鱼类DNA聚合酶δP12亚基cDNA克隆与序列分析

从斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）白细胞cDNA文库随机挑选克隆,测定表达序列标签（ESTs）,利用BLASTX程序与GenBank中的序列进行比较,得到了1个cDNA,其编码蛋白质与人类DNA聚合酶δ（polδ）的P12亚基有47.7%的同源性,推测它为斜带石斑鱼polδ的12 kD小亚基的cDNA,所编码的蛋白质命名为P12.该cDNA全长619 bp,含1个330 bp的开放阅读框,编码109个氨基酸残基的蛋白质.序列对比表明,斜带石斑鱼的氨基酸序列与人、大鼠、小鼠、拟南芥和裂殖酵母的polδ小亚基有同源性,同时与斑马鱼EST CK680540的编码序列有66.6%的同源性.用RT-PCR检测该基因在石斑鱼各组织的表达情况,发现在腮、肝、脾、全血、胃和后肾有表达,而在肠、心脏、脑和头肾未检测到.[中国水产科学,2006,13（3）：466-470]     

草鱼APN基因的克隆及表达特征

氨肽酶N(APN)是肽酶M1家族的成员之一,在蛋白质的消化中发挥重要作用。采用同源克隆和RACE技术首次克隆草鱼APN基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为3258bp,包含27bp的5UTR序列,552bp的3UTR序列,2679bp开放阅读框,编码892个氨基酸;草鱼与斑马鱼基因同源性和编码氨基酸同源性分别为81.5%和75.4%,与其他动物同源性分别为58.8%～61.2%和54.3%～60.2%。经预测,其编码蛋白的分子量为100.61ku,等电点为5.14,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的1个螺旋跨膜结构,但跨膜区氨基酸同源性较低;系统进化分析表明,草鱼APN基因与斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-timePCR技术检测了该基因的发育表达,结果显示草鱼出膜4d后APNmRNA表达量相对稳定;APN在草鱼前肠、中肠和后肠均有较高的表达量,以前肠组织表达量最高;昼夜节律研究发现,肠道APN基因06:00-18:00的表达量较18:00-06:00高。     

剑尾鱼 2 种卵黄蛋白原全长 cDNA 的克隆及序列分析

卵黄蛋白原是环境雌激素效应研究的重要生物标志物,广泛应用于水环境内分泌干扰物污染的评价。本研究利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆获得了剑尾鱼(Xiphophorus helleri)的2种卵黄蛋白原基因—VgA和VgB,并对其基因结构和系统进化进行分析。VgA基因cDNA序列全长5159bp,开放阅读框(ORF)5058bp,编码1685个氨基酸。VgB基因cDNA序列全长5349bp,开放阅读框(ORF)5067bp,编码1688个氨基酸。2种cDNA序列均具有与已发现的卵黄蛋白原分子相似的主要特征和功能域,包括Vitellogenin结构域、VWFD结构域和多聚丝氨酸区域,且与已知其他鱼类卵黄蛋白原基因有较高的同源性。     

草鱼C1qC基因的克隆及表达分析

为了研究C1qC基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)免疫过程中所起的作用,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得了C1qC基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆的C1qC cDNA全长为916 bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)735 bp,5′端非编码区(untranslated region,UTR)89 bp和3′端非编码区(UTR)92 bp。735 bp的ORF共编码244个氨基酸,相对分子量为26 162.5 U。同源性分析表明,草鱼与斑马鱼(Danio rerio)的相似度最高,达到71%。经草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)诱导后,草鱼C1qC基因在鳃、皮肤、肌肉、肝、中肾、心脏、头肾等组织中的mRNA表达水平均显著上调。在草鱼胚胎发育的各个阶段都能检测到C1qC mRNA的表达,说明该基因可能在草鱼胚胎和鱼苗的免疫反应和早期发育中起重要作用。本研究将为今后在草鱼免疫功能方面深入研究C1qC基因提供基础资料。     

