植物源病毒抑制剂VFB诱导烟草抗烟草花叶病毒机理的初步研究

 为揭示植物源病毒抑制剂VFB的抗病毒机理,本研究以VFB对烟草花叶病毒(TMV)进行预防和治疗处理,测定了烟草中与抗病毒性相关的部分生理生化指标的变化。结果表明:VFB的2种处理方式均可使普通烟体内的叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、总酚及类黄酮含量升高,使普通烟体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性增强,预防处理优于治疗处理。可见,VFB可诱导植物产生抗病性,增强烟草对TMV侵染的抵抗力。     

海带多糖对烟草花叶病毒的抑制作用及其对烟草酶活性的影响

为明确海带多糖抗病毒剂对烟草抗烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）病的诱导抗性及其对TMV感染后的保护作用,采用间接酶联免疫吸附法（ELISA）研究0.5 mg/mL海带多糖水剂、0.5 mg/mL香菇多糖水剂、6.25 mg/L氨基寡糖素水剂和0.1 mg/mL盐酸吗啉胍.铜可湿性粉剂对TMV侵染的预防保护作用和对TMV感染植株的治疗作用,并检测施用海带多糖后烟草体内过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化和海带多糖对感染TMV后烟草叶绿素含量的影响。接种前喷施0.5 mg/mL海带多糖后,再接种TMV病毒,其抑制率可达42.42%,与喷施6.25 mg/L氨基寡糖素抑制率44.96%的效果相当,预防保护作用较好;但两种药剂处理感病植株的治疗效果较差,其抑制率仅分别为38.93%和40.13%。海带多糖能够系统地诱导烟草体内POD、PAL及SOD活性,从而控制了感染TMV后烟草叶绿素含量下降。说明海带多糖可诱导植物产生抗病性。     

枯草芽孢杆菌Tpb55抗烟草普通花叶病毒活性研究

利用三生-NN烟测定Tpb55菌悬液对烟草普通花叶病毒(TMV)钝化、预防和治疗作用结果表明,Tpb55菌悬液对TMV具有较好的钝化、预防和治疗效果,枯斑抑制率分别为96.15%、79.72%和65.71%。为进一步揭示Tpb55抗毒机理,选用易感TMV烟草品种K326为实验材料,研究以Tpb55对烟草花叶病毒(TMV)进行预防和治疗处理,测定烟草中与抗病毒性相关的部分生理生化指标的变化。结果表明,先用Tpb55菌液再接种毒液处理的烟株,对TMV的抑制作用优于先接种毒液再接种菌悬液处理,说明Tpb55对TMV的预防具有积极效果;不论在烟株接种毒液前或后,用Tpb55菌液处理烟株的叶片与只接种毒液的相比,叶片内过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性均显著提高,以接毒前Tpb55菌液处理的烟株活性水平最高。从本试验结果来看,Tpb55具较强的抗TMV活性,可通过直接接触钝化作用及诱导烟草抗病性提高来抑制TMV侵染。     

丁香酚对烟草抗烟草花叶病毒的诱导作用初探

为探讨植物源化合物丁香酚对烟草抗烟草花叶病毒(TMV)的诱导作用,初步研究了丁香酚对接种TMV的烟草叶片中叶绿素和丙二醛(MDA)含量,防御酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和超氧化物岐化酶(SOD)活性,以及病程相关蛋白基因 PR-1 、PR-3 、PR-5 表达的影响。结果表明:丁香酚处理可促进叶绿素的合成,减轻烟草体内MDA的积累,提高PAL、POD和SOD的活性,增强 PR-1 、PR-3 、PR-5 基因的表达。表明丁香酚可提高植物的诱导抗病性,进而减轻TMV对烟草的危害。     

用超声波法使烟草花叶病毒侵染烟草细胞的研究

 本文首次采用超声波法把烟草花叶病毒(TMV)粒子导入带壁烟草细胞,建立病毒-细胞高效侵染体系。将烟草细胞置于含TMV粒子的缓冲液中,用声强为0.5 W/cm²的脉冲超声波处理5 min,培养48 h后使用荧光免疫法检测烟草细胞转染率为59.7%。经酶联免疫吸附测定(ELISA)检测,TMV粒子在烟草细胞体内增殖48 h后达到高峰。电镜观察细胞体内有大量的TMV粒子。用枯斑寄主法测定表明TMV子代有较高的致病力。     

