利用Cre-loxP自动去除禽痘病毒重组体的报告基因

在含痘病毒早晚期启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因表达盒侧翼各引入1个loxP序列。以禽痘病毒282E4株作为候选载体,通过同源重组将其插入到病毒基因组的FPV030区域,获得了表达GFP的重组禽痘病毒。然后在Cre酶介导下,利用loxP位点特异性重组剪除了重组病毒基因组中的GFP报告基因。结果表明,以GFP作为筛选标记使重组病毒的构建更为简便,同时利用Cre-loxP系统可以轻松地去除报告基因。这种技术有利于其它抗原性基因重组禽痘病毒的构建。     

表达鹅副粘病毒F基因的禽痘重组病毒构建

本研究利用基因重组技术构建含有鹅副粘病毒(GPMV)主要保护性抗原F基因和LacZ报告基因的重组禽痘病毒转移载体;利用脂质体介导的方法将所构建的转移载体转染禽痘病毒(FPV)017株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),通过蓝白筛选获得重组病毒;Western blot和间接免疫荧光试验结果显示重组禽痘病毒中F基因在CEF中获得表达,并且表达产物具有良好的反应原性;本研究为进一步的研究重组禽痘病毒的免疫保护性奠定了基础.     

表达新城疫HN和F基因重组禽痘病毒的免疫效力测定

将8日龄SPF鸡随机分组.分别接种rFPVHN、rFPVF、rFPVNHF重组禽痘病毒,接种量为每只鸡105PFU,另一组群用La Sota活苗经点眼、滴鼻接种10<'6>EID<,50>.于免疫后6d、12d和18d测定HI和微量中和抗体.结果发现,3种重组病毒均能刺激鸡群产生抗新城疫病毒特异抗体,但抗体产生时间比La Sota活苗缓慢,且抗体滴度亦低.然而共表达HN和F的rFPVNHF免疫鸡群的中和抗体水平明显比rFPVHN和rFPVF组群高.表明rFPVNHF的保护性免疫更优于HN或F单基因重组禽痘病毒.     

以GPT和GFP为双重筛选标记的禽痘病毒转移载体的构建及鉴定

为研制和开发以禽痘病毒为载体的重组病毒疫苗,本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt,该载体含有gfp和gpt2种报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5,P11启动gfp和gpt两个基因,P7.5用于启动外源基因,在早期启动子P7.5下游引入NotⅡ和AftⅡ两个酶切位点.用于外源基因的插入.为检测禽痘病毒转移载体pSY681-gfp-gpt的有效性,将H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)的HA基因插入到该载体中构建转移载体pSY681-gfp-gpt-HA9,将转移载体转染已感染禽痘病毒S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞,利用gfp和gpt同时进行双重筛选、数轮蚀斑纯化后获得了重组病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,通过PCR、western blot鉴定,结果证明,获得了能稳定表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,为今后重组禽痘病毒活载体疫苗的研制奠定了基础.     

鹅细小病毒VP3基因和鹅副黏病毒F基因在重组禽痘病毒中联合表达

将重组转移载体质粒pSY681-VP3-F-LacZ与脂质体转染禽痘病毒感染的CEF细胞,通过五轮蓝斑筛选,获得纯化的重组病毒rFPV-VP3-F.经PCR检测,表明GPV-VP3基因和GPMV-F基因已重组到特异性禽痘病毒基因组中;Dot-ELISA和间接免疫荧光试验,证明VP3蛋白和F蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得有效表达并且两种蛋白都保持其反应原性.     

科研简讯

受山东省科技厅的委托,山东省农业科学院邀请有关专家于2005年12月15日在济南对山东省农业科学院家禽研究所承担的山东省科技攻关项目“新城疫、禽流感重组禽痘病毒基因工程疫苗的构建”和山东省自然科学基金项目“重组鸡α-干扰素的高效表达和应用”进行了鉴定。两项课题均顺利通过审查并受到与会专家的高度评价,研究成果均达到国内领先水平。“新城疫、禽流感重组禽痘病毒基因工程疫苗的构建”项目针对禽流感、新城疫两个危害养禽业的主要疫病,设计了以禽痘商品疫苗株为载体,利用绿色荧光蛋白为筛选标记,构建和筛选出共表达禽流感病毒H5-…     

鹅细小病毒VP3基因与鹅γ干扰素基因在重组禽痘病毒中的共表达

为了构建共表达鹅细小病毒(GPV)VP3基因与鹅IFNγ基因的重组禽痘病毒,本研究将GPV-VP3基因和鹅IFNγ基因克隆到禽痘病毒转移载体中,构建串联基因的禽痘病毒转移载体pSY-GoIFNγ-VP3,采用脂质体法将其转染禽痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞(CEF),经蓝斑法筛选重组病毒,并进行8轮蚀斑纯化,以及PCR鉴定和间接免疫荧光(IFA)分析。结果表明,所获得的重组病毒rFPV-GoIFNγ-VP3能稳定表达外源基因。本研究为进一步开展GPV重组禽痘病毒疫苗的研制奠定了基础。     