草鱼Bcl-2基因的克隆、组织表达分析及DHA诱导下其在脂肪细胞中的表达变化

为获知草鱼B细胞淋巴瘤基因-2(B cell CLL/ lymphoma-2, Bcl-2)基因序列及其在草鱼各组织和脂肪细胞中的表达变化,本研究通过cDNA快速末端扩增(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术获得了草鱼Bcl-2的全长cDNA序列,并采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测了Bcl-2在草鱼不同组织中的表达情况。为研究二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)对草鱼前体脂肪细胞凋亡的诱导作用,本研究检测了100 μmol/L DHA处理后,草鱼前体脂肪细胞中Bcl-2基因的时序表达。结果显示,所获得的草鱼 Bcl-2 基因全长cDNA序列长度为1292 bp,包含133 bp 的5′非翻译区(untranslated region, UTR)和784 bp 的3′UTR;开放阅读框为375 bp, 编码124 个氨基酸。草鱼Bcl-2与鲤、斑马鱼Bcl-2氨基酸同源性分别为89.5%和91.1%,与人、原鸡、小鼠、野猪、欧洲牛、褐家鼠、家猫和犬等其他动物的氨基酸同源性为57.7%-62.0%。其编码蛋白的分子量为14.14KDa,等电点为4.68。Bcl-2基因在草鱼心脏、肝胰脏、脾脏、鳃、肾脏、肌肉、腹腔脂肪组织、脑、小肠、精巢10个组织中均有表达,其中在腹腔脂肪组织、肾脏和精巢中表达丰度最高,在肌肉中表达最低。DHA处理草鱼前体脂肪细胞后,Bcl2基因表达在增殖阶段下调,而在分化阶段上调。研究表明,Bcl-2在草鱼各组织中广泛表达,且DHA对其在脂肪细胞中的表达具有调控作用。     

草鱼小肽转运载体PepT1基因的克隆与表达特征

采用同源克隆和RACE技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PepT1基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为2 762 bp,包含141 bp的5′UTR序列,479 bp的3′UTR序列,2 142 bp开放阅读框,编码713个氨基酸;草鱼与鲫(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)的核苷酸同源性分别为77.6%和74.0%,氨基酸同源性分别为78.0%和76.7%;与其他物种的核苷酸同源性为53.9%～59.1%,而氨基酸的同源性为57.2%～61.8%。经预测,其编码蛋白的分子量为79.29 kD,等电点为5.87,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的11个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守;系统进化分析表明,草鱼PepT1基因与鲫鱼和斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-time PCR技术检测了该基因的时空表达,结果显示,PepT1在草鱼前肠组织表达量最高,其次是肌肉组织;草鱼出膜7 d后PepT1 mRNA表达量相对稳定;昼夜节律研究发现,肠道PepT1基因夜间的表达量较白天高。本研究旨在为小肽转运载体PepT1介导肠道转运小肽调控草鱼对饲料蛋白消化吸收的分子机理提供理论基础。     

草鱼ghrelin基因的分子克隆与组织分布及其摄食调控作用分析

ghrelin是一种在脊椎动物摄食调节过程中起重要作用的脑肠肽,具有明显的摄食促进作用。实验利用同源克隆技术获得了草鱼ghrelin基因的cDNA序列和DNA序列,其中cDNA序列全长506 bp,包括90 bp的5′端非编码区(5′-untranslated region,5′UTR),312 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),以及104 bp的3′端非编码区(3′-untranslated region,3′UTR)。开放阅读框编码的103个氨基酸的ghrelin前体肽,经剪切加工后形成含有19个氨基酸的成熟肽。氨基酸序列分析结果显示,草鱼ghrelin与硬骨鱼类ghrelin相似度最高,而与其他脊椎动物相似度较低,同时草鱼ghrelin成熟肽N端的"活性中心"(active core)为鲤科鱼类中常见的GTSF形式。与大多数硬骨鱼类的ghrelin基因结构相同,草鱼ghrelin基因也包括4个外显子和3个内含子。荧光定量PCR检测到ghrelin mRNA大量分布于草鱼的前肠和脾,脑、肾、肝、肌肉、皮和鳔等组织也有ghrelin mRNA分布。草鱼脑和肠中的ghrelin表达水平在摄食后下降,随着饥饿时间的延长表达水平逐步升高,最后维持在较高水平,表明ghrelin作为摄食启动信号对草鱼的摄食活动起到了促进作用。     

草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT2 cDNA基因克隆与表达研究

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)方法,克隆y+LAT2基因cDNA序列,并利用实时荧光定量PCR探讨y+LAT2在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)各组织中的表达情况以及饥饿对其mRNA的影响。结果表明,获得的y+LAT2基因的cDNA序列片段为1849bp,含1371bp的核心序列,编码456个氨基酸。预测草鱼氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)的同源性高达96.5%,与哺乳动物和两栖动物的同源性在78%～83%,构建的系统进化树与传统形态学分类一致。在草鱼的肌肉、脑、鳃、心、肾脏、肝、后肠、中肠、前肠、脾脏组织均检测到y+LAT2基因的表达。草鱼脾脏、肾脏以及前肠、中肠的y+LAT2 mRNA表达水平对禁食的反应不同,在短期饥饿(14d)期间,其y+LAT2 mRNA表达水平均呈下降趋势。草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT2基因全长cDNA序列的获得,有利于进一步探讨鱼类氨基酸的吸收转运机制。     