烟草植株中水杨酸时、空动态分布的测定方法

自从1979年发现水杨酸(salicylic acid,SA)对烟草花叶病毒(TMV)侵染烟草具有保护作用,并可明显减轻TMV侵染引起的症状以来,SA愈来愈受到人们的高度重视。1993年Gaffney进一步研究转基因烟草与TMV关系时,认为SA对烟草产生过敏性反应(HR)和系统抗病性(SAR)是必需的,弘是诱导植物产生抗病性的重要植物内源抗病信号分子之一。在研究SA对植物的生理作用时,通常采用高效液相色谱技术(HPLC)测定其含量,但     

抑制烟草花叶病毒(TMV)植物提取物的筛选

为开发新型植物源抗病毒剂,以抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)活性为指标,利用半叶枯斑法对13种常见中草药进行了抗病毒活性筛选,并对筛选到的中草药进行了抗病机理的研究。结果表明:马蓝、玉簪、鸦胆子、白薇和苦木5种中草药的30μg/mL醇提取物抗TMV活性较好,抑制率均达70.44%以上,且高于8%宁南霉素水剂1 000倍液的抗病毒活性,其中马蓝醇提取物抗病毒活性最佳,抑制率可达90.70%。对马蓝醇提取物防治烟草花叶病毒机理的研究发现,0.5μg/mL马蓝醇提取物能够保护TMV侵染的烟草原生质体细胞形态完整;经马蓝醇提取物处理后,烟草的苯丙氨酸解氨酶和过氧化物酶活性比清水对照组明显提高;20~50μg/mL浓度的马蓝醇提取物能明显抑制TMV病毒外壳蛋白的表达。推测马蓝醇提取物可能是通过保护植物细胞而起到抗病毒作用,可进一步开发为植物源抗病毒剂。     

大豆凝集素基因lec-s转化烟草>增强对烟草花叶病毒的抗性

 将编码大豆凝集素的lec-s基因插入植物表达载体pBI121中,构建植物重组表达质粒pBI121:: lec-s。由根癌土壤杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草株系。PCR和RT-PCR检测证明lec-s基因已转入烟草植株中。接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）进行抗病性试验结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,说明转基因烟草表现出对TMV的抗性。定量RT-PCR检测发现,接种TMV后,抗病防卫基因（PR-1a、GST1、Pal和hsr515）在转基因烟草叶片中显著上调表达。这些结果表明,大豆凝集素基因lec-s转化烟草可对TMV产生抗性,其作用机制可能在于lec-s基因参与了植物的防卫信号通路,诱导了抗病防卫基因在转基因植株体内的表达,增强了植株对TMV的系统抗性。     

壳寡糖诱导烟草抗烟草花叶病毒的超微结构研究

 电镜检查表明,接种烟草花叶病毒(TMV)表现系统侵染的烟草植株叶肉细胞和筛管内有大量病毒粒子和病毒结晶体,细胞质中出现髓鞘样结构、多泡体和次级囊泡。叶片薄壁细胞内叶绿体、线粒体等细胞器变形解体,膜结构增生。经壳寡糖(50 μg/mL)诱导处理的烟草,系统症状减轻,叶肉细胞和筛管中病毒粒子显著减少,偶见病毒结晶体;叶肉细胞中细胞器基本完好,但叶绿体内出现较大的淀粉粒;液泡内和细胞间隙出现大量电子致密物质。在未接毒和未经壳寡糖处理的植株中未见此种电子致密物,其产生可能与诱导抗病性表达有关。     

白色霞水母刺细胞毒素抗烟草花叶病毒活性

为探索从水母毒素中获取抗植物病毒物质的应用前景,采用半叶枯斑法、整株法和漂浮叶圆片法,对白色霞水母Cyanea nozakii Kishinouye刺细胞毒素的抗烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)活性进行了检测。结果表明,白色霞水母刺细胞毒素对TMV具有很强的直接钝化作用,枯斑抑制率随钝化时间的延长而增大。0.99 mg/m L毒素体外钝化TMV 30 min,枯斑抑制率达98.85%,将TMV与0.80 mg/m L毒素体外混合后立即接种,枯斑抑制率仍达89.57%;20~70℃之间,毒素对TMV的钝化作用随温度升高而降低,但又表现出一定的高温耐受性,70℃下处理30min,1.33 mg/m L毒素对枯斑的抑制率为61.73%。毒素对病毒初侵染有一定的预防作用,并可抑制TMV的增殖;1.93 mg/m L毒素处理接种TMV的叶圆片2 d后,对TMV的增殖抑制率为49.41%;但该毒素对TMV所致病害的治疗效果不明显。该毒素还具有较强的蛋白水解酶活性,可能与其抗TMV活性相关。表明白色霞水母刺细胞毒素抗TMV作用明显,其抗植物病毒活性值得深入研究。     

激活蛋白PeaT1诱导烟草对TMV的系统抗性

枯斑三生烟草(Samsun-NN)经激活蛋白PeaT1诱导后接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),对TMV产生了明显的系统获得抗性,枯斑抑制率达54.15%,枯斑大小也受到一定程度的限制。研究结果表明,PeaT1处理烟草植株下位三片叶不同时间后,其上部叶片中PPO、POD和PAL 3种抗病防御酶活性均比对照提高,第4 d酶活性达到最高值。实时荧光定量PCR检测结果显示,经PeaT1诱导4 d后烟草叶片中抗病相关基因PR1a、PR1b、NPR1在转录表达水平上较未诱导对照都有不同程度的上调。由以上结果我们推测PeaT1诱导烟草产生了系统获得抗性,本研究为进一步阐明PeaT1诱导植物抗病的信号传导途径奠定了基础。     

毒株、苗龄及温度对烟草苗期接种TMV试验的影响

 病毒株系、苗龄、接种后培养条件是影响烟草病毒病发生发展的关键因素,为确保烟草接种TMV抗性鉴定和药效生测试验的准确性,在N基因烟草和普通烟草上接种TMV,采用病毒生物学、qRT-PCR和Western blot技术,研究病毒的分离纯化、株系、稀释限点、传导路径、病害症状,以及N基因抗TMV的温敏性。结果显示,TMV为U1株系,在K326上活体保存50~65 d,仍具有较强的致病力,稀释限点为10⁵,接种物浓度以10²稀释为宜。接种后TMV先由接种叶传导到主茎,向下至根、向上至心叶,然后是上部叶,最后传导至下部叶,12~16 d布满全株,21~28 d花叶畸形显著,病情调查宜在2~3周内。温度和苗龄影响N基因烟草对TMV的抗性反应,培养温度应在25℃~27℃,苗龄以6~7叶期为宜。     

激活蛋白PeaT1在烟草细胞膜上的结合位点及其特性

 激活蛋白PeaT1是从极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)中分离的,能诱导植物产生系统获得抗性的蛋白激发子。为了阐明PeaT1诱导植物提高抗性的分子机制,本文采用RT-PCR技术研究了PeaT1诱导烟草悬浮细胞后不同时间PR-1a基因的转录活性,在烟草悬浮细胞中加入20μg/mL的PeaT18h后,PR-1a基因转录活性达到最高;相同浓度的PeaT1处理烟草植株,烟草叶片中酸性PR蛋白表达量升高。激光共聚焦显微镜观察到FITC荧光素标记的PeaT1可与烟草悬浮细胞表面结合;免疫荧光法进一步证明PeaT1可与烟草细胞质膜结合;使用共价交联剂BS³证明¹²⁵I-PeaT1可与烟草细胞质膜上的2个分子结合,而与加热或蛋白酶处理的质膜不能发生交联,说明与PeaT1结合的分子具有蛋白特性,分子量分别为20kDa和30kDa。上述实验结果证明在烟草细胞质膜上存在着激发子PeaT1受体样的结合位点。     

内生细菌EBS05对烟草诱导抗性的信号转导途径研究

 樟树内生枯草芽胞杆菌EBS05是一株对多种植物病原菌具有较强拮抗活性,并能诱导烟草系统抗性的生防菌株。本文以缺失Surfactin A合成相关基因的突变菌株EBS05^T为材料,研究了内生细菌EBS05对烟草诱导系统抗性的激发子及其信号转导途径。结果表明,菌株EBS05产生的Surfactin A是诱导烟草对TMV系统抗性的有效激发子;Surfactin A诱导处理后,SA信号转导途径下游的关键调节基因NPR1首先被激活,并持续超量表达,进而触发PR1b和PR1a基因持续超量表达,表明Surfactin A诱导烟草对TMV的系统抗性是通过激活SA信号转导途径实现的。同时,Surfactin A诱导处理后24~72 h,JA/ET信号转导途径调节基因PDF1.2被激活,且超量表达,表明在Surfactin A诱导烟草对TMV系统抗性的信号转导过程中,可能存在SA信号途径和JA/ET信号途径的交叉协同作用。     

化学合成寡糖诱导烟草抗黑胫病的初步研究

 抑菌测定和盆栽试验表明:化学合成的Lewis^x和Lewis^a寡糖对烟草黑胫病病原菌菌丝生长无明显影响;Lewis^x五糖和七糖处理烟草,可使烟草植株产生对黑胫病菌(Phytophthora nicotianae)的抗性,在处理浓度0~10μg/m L内,随着浓度增高诱导效果增强,当浓度达10 μg/m L时,诱导防病效果达90%以上。Lewisx七糖处理,可导致烟草叶片过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸裂解酶(PAL)等防卫酶活性不同程度地提高,PPO、POD及PAL分别在处理后第4d、第6d和第8d达到最大值,比对照分别增加了70.7%、150.0%和142.8%。     

抗菌肽和几丁质酶基因提高烟草对黑胫病菌和赤星病菌的抗性研究

 通过农杆菌介导法将加信号肽修饰的人工合成杂合抗菌肽CEMA基因(SPCEMA),苜蓿防御素基因(AFP),苦瓜几丁质酶基因(CHI)以及SPCEMA-CHI、AFP-CHI、AFP-SPCEMA双价基因导入本明烟(Nicotiana benthamiana),并对转基因烟草T₀和T₁代进行了抗病性检测,比较了不同转基因植株的抗病效果。研究结果表明,转基因烟草对黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)、赤星病菌(Alternaria alternata)的抗性均强于非转基因烟草,病情指数差异达极显著水平,其中转AFP-CHI双价基因烟草具有较强的抗性,与单价转基因烟草的抗性差异达显著水平。但各单价转基因以及双价转基因烟草之间对上述病菌并未表现出显著的抗病性差异。结果表明植物源的抗菌肽基因与几丁质酶基因在抗植物真菌病害中具有协同增效作用。     

114种植物提取物诱导烟草抗烟草花叶病毒活性鉴定

本研究以烟草和TMV为供试对象，评价了114种植物提取物诱导烟草抗TMV的活性，同时测试了这些植物提取物对TMV的钝化活性和抑制病毒粒子增殖的活性。结果表明，山苍子、平姜、苦参、八角、白屈菜、余甘子和五倍子共7种植物提取物对烟草具有显著的诱抗活性，对TMV的诱抗效果分别为78.90%、67.23%、66.82%、58.87%、53.92%、51.56%和51.28%，具有作为激发子诱导烟草抗病毒活性的应用潜力。本研究结果为开发植物源免疫诱抗剂生物农药提供了依据。     

青霉菌灭活菌丝体诱导烟草BY-2悬浮细胞防卫反应的初步研究

 青霉菌灭活菌丝体(Dry Mycelium of Penicillium chrysogenum,DMP)是工业生产青霉素的残余副产物,研究发现DMP能够提高多种作物的抗病性。本文研究了DMP对烟草BY-2悬浮细胞防卫反应的诱导作用,并初步探索其诱导机制,结果表明:DMP处理烟草BY-2悬浮细胞后,产生了活性氧迸发,在处理后30 min达到峰值;DMP诱导烟草BY-2悬浮细胞胞外基质碱性化,该变化能被蛋白激酶抑制剂K252a部分抑制;苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化物酶(POD)的活性被诱导而明显升高,分别在处理后4 h和8 h达到峰值;DMP诱导了病程相关蛋白基因PR-1a、PR-1b以及抗病信号传导途径关键基因NPR1的表达。说明DMP能够诱导烟草BY-2悬浮细胞产生抗病防卫反应,其抗病信号可能是通过水杨酸信号途径进行传导的,蛋白质磷酸化参与了该抗病信号的传导过程。