减蛋综合征病毒全基因组DNA文库的构建及物理图谱分析

Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ Ａ Ａ２ 株纯化 Ｄ Ｎ Ａ 经 Ｈｉｎｄ Ⅲ、 ＰｓｔⅠ和 Ｓｐｈ Ⅰ水解后, 分别提取 Ｄ Ｎ Ａ 片段并克隆至ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ Ｋ Ｓ（ ＋ ） 和ｐ Ｇ Ｅ Ｍ３ Ｚｆ （ ＋ ） 载体, 构建了 Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ 全基因文库。根据 Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ Ｄ Ｎ Ａ 片段和基因组 Ｄ Ｎ Ａ 电泳迁移率计算, Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ 基因组大小为３２９ｋｂ , 通过克隆片段酶谱鉴定, 杂交建立了 Ｅ Ｄ Ｓ Ｖ 限制性内切酶 Ｈｉｎｄ Ⅲ、 Ｐｓｔ Ⅰ和 Ｓｐｈ Ⅰ的物理图谱。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的高效表达

将鸡传染性支气管炎病毒（ Ｉ Ｂ Ｖ） Ｓ１ 基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆至含有起始密码 Ａ Ｔ Ｇ 的转移载体 ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４,构建成重组转移质粒 ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ,再与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ , ｇａｌ＋ ）共转染 草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞, 经空斑纯化得 到已插入 Ｓ１ 基 因并能形成多角体 的重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。以重组毒株感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,在不同时间收取感染了病毒的细胞进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ 印迹检测。 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 基因,表达产物为约 １００ ０００ 的融合蛋白,与预计的表达修饰后的产物大小相符,推测此蛋白已糖基化。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后 ４８、７２、９６ ｈ, Ｓ１ 蛋白分别占细胞内总蛋白量的 ２８７％ 、３５８％ 、３７１％ 。     

马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白D基因的分离克隆,定序及其在大肠杆…

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白（ｇＤ）抗原基因１２０９ｂｐ编码序列。将该ＰＣＲ扩增产物于ＥｃｏＲＩ和ＫｐｎⅠ位点克隆进行ｐＵＣ１８质粒载体中。将ｇＤ重组ｐＵＣ１８质粒ＤＮＡ用Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（Ｄｉｇ）标记后，在Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ中，该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的Ｂａｍ ＨＩ－Ａ克隆中的Ａ     

猪繁殖和呼吸综合征病毒基质膜蛋白和核衣壳蛋白基因的克隆与鉴定

猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）的基质膜（Ｍ）蛋白和核衣壳（Ｎ）蛋白是２种重要的结构蛋白。本试验根据ＰＲＲＳＶ美洲毒株的基因序列,设计了能够扩增Ｍ和Ｎ蛋白基因的１对引物,并在２个引物的两端分别加入ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点,经ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了一约９５０ｂｐ的目的基因片段,并将此基因克隆于ＰＢＶ２２０载体,构建了ＭＮ蛋白基因重组质粒ＰＢＶＭＮ,进一步由重组质粒回收ＭＮ基因片段亚克隆于ｐＳＫ＋（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋）测序载体,构建了重组质粒ＰＢＳＭＮ,经部分序列分析鉴定,重组质粒含ＭＮ蛋白基因。此基因的克隆为进一步研究该病毒ＭＮ蛋白免疫学特性及其分子基础和基因诊断技术奠定了基础。     

PCR结合分子杂交法检测鸡传染性支气管炎病毒

利用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）特异性扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）基因组中Ｍ基因和Ｎ基因之间一段核酸片段。以ｐＵＣ１９质粒载体将此片段克隆，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切此重组质粒，回收克隆片段后，制成生物素标记的核酸探针。用ＲＴ－ＰＣＲ及生物素核酸探针法分别对ＩＢＶ，ＩＢＤＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ及ＮＤＶ进行检测，结果证明该方法为ＩＢＶ特异性检测方法。对人工感染ＩＢＶ的ＳＰＦ鸡口腔棉拭样品进行跟踪检测，证明本方法能在ＳＰＦ鸡接毒后１～１０ｄ内检出ＩＢＶ。     

马立克氏病病毒糖蛋白B基因克隆及其在家蚕细胞中的表达

将马立克氏病病毒（ＭＤＶ）ＧＡ株基因文库中的ＢａｍＨＩＩ３和Ｋ３克隆质粒分别用双酶切消化，获得２．８ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＳａｌⅠ片段和１．１ｋｂ的ＢａｍＨＩ－ＥｃｏＲＩ片段，然后将这２个片段定向克隆于载体ｐＵＲ２２２中，构建了含ＭＤＶ糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因的重组质粒。为了基因操作方便和高效表达，设计了１对带有酶切位点的引物，用ＰＣＲ扩增了ＭＤＶｇＢ基因部分片段，并按正确方向插入去磷酸化的载体质粒中，得到起始密码子前带有ＥｃｏＲＩ酶切位点的ＭＤＶｇＢ基因克隆，再将该基因插入去磷酸化的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）转移载体ｐＢＦ１４中，ＤＮＡ序列分析确证了克隆基因及阅读柜架的正确性。以重组转移载体与野生型ＢｍＮＰＶ共转染家蚕细胞，用有限稀释法点杂交结合空斑技术纯化重组病毒。用荧光抗体试验检查重组病毒感染的家蚕细胞，可见感染细胞的胞浆及胞膜出现强荧光反应     

伪狂犬病病毒(PrV)糖蛋白gE基因在重组杆状病毒中的表达

应用ＰＣＲ方法扩增出１．８Ｋｂ的伪狂犬病毒糖蛋白ｇＥ基因,克隆到ｐＵＣ１１９中形成重组质粒ｐＲＺＥ。经测序鉴定后再将ｇＥ基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９２中,形成重组质粒ｐＶＬｇＥ。将ｐＶＬｇＥ与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－Ｂｌｕｅ ＤＮＡ）共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经三轮蚀斑纯化,获得重组病毒ｒｐＶＬｇＥ。通过ＰＣＲ方法鉴定证明ｇＥ基因正确插入到杆状病毒基因组中,直接免疫荧光试验和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ结果表明ｇＥ基因在重组杆状病毒感染的Ｓｆ９昆虫细胞中获得高效表达。表达的ｇＥ蛋白将作为伪狂犬病强毒的ｇＥ基因缺失弱毒疫苗鉴别诊断ＥＬＩＳＡ方法的抗原,为进一步扑灭伪狂犬病发挥重要作用。     

牛病毒性腹泻病毒现地分离株与疫苗株的抗原差异

用单克隆抗体（ＭＡｂ）作酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、免疫荧光试验（ＩＦＡ）、病毒中和（ＶＮ）试验及兔疫沉淀试验证明了牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）致细胞病变株８７－２５５２（现地分离）与ＮＡＤＬ和Ｓｉｎｇｅｒ（原型株）之间的抗原差异。两个抗ＢＶＤＶ８７－２５５２株的ＭＡｂ（Ｄ１１和Ｂ７）能强烈中和现地分离株，并对该病毒的４８－ＫＤａ糖蛋白呈特异性。这两个ＭＡｂ有不同的亚型，Ｄ１１为免疫球蛋白Ｇ１     

HIV—2env基因在大肠杆菌和重组痘苗病毒中的表达

将编码人Ⅱ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－２）ｅｎｖｇｐ１２０（Ｅ１）和ｇｐ３６（Ｅ２）分别克隆到原核高效表达载体ｐＥＴ１７ｂ、ｐＢＶ２２０和真核表达载体ｐ１０、ｐ１６中,构建成８个重组质粒。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析证明,在原核表达系统成功地表达了ＨＩＶ－２ｅｎｖ融合蛋白,表达的蛋白分子量分别为３５０００、７００００和５００００,而原核表达质粒ｐＥＴＥ１在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶的３５０００处可见明显的额外蛋白带。经薄层扫描测定,原核系统表达的Ｅｎｖ蛋白（ｇｐ１２０）相对含量为５．８％。在真核细胞中表达的Ｅｎｖ蛋白经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测分析,分子量分别为６００００、５７０００和４２０００。上述表达的Ｅｎｖ蛋白均能与ＨＩＶ－２阳性血清发生特异性反应。重组痘苗病毒可诱导小鼠产生抗ＨＩＶ－２Ｅｎｖ抗体     

狂犬病病毒糖蛋白基因在原核细胞中的表达

将狂犬病病毒糖蛋白（ＲＶｇｐ）基因ＢｇｌⅡ片段（１６７５ｂｐ）分别正向插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－１７ｂ和ｐＥＴ－１７ｂ２（用ＳａｃⅠ－ＮｄｅⅠ缺失掉ｐＥＴ－１７ｂ６０ｂｐ含起始密码子ＡＴＧ小片段）的ＢａｍＨⅠ切点，构建重组质粒ｐＥＴ－１７ｂＲＶｇｐ和ｐＥＴ－１７ｂ２ＲＶｇｐ。将其分别转化表达受体菌Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）和Ｅ，ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ．ＩＰＴＧ诱导表达，菌体经超声波裂解处理后ＳＤＳ－ｐＡＧＥ，染色，在分子量约６００００处可见重组质粒表达的较宽的蛋白带，以抗ＲＶｇｐＭｃＡｂ进行Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ检测，表明该表达蛋白为ＲＶｇｐ。通过扫描显示，表达的ＲＶｇｐ占菌体总蛋白的１０％～１４％，其中ｐＥＴ－１７ｂ２ＲＶｇｐ在Ｅ。ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中的表达量最高。     

伪狂犬病病毒Fa株gD基因的克隆及序列分析

本研究从含有伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)Ea株gD基因BamHI 6.6Kb片段的重组质粒pUCB7中分别亚克隆gD基因的上、下游片段，并对上游片段进一步改造，去掉gD基因上游的非编码序列，构建了含完整gD基因编码区的重组质粒pBRgDI，并利用基因内部的限制性内切酶位点，用内切酶KpnI和SalI酶切分析，证实了gD基因的可靠性和完整性。同时构建了测序质粒pSKgDSB和pSKgDS，并用双脱氧终止法进行测序。将测序结果与国外的Rice毒株进行比较，发现Ea株gD基因核苷酸序列有多处点突变和一处插入突变，在编码氨基酸残基水平上也有差异。     

鸡贫血病毒荷兰弱毒株基因序列比较研究

用ＣＡ５、ＣＡ６和ＣＡ７、ＣＡ８两对引物对鸡贫血病毒荷兰弱毒株进行ＰＣＲ扩增。将扩增产物１．５ｋｂ和０．８ｋｂ的ＤＮＡ片段分别克隆到ＰＵＣ１１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ载体质粒中,并进行核苷酸序列分析。通过与２６Ｐ４毒株进行核苷酸序列比较发现二者有３２个核苷酸的差异。荷兰和２６Ｐ４两毒株间ＶＰＩ蛋白质同源率为９７％,没有发生特异性变化;ＶＰ３蛋白质同源率为９５％,在Ｉ￣３０个氨基酸之间发生了特异性     

A cloned DNA probe for the detection of Mycobacterium paratuberculosis

DNA extracted from Mycobacterium paratuberculosis, which had been isolated from a cow with clinical Johne's disease, was used to make a gene library in the Escherichia Coli expression vector phage lambda gt11. Plaque-lifts were made from the library onto nitrocellulose membranes. These were screened by differential hybridization using radiolabelled chromosomal DNA from M. paratuberculosis and Mycobacterium phlei. By this method six recombinants that hybridized to M. paratuberculosis but not to M. phlei were identified. Three of these, designated lambda gt-R3, lambda gt-R4 and lambda gt-RS, containing DNA inserts of 2.5,1.5 and 3.7 kilobases (kb), respectively, were chosen for further analysis of their insert specificities. Following restriction with the endonucleases EcoRI and BamHI, the digestion fragments from the three recombinants were transferred to nitrocellulose membranes and probed with radiolabelled DNA from M. paratuberculosis and M. phlei. As expected, M. paratuberculosis DNA hybridized to all the fragments. M. phlei DNA hybridized to both the fragments that were generated from lambda gt-R3, to the single fragment from lambda gt-R4 and to two of the three fragments generated from lambda gt-RS. The fragment with which M. phlei DNA failed to hybridize was 0.45 kb in length. Multiple copies of this fragment were made in the plasmid pGEM-2; the plasmid DNA was then harvested and radiolabelled. Designated PAM-1, the radiolabelled material hybridized to a 3.7 kb fragment of EcoRI-digested M. paratuberculosis and to 2.2 kb fragments of similarly digested M. avium serovars 2 and 3. PAM-1 did not hybridize to DNA from the other four mycobacterial species examined or from Nocardia asteroides. The restriction fragment length polymorphism thus demonstrated distinguishes M. paratuberculosis from M. avium serovars 2 and 3.     

A physical map of the 85 kb virulence plasmid of Rhodococcus equi 103.

A physical map of the 85 kb virulence plasmid pOTS from Rhodococcus equi 103 was constructed. The restriction map contains 2 AsnI, 5 BglII, 9 EcoRI, 4 HindIII, and 3 XbaI sites. The positions of the EcoRI and HindIII of pOTS are identical to that of the 85 kb virulence plasmid of R. equi ATCC 33701 reported recently by others. EcoRI restriction fragment sizes were similar in the 85 kb plasmids isolated from 4 horse derived R. equi but, except apparently for the 28.3 and possibly 2.0 and 1.5 kb fragments, were different in an 80.1 kb plasmid isolated from a pig source R. equi.     

鸡贫血病毒衣壳蛋白VP1基因的克隆、原核表达和纯化

根据GenBank中CAV哈尔滨分离株基因序列,设计出针对CAV VP1大片段(608 bp)的引物,利用PCR方法从CAV基因组序列中扩增出VP1基因的大片段(608 bp),按照正确的读码框克隆到原核表达载体pET32a( )上,得到含VP1大片段的pET32a( )重组子,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,经SDS-PAGE和Western blotting检测发现有分子质量约42 ku的融合蛋白表达,与预期分子质量大小一致,通过Ni亲和层析柱纯化出融合蛋白,经Western blotting鉴定,融合蛋白与His单抗能够结合.CAV VP1基因的克隆表达及其融合蛋白的纯化为后续制备多克隆抗体和单克隆抗体提供了良好的抗原来源,也为研究VP1与其他CAV蛋白之间的相互关系奠定了基础.     

传染性法氏囊病病毒变异株主要免疫原基因cDNA的克隆及鉴定

采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），从１株传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）本地分离株ＧＺ９０２中扩增到编码ＩＢＤＶ主要免疫蛋白ＶＰ２的ｃＤＮＡ片断，大小约为１３５０ｂｐ。将该ｃＤＮＡ片断插入ｐＢｓＫ质粒中，用重组质粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，成功获得重组质粒转化菌。对重组质粒ＤＮＡ进行酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片断与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相符。对ＧＺ９０２高可变区进行了序列分析。其核苷酸序列与３株ＩＢ－ＤＶ变异株Ａ、ＧＬＳ、Ｅ的同源性分别达到９８．９％，９６．２％和９５．５％。而与其他Ⅰ型毒株的同源性较低。比较从ＤＮＡ序列推导出的氨基酸序列，发现ＧＺ９０２高可变区的两个亲水区均发生了一个氨基酸的变化，而在２４９和２５４位上的氨基酸分别为Ｋ和Ｓ，与以上３个变异株相同，但与所有标准Ⅰ型毒株不同。这两个氨基酸可以作为ＩＢＤＶ变异株的标志。     

伪狂犬病病毒Ea株Us9基因的克隆与序列分析

对含伪狂犬病病毒Ea株BamH17片段的质粒pUC6.6进行亚克隆，构建了仅含Us9基因约0.6kb片段的重组质粒pSKMN0.6。双脱氧末端终止法进行双链测序，结果表明：Us9存在2种可能的同C-末端的编码形式，分别编码106或98个氨基酸残基，Us9基因与其下游的Us2(28K)基因之间存在约200bp的非转录区，将Ea株Us9基因序列同国外Rice株进行没源比较，发现二者在组成和结构上存在多处保守序列，尤其是潜在的酪氨酸磷酸化位点，C-端疏水性氨基酸以及由连续6个带正电荷的精氨酸残基组成的核定位信号序列，但在N-糖基化位点以及丝氨酸含量上存在较大差异。     

鸡痘病毒282E4弱毒株TK基因限制性酶切图谱分析

以限制性内切酶ＢａｍＨＩ、Ｘｂａｌ、Ｃｌａｌ、Ｈ１ｎｄⅢ、Ｎｃａｌ对含有鸡痘病毒（ＦＰＶ）２８２Ｅ４弱毒株３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段的重组质粒ｐＳＬ１进行单酶和它们之间双酶酶切。结果表明：３．７ｋｂＨｉｎｄⅢＴＫ基因片段上有２个Ｃｌａｌ切点，２个Ｘｂａｌ切点，１个Ｎｃａｌ切点，没有ＢａｍＨＩ切点。随后，用澳大利亚ＦＰＶ２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋ＣｌａｌＴＫ基因作探针，对各种酶切片段进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，进一步确定ＴＫ基因位于２．２ｋｂＨｉｎｄⅢ＋Ｃｌａｌ片段中。杂交结果与限制性酶切图谱分析结果相一致。该基因的限制性酶切图谱与澳大利亚ＦＰＶ疫苗株的基本相同。