鳜免疫球蛋白 D 重链基因的克隆与表达分析

用RACE-PCR和RT-PCR方法获得鳜(Siniperca chuatsi)膜结合型免疫球蛋白D(Membrane-bounded IgD,mIgD)重链基因的全长cDNA序列。鳜mIgD的cDNA全长为3358bp,其5l非编码区包含30bp,3l非编码区包含337bp;开放阅读框包含2991bp,编码996个氨基酸,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。鱼类IgD恒定区氨基酸序列比对结果显示,鳜mIgD存在半胱氨酸和色氨酸保守位点,与其他鱼类IgD的相似性在37%～72%之间。用邻接法(Neighbor Joining)构建的鱼类免疫球蛋白基因的系统发育树表明,鱼类IgD形成独立的一支,鳜mIgD与牙鲆和庸鲽IgD聚为一支。荧光定量PCR结果显示,鳜mIgD的mRNA主要分布于外周血白细胞、胸腺、头肾、中肾和脾脏中。     

异育银鲫P450家族CYP3A136基因的克隆与表达

根据5种硬骨鱼已知CYP3A序列保守区设计兼并引物,以异育银鲫cDNA为模板扩增得到CYP3A基因片段,根据得到片段序列设计特异引物并利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)获得全长cDNA。得到异育银鲫CYP3A基因全长为1 769 bp,开放阅读框为1 545个核苷酸,编码514个氨基酸。其预测蛋白质分子量为58.624 ku,理论等电点为6.30。将异育银鲫CYP3A序列理论编码氨基酸序列提交细胞色素P450命名委员会(Cytochrome P450 Nomenclature Committee)并由其命名为CYP3A136。氨基酸序列分析显示,其与稀有鮈鲫、草鱼、鲦同源性较高,并且具有高度保守的血红素结合区域FXXGXXXCXG。异育银鲫CYP3A基因的半定量RT-PCR显示,在肝和肠组织中转录水平最高,在肾和鳃中次之,其余组织较低。     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)成纤维细胞生长因子8的cDNA克隆及特征分析

以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)为实验对象,利用RACE技术克隆了草鱼成纤维细胞成长因子8(Fibro-blast Growth Factor8,FGF8)cDNA序列。实验结果显示,草鱼FGF8 cDNA序列长度为887 bp,其中5′-非翻译区长100 bp,3′-非翻译区长157 bp,开放阅读框(ORF)633 bp,编码210个氨基酸的前体蛋白,包含22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。利用已知的FGF8序列绘制系统发育树,发现草鱼与两种鲤科鱼(班马鱼、墨西哥脂鲤)聚为一簇,显示亲缘关系很近,而与其它脊椎动物如两栖类、鸟类、哺乳类的亲缘关系则相对较远,这与形态分类学的结果一致。此外,还通过生物信息学分析,揭示了草鱼FGF8的分子结构特征。     

Characterization and expression of NADPH oxidase genes in stimulated splenic neutrophils of tilapia,Oreochromis niloticus by a mix of traditional Chinese medicine and Bacillus species (TCMBS)

Traditional Chinese medicine and Bacillus species (TCMBS) mixture is an immunostimulant with considerable promise as an alternative in improving fish health. However, nothing is known on its effects on the expression of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase genes and production of reactive oxygen species (ROS) in the neutrophils of fish. The full lengths of tilapia phagocytic NADPH oxidase genes gp91^phox, p22^phox, p40^phox, p47^phox, and p67^phox were cloned and their expression profiles after TCMBS stimulus investigated. The cDNAs of tilapia gp91^phox, p22^phox, p40^phox, p47^phox, and p67^phox contained open reading frames of 1698 bp, 561 bp, 1053 bp, 1584 bp, and 1470 bp respectively, encoding 561, 186, 350, 527, and 489 amino acids respectively. Comparison of the deduced amino acid sequences showed that tilapia NADPH oxidase genes shared 58%–91% and 21%–67% identity with those of other teleost and mammals respectively. Besides, tilapia NADPH oxidase genes contain conserