抗鸡白痢沙门氏菌单抗及其在鸡白痢病检疫中的应用研究

本研究应用淋巴细胞杂交瘤技术制备了一组针对鸡白痢沙门氏菌O_9抗原的单抗。以单抗3-47-26酶结合物和鸡白痢沙门氏菌脂多糖抗原建立了一种抗体竞争ELISA试验以检疫鸡白痢病,该法通过样品抑制酶标单抗与LPS的结合,以检测鸡白痢抗体。试验结果表明,79份鸡白痢阳性血清具有显著抑制作用(95.0±4.3％),而130份鸡白痢阴性血清以及48份SPF鸡血清抑制不明显,它们的抑制率分别为12.3±10.6％和6.2±5.5％。对94份种鸡血清的检疫结果表明,抗体竞争ELISA比PAT、AGPT、PHA敏感和特异,并进一步讨论了该法在血清流行病学调查方面的应用前景。     

单抗竞争EILSA试验及其在鸡白痢病检疫中的应用

应用针对沙门氏菌 O_9抗原的单抗3-47-26酶结合物和鸡白痢沙门氏菌脂多糖抗原建立了一种单抗竞争 ELISA试验,以检测鸡白痢抗体.试验结果表明,79份鸡白痢阳性血清具有显著抑制作用,而130份鸡白痢阴性血清以及48份 SPF 鸡血清抑制不明显.对94份种鸡血清的检疫结果表明,单抗竞争 ELISA 比 PAT、AGPD、PHA 特异性好、敏感性高,文中进一步讨论了该法的应用前景.     

ELISA 检测新城疫病毒抗体

用鸡红细胞凝集解脱法提纯的新城疫病毒(NDV)抗原包被酶标板,最适抗原浓度为0.1μg～8μg/孔;鸡血清的最适稀释倍数为1:400.该抗原与马立克氏病等七种禽病抗血清不发生交叉反应.与血凝抑制试验(HI)比较.在检测的233份血清样本中,ELISA 阳性124份(占53%);HI 效价1:8以上者为84份(占36%);84份 HI 阳性样品,ELISA 亦为阳性;40份 HI 阴性样品,ELISA却为阳性;没有 ELISA 阴性而 HI 阳性的样本.两法可追求检测结果一致的为193/233(占83%).     

传染性支气管炎病毒(M41株)HI试验抗原的特异性和敏感性试验

采用本研究室制备的3批传染性支气管炎病毒(IBV,M41株)HI试验抗原,分别对100份和80份不同鸡血清进行IBV HI抗体检测,同时用IBV ELISA抗体检测试剂盒进行检测,比较两种不同方法检测的特异性和敏感性。结果显示,特异性试验中80份SPF鸡血清,自制抗原检测均为阴性,IBV ELISA检测79份为阴性,10份其他鸡病血清,两种方法检测9份均为阴性,10份IBV阳性血清两种方法检测均为阳性;敏感性试验中,74份已知IB疫苗免疫或IBV M41株感染鸡血清IBV HI检测72份为阳性,阳性检出率为97.3%(72/74),IBV ELISA检测74份均为阳性,阳性检出率为100%(74/74),SPF鸡血清及其他鸡病血清,两种方法检测均为阴性,两种检测方法总符合率为97.5%,差异不显著(P0.05)。试验结果证明,本研究室自制抗原具有良好的特异性,特异性为100%,抗原同时具有良好的敏感性,但IBV ELISA方法的敏感性要高于IBV HI方法。     

应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测鸡毒霉形体和滑液霉形体抗体的研究

用 ELISA 检测鸡毒霉形体和滑液霉形体抗体,试验结果表明:用滑液霉形体抗原对人工感染的31份滑液霉形体阳性血清进行 ELISA 检测,结果全为阳性反应,用鸡毒霉形体抗原对18份鸡毒霉形体阳性血清进行 ELISA 检测也全为阳性反应;滑液霉形体和鸡毒霉形体两种抗原对20份鸡毒霉形体和滑液霉形体阴性血清的 ELISA 检测结果皆为阴性反应。符合率为100%。用鸡毒霉形体抗原对野外收集的60份鸡血清进行了检测,33份呈阳性反应,占55%;27份为阴性反应,占45%,用滑液霉形体抗原对63份鸡血清进行检测,37份呈阳性反应,占59%;26份为阴性反应,占41%。用7份人工感染的滑液霉形体阳性血清进行ELISA 与血凝抑制试验的比较结果表明:ELISA 的灵敏度比血凝抑制试验的高4—16倍。在本试验中,用霉形体的菌体抗原和用 SDS 溶解菌体后提纯的膜抗原均得到了相同的结果,本报告主要是报道菌体抗原的结果。作者同时用此法对鸡毒霉形体和滑液霉形体单克隆抗体进行检测筛选,同样取得了令人满意的结果。不足的是,在进行 ELISA 检测时,鸡毒霉形体和滑液霉形体之间存在有交叉反应。     

鸡肠炎沙门氏菌感染监测

肠炎沙门氏菌 (SE)是引起人类食物中毒的重要病原之一。为了准确有效地监测鸡群肠炎沙门氏菌感染情况，日本学者建立了一种 ELISA试验，用于检测 SE特异性血清抗体。该方法包被抗原为无鞭毛的 SE抗原。试验检测血清来自某一 SE分离阳性鸡群。检测结果表明该方法的阳性率为 70％，而快速平板凝集试验 (RPA)的阳性率为 60％，以有鞭毛 SE作抗原的商品 ELISA试剂盒的阳性率为 30％。在第一次监测后约 100天，再次用三种方法检测鸡群的血样，由于 SE感染鸡变成隐性带菌鸡，因此，未分离到 SE。商品 ELISA试剂盒的阳性率为 0， RPA…     

酶标单抗阻断ELISA检测鸡白痢和鸡伤寒抗体

以辣根过氧化物酶标记的沙门氏菌O9单抗3-47-0与包被的鸡白痢沙门氏菌脂多糖抗原建立了一种抗体阻断EL ISA以检测鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌感染。该方法基于待检血清样品抑制酶标单抗与脂多糖的结合,以检测鸡白痢和鸡伤寒特异性抗体。对72份已知鸡白痢阳性血清(抑制率为(98.5±4.0)%)、54份已知鸡白痢阴性血清(抑制率为(15.3±8.0)%)、42份SPF鸡血清(抑制率为(0.8±7.2)%)检测的结果表明,该方法具有很强的区分能力。在人工感染试验中,从第2周开始,该方法能从全部鸡只中检测到特异性抗体,比全血玻板凝集试验(PAT)早1周时间。对344份种鸡血清的检测结果表明,单抗阻断EL ISA比PAT特异性好、敏感性高。另外,该方法也能检测出与鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌有共同抗原的沙门氏菌感染产生的抗体。     

用间接ELISA法检测鸡痘病毒抗体的研究

建立了检测鸡痘病毒抗体的间接ELISA方法，用该法检测20份人工感染鸡血清样品，抗体阳性率为100％，康复期鸡群血清抗体阳性率为43％，人工接种弱毒疫苗65d和170d鸡群血清抗体的阳性率分别为60％、70％。经反复试验，确定了诊断抗原的制备方法和间接ELISA检测鸡痘抗体的最佳反应条件，即抗原包被浓度10．8μg／孔，待测血清最佳稀释度为1：100。     