表达鹅γ干扰素重组禽痘病毒的构建及其抗病毒活性的初步研究

为研究表达鹅γ干扰素(GoIFN-γ)基因重组禽痘病毒的抗病毒活性,本研究构建了在禽痘病毒(FPV)早晚期启动子LP2EP2控制下的IFN-γ基因重组禽痘病毒转移载体,将其转染至亲本禽痘病毒S-FPV-017预感染的鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblasts,CEF),使其与禽痘病毒基因组进行同源重组,经过9轮筛选和纯化并进行PCR和间接免疫荧光检测,获得能稳定表达外源基因的重组病毒r FPV-IFNγ-LacZ。利用细胞病变抑制法检测抗病毒活性结果显示,在鸡胚成纤维细胞中重组禽痘病毒表达的IFN-γ对鹅细小病毒的复制具有显著抑制作用。本研究为制备共表达保护性抗原和γ干扰素基因的重组基因工程疫苗研究奠定基础。     

表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性

本实验为了评价表达新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒（rFPV282E4-SF，rFPV Lp-SF）的遗传稳定性，将其在鸡胚成纤维细胞连续培养20代。通过蓝斑来鉴定重组鸡痘病毒纯度，结果所有蚀斑100％变蓝。通过对第0、10和20代F基因扩增并进行序列测定，所有碱基和氨基酸序列均和原始转移载体序列完全一致，没有发生任何改变。随后又通过间接免疫荧光证实rFPV282E4-FS和rFPV LP-FS各个代次F基因的特异表达。所有结果均显示了上述重组鸡痘病毒：艮有良好的遗传稳定性，满足兽医生物制品的遗传稳定性要求。     

新城疫病毒F蛋白和禽致病性大肠杆菌OmpA嵌合蛋白的表达及双特异性抗体制备

为获得Ⅶ型新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)融合蛋白(fusion protein, F蛋白)和O18型禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)外膜基因A(outer-membrane proteases, OmpA)嵌合蛋白和双特异性抗体，试验首先采用基因合成技术获得Ⅶ型NDV F基因和O18型APEC的OmpA基因片段，使用同源重组技术将F基因插入到OmpA基因中，再将重组基因片段插入到原核表达载体pGEX-4T-1中构建嵌合表达质粒，对重组质粒中的插入基因序列进行测序鉴定；将序列正确的嵌合表达质粒转入大肠杆菌BL21(Rosetta)感受态细胞中，利用IPTG诱导嵌合蛋白表达，使用SDS-PAGE和Western-blot检验嵌合蛋白的表达情况；纯化嵌合蛋白后免疫兔获得抗血清，抗血清再经抗原亲和纯化层析柱纯化获得多克隆抗体，采用间接酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)测定抗体效价。结果表明：成功合成了Fo和OmpA1、OmpA...     

A fowlpox virus vaccine vector with insertion sites in the terminal repeats: demonstration of its efficacy using the fusion gene of Newcastle disease virus

In this paper we report the development and testing of a fowlpox virus vector system. Insertion sites in non-essential regions within the terminal inverted repeats of the virus have been characterised. Foreign genes inserted into these sites are shown to be present in two copies in the resultant recombinant virus. To test the potential use of this vector as a live vaccine the fusion gene of Newcastle disease virus (NDV) has been inserted into a vaccine strain of fowlpox virus, and inoculated into chickens. The experiments demonstrate the ability of the recombinant to protect chickens against challenge by a virulent strain of NDV and to elicit the formation of anti-fusion protein antibody.     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白重组鸡痘病毒的构建

从含有猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核衣壳蛋白（N）的质粒扩增出N基因，构建禽痘病毒转移载体。该载体含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2控制之下的PRRSVN基因、P11启动下的报告基因lacZ以及用于同源重组的禽痘病毒基因组的片段。在转移载体转染亲本病毒S—FPV-017感染的鸡胚成纤维细胞（CEF）之后，采用蓝色表型筛选的方法，筛选到表达N基因的重组病毒，并对其进行了6轮蚀斑纯化。PCR方法鉴定证明重组病毒的基因组中含有完整PRRSVN基因，间接免疫荧光试验证明了PRRSVN蛋白在重组病毒感染的CEF细胞中获得表达，本研究为猪繁殖与呼吸综合征非复制型疫苗的研制打下了基础。     

表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒的部分生物学特性研究

为了评价转基因对鸡痘病毒(FPV)生物学特性的影响,通过电镜观察表达新城疫病毒(NDV)血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)基因重组鸡痘病毒(rFPV-12LSHN)感染的鸡胚成纤维细胞(CEF).结果表明:在FPV中插入NDV HN基因后,不改变rFPV的形态、病毒成熟过程;rFPV-12LSHN与FPV在CEF上的产量无...     

