，羽髓中病毒富含量均高于其它组织，每百万宿主细胞内病毒含量为10^7～10^8拷贝；FQ-PCR检测MD发病鸡只的阳性率高于AGP，达100％；该方法的灵敏度比常规PCR检测高10～100倍，在单位细胞内可灵敏地检测到2．78个拷贝的病毒。该方法可以在不同的样品中有效的绝对定量检测MDVl。