检测禽流感病毒抗体的重组核蛋白间接ELISA方法的建立

以大肠杆菌系统表达的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）为抗原，建立了禽流感间接酶联免疫吸附试验抗体检测技术（NP—ELISA）。对263份待检血清（包括临床收集的243份血清和20份H9N2亚型AIV免疫鸡阳性血清）进行检测，NP—ELISA与琼脂免疫扩散试验（AGP）的总符合率为83．3％，与血凝抑制试验（HI）的总符合率为92％。特异性试验表明，NP—ELISA方法可以检测H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体，检测为阳性的血清样品能够被阳性鸡胚尿囊液阻断。敏感性试验证实，NP—ELISA最早可以检测鸡感染后7d的血清样品，并于感染后10d确定100％血清阳性，而AGP检测直到首免后21～28d才出现部分血清阳性，HI检测直到10～14d才出现部分血清阳性，并且NP-ELISA要比HI敏感4～40倍。试验证明，NP—ELISA是检测AIV血清型特异性抗体的一种特异、敏感、快速、经济的血清学检测技术。     

Ⅰ群禽腺病毒五邻体蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立一种简便、快速检测Ⅰ群禽腺病毒(FAVI)抗体的间接ELISA方法,以表达和纯化的FAVI五邻体重组蛋白作为抗原,优化反应条件,建立了FAVI间接penton-ELISA抗体检测的方法。抗原最佳包被浓度为1.5μg/孔,最适包被条件为37℃,2h后4℃过夜;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗的最佳工作浓度为1∶2000;ELISA阴、阳性临界值为0.335。用penton-ELISA方法检测100份鸡血清样品,阳性率为41%。     

沙门氏菌fimY基因的原核表达及禽沙门氏菌抗体检测ELISA研究

为研发禽沙门氏菌抗体检测方法,采用大肠杆菌系统表达沙门氏菌属保守的菌毛fimY基因,纯化的目的蛋白经Western blot分析,能与免疫鸡血清和感染鸡血清产生特异性反应条带,证明该重组蛋白既有反应原性也有免疫原性。以此纯化蛋白为抗原建立了间接ELISA(fimY-ELISA)。通过检验已知沙门氏菌鸡源血清、相关非沙门氏菌鸡源血清对fimY-ELISA进行评价,发现其在敏感性方面高于快速平板凝集试验(RPA)和自制的脂多糖抗原ELISA(LPS-ELISA)、肠炎沙门氏菌抗原ELISA(SE-ELISA),但在特异性方面不如LPS抗原ELISA;在与RPA的符合率方面与LPS-ELISA、SE-ELISA基本一致。     

大理州鸡沙门氏菌血清学调查

为了解大理州鸡群沙门氏菌的感染情况,从大理州9个县(市)的规模化养鸡场及散养场(户),随机采集鸡的血清样本1424份,进行鸡沙门氏菌血清学相关检测.结果:1424份血清样品中,检出阳性样品469份,平均阳性率为32.94％.其中规模化养鸡场检测数为1055份,阳性318份,阳性率为30.14％;散养场(户)17家,抽检...     

鸭源鸡杆菌平板凝集检测方法的建立与应用

为建立一种方便、快捷的鸭源鸡杆菌血清抗体诊断方法,通过用鸭源鸡杆菌YT-1株制备抗原,然后免疫健康家兔制备阴阳性血清,建立了鸭源鸡杆菌平板凝集检测方法,并进行特异性试验,确定抗原最佳工作浓度,同时用该方法进行临床样品检测。结果显示：鸭源鸡杆菌染色抗原与鸡源阳性血清产生明显凝集,而与鸡源阴性血清以及鸡大肠杆菌、鸡沙门氏菌、副鸡嗜血杆菌、禽流感病毒、鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒和禽腺病毒等病原的阳性血清均不凝集;当抗原浓度为5×109 CFU/mL时,抗原与血清凝集最佳。结果表明,建立的鸭源鸡杆菌血清抗体平板凝集试验方法具有良好的特异性,可用于开产前后鸡群鸭源鸡杆菌的检测评估及流行病学调查。     

不同检测材料对ELISA检测禽白血病病毒-p27抗原结果的影响

为探讨不同检测材料对ELISA检测禽白血病病毒(ALV)-p27抗原结果的影响,试验首先对180日龄地方品种母鸡的泄殖腔棉拭子ALV-p27抗原进行ELISA检测,选取部分阳性鸡和阴性鸡进行分组试验,采用ELISA对试验鸡血清、蛋清和病毒分离的细胞培养液进行ALV-p27抗原检测,采用RT-PCR方法检测血液ALV特异性基因。结果显示,阳性组中以血清、蛋清和细胞培养液作为ELISA ALV-p27抗原检测材料,其检测阳性率均低于泄殖腔棉拭子,血清检测的阳性个体包含全部蛋清和细胞培养液ELISA检测的阳性个体。ELISA检测数据的相关性分析显示,只有血清和细胞培养液检测数据间存在显著性相关,线性关系方程为Y(细胞上清)=1.8439X(血清)-0.1469,R²=0.937;阳性组中ALV-p27基因检测阳性率低于泄殖腔棉拭子,但高于血清、蛋清和细胞培养液,其包含所有血清ELISA检测的阳性样品;外源性ALV-J gp85基因阳性率仅为29.17%,且阳性样品均属于血清ELISA阳性样品。综上所述,成年鸡以泄殖腔棉拭子作为ELISA ALV-p27抗原检测材料存在假阳性结果,蛋清和细胞培养液作为检测材料存在漏检的可能,血清作为ELISA检测材能够更准确地反映成年鸡群ALV感染状态。     

鸡白痢沙门氏菌阳性血清国家标准品制备用菌株的筛选

为了制备鸡白痢沙门氏菌阳性血清标准型国家标准品及鸡白痢沙门氏菌阳性血清变异型国家标准品,对中国兽医微生物菌种保藏管理中心保藏的10株来源背景清晰的鸡白痢沙门氏菌菌株的形态、生化特性、培养特性、血清学特性、抗原性进行了鉴定,并进行了变异检查及沙门氏菌基于inv A基因的PCR检测。结果表明,CVCC79201株及CVCC79207株分别符合鸡白痢沙门氏菌标准型菌株及变异型菌株的特性,CVCC79201株菌制备的抗原与WHO标准实验室提供的AntiS.Pullorum Serum(S)及Anti-S.Pullorum Serum(V)国际标准品的强阳性血清和弱阳性血清均能发生100%凝集,CVCC79207株菌制备的抗原与Anti-S.Pullorum Serum(S)国际标准品的弱阳性血清发生75%凝集,与Anti-S.Pullorum Serum(S)国际标准品的强阳性血清及Anti-S.Pullorum Serum(V)国际标准品的强阳性血清和弱阳性血清均能发生100%凝集。用其制备免疫抗原免疫家兔后获得的阳性血清效价较高于鸡白痢沙门氏菌阳性血清国际标准品。结果证明,CVCC79201株及CVCC79207株可分别用于制备鸡白痢沙门氏菌阳性血清标准型国家标准品及鸡白痢沙门氏菌阳性血清变异型国家标准品。     

斑点免疫金渗滤法检测鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌抗体的应用研究

将鸡伤寒沙门氏菌LPS抗原包被于渗滤盒检测区（T区），针对沙门氏菌O9抗原单克隆抗体3-47-0包被在质控区（C区），用胶体金标记鸡伤寒沙门氏菌LPS抗原，建立了一种抗原夹心法快速检测鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌抗体的斑点免疫金渗滤法（DIGFA）。DIGFA比玻板凝集试验（PAT）灵敏度高，人工感染鸡试验表明在感染后第7d即可从32只鸡中的7只检测到抗体，在时间上早于PAT。722份现场血清样品的检疫结果表明，DIGFA的阳性检出率稍高于PAT，阳性样品抗体几何平均滴度DIGFA大于PAT法（P〈0．05）。DIGFA的结果得到细菌分离试验的验证。这些结果表明DIGFA快速、灵敏、准确，为鸡伤寒和鸡白痢的检疫提供了一个新的有效手段。     

应用斑点酶联免疫吸附试验诊断猪旋毛虫病的研究

利用差速离心,TritonX-100处理,超速离心,在国内首次制得旋毛虫S_3抗原,其抗原性优于ES抗原。用该抗原建立诊断猪旋毛虫病的Dot-ELISA比常规ELISA敏感,与猪囊虫血清、猪弓形虫血清无交叉反应。对70份感染猪旋毛虫的阳性血清进行Dot-ELISA和常规ELISA检测,分别检出68份和66份,阳性符合率分别为97.1％和94.3％。对182份采自非疫区的被检仔猪血清进行检测,均末出现阳性,阴性符合率为100％。结果表明,Dot-ELISA除和常规ELISA一样具有敏感性高、特异性强、稳定性好等优点外,还具有快速简便的优点。     

应用间接ELISA检测鸡痘病毒抗体方法的建立

应用鸡胚成纤维细胞(CEF)扩增鸡痘病毒(Fowlpox virus,FPV)并提纯后作为抗原建立了具有较高特异性和灵敏性的间接ELISA方法.通过方阵滴定法来确定抗原最佳包被浓度为2.7μg/孔,待检血清最佳稀释倍数为1:100,其阳性临界值为OD≥0.113.将400份FPV免疫实验鸡血清用本方法进行检测,其阳性检出率为81.25%(325/400).此外,将该方法与琼脂扩散试验进行比较检测血清样品,结果显示本方法的灵敏度比琼脂扩散试验灵敏400～800倍,而且还有特异性强,操作简便、快速等优点.     

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)ELISA检测方法的建立

利用抗J亚群禽白血病病毒（ALV—J）囊膜蛋白特异性单克隆抗体JE9，建立了检测ALV—J env抗原抗体免疫复合物的ELISA方法。应用该方法检测SPF鸡血清、鸡抗禽流感H9亚型阳性血清、鸡沙门氏菌阳性血清、鸡腺病毒阳性血清、鸡新城疫阳性血清．结果均为阴性，无交叉反应；抗ALV—J阳性血清与ALV—J特异性单克隆抗体JE9能相互阻断；ALV—J阳性血清经酸处理后，ELISA检测的D490差值明显下降。对部分攻毒鸡血清样本及田间ALV—J阳性血清样本进行电镜观察，可见ALV—J样病毒粒子及ALV—J样免疫复合物。经与间接免疫荧光（IFA）检测ALV—J env抗体结果比较表明，建立的ELISA方法与IFA方法两者具有较好的群体符合率，群体符合率为8／9。这些结果表明，本研究建立的ELISA方法在ALV—J的诊断中具有很好的应用前景。     

2006--2012年广西鸡沙门氏菌感染情况调查

运用分子生物学、血清学以及病原分离鉴定等多种方法，对2006～2012年广西规模养殖场、农村散养鸡以及活禽市场鸡血清和组织样本进行鸡白痢-伤寒沙门氏菌抗体和沙门氏菌病原检测和鉴定。结果发现，血清样本中规模场鸡白痢伤寒抗体阳性率较低，平均为2．16％，其中种公鸡的阳性率平均为1．55％，核心群母鸡阳性率平均为1．66％，生产群母鸡阳性率平均为4．16％；但广西农村散养鸡和活禽市场鸡白痢-伤寒沙门氏菌的污染情况不容乐观，其中农村散养鸡白痢-伤寒沙门氏菌阳性率为21．78％～24％，平均为22．52％（320/1421），活禽市场鸡阳性率为20．81％～33．2％，平均达到27．51％（2800/10177）；发病鸡的组织样品沙门氏菌平均阳性率为4．9％（29/592），阳性株以伤寒沙门氏菌为主，共13株占44．83％（13/29），其次为亚利桑那沙门氏菌8株，占27．59％（8/29），第三种是沙门氏菌的某些亚种（无法定型），最少为猪霍乱沙门氏菌2株，占6．9％（2/29）。