Vaccination of chickens with a recombinant fowlpox virus containing the hemagglutinin-neuraminidase gene of Newcastle disease virus under the control of the fowlpox virus thymidine kinase promoter.

When chickens were vaccinated with a recombinant fowlpox virus (FPV) containing the Newcastle disease virus (NDV) hemagglutinin-neuraminidase (HN) cDNA under the control of the thymidine kinase (TK) promoter and inserted into the FPV TK gene, the FPV antibody response to the recombinant virus was similar to the response to vaccination with standard FPV, and the recombinant virus protected chickens against challenge with virulent FPV. While the presence of the NDV HN cDNA was demonstrated in the recombinant virus, which was stable on serial passage, expression of HN was not detected by hemagglutination, Western blot analysis or immunoprecipitation of infected cell lysate. Chickens vaccinated with the recombinant virus failed to mount an NDV hemagglutination-inhibition antibody response, and they did not resist challenge with velogenic NDV. It was concluded that the TK promoter was too weak to drive the HN gene, but that the insertion into the FPV TK gene did not reduce the immunogenicity of the virus.     

表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。     

鸡新城疫重组鸡痘病毒活疫苗的免疫持续期和加强免疫研究

本研究旨在评价表达新城疫病毒（NDV）血凝素-神经氨酸酶（HN）基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗的免疫持续期和加强免疫对疫苗免疫效力的影响。用rFPV-12LSHN活疫苗免疫14日龄SPF鸡,103PFU/羽,7d即可检测到NDV HI抗体应答,对NDV强毒F48E8株攻毒保护率达100%。一次免疫18周后,对NDV强毒攻击依然提供完全保护。鸡痘病毒（FPV）疫苗免疫4周,再接种rFPV-12LSHN活疫苗,攻毒保护率降低至50%。相反,rFPV-12LSHN免疫4周,随后二次免疫可显著提高对NDV的体液免疫应答水平（P〈0.01）,对NDV强毒攻击的保护率仍然为100%。结果表明,表达NDV HN基因的重组鸡痘病毒（rFPV-12LSHN）活疫苗,能够快速建立坚强免疫力,免疫持续期至少可达18周,rFPV-12LSHN的二次免疫可以提高疫苗的免疫力。     

1株鸭源Ⅰ类新城疫病毒分离株F和HN基因的分子特性分析

采用RT-PCR技术对Ⅰ类新城疫病毒(NDV)09-014分离株完整的融合蛋白(F)基因和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因进行了扩增和遗传进化分析。F基因的序列测定结果表明:该分离株F基因全长为1 792 bp,可编码553个氨基酸,裂解位点的氨基酸组成为112E-R-Q-E-R-L117,具有典型的新城疫弱毒株特征。同源性分析表明本分离株的F基因与Ⅰ类新城疫病毒代表毒株之间核苷酸的同源性为93%～95.2%,而与Ⅱ类新城疫病毒代表毒株的同源性较低,介于70.6%～72.4%。HN基因的序列测定结果表明:HN基因全长2 001 bp,可编码616个氨基酸,同源性分析表明本分离株的HN基因与Ⅰ类新城疫病毒代表毒株之间核苷酸的同源性在92.7%～94.7%之间,而与Ⅱ类新城疫病毒同源性较低,为70.7%～71.5%。根据完整的F基因和HN基因构建的遗传进化树均表明:本分离株在分类地位上属于Ⅰ类新城疫病毒基因3型,因此Ⅰ类新城疫病毒的F基因和HN基因具有相似的进化速率。     

表达鸡新城疫病毒F蛋白的重组马立克氏病毒的构建及其鉴定

为构建表达鸡新城疫病毒(NDV)融合蛋白(F)的重组马立克氏病毒(MDV),本研究采用RT-PCR方法从NDV强毒株F48E9基因组中扩增出病毒的融合蛋白F基因,构建由CMV启动子和BGH polyA组成的2.7 kb F基因表达盒。将其插入带有黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)和MDV US2同源臂的中间转移载体pUAB-gpt中获得重组MDV转移载体pUAB-gpt-wF。将该转移载体与MDV-814疫苗株感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)总DNA共转染CEF,经同源重组及gpt选择系统筛选,获得带有F基因表达盒的重组MDV(rMDV814-wF)。其体外增殖与亲本病毒没有差异。经间接免疫荧光试验、PCR、Southern-blot及western blot等试验证明,重组病毒在CEF中传至13代以上仍稳定表达NDV的F蛋白。该重组病毒的构建为MDV活载体疫苗的筛选及应用奠定了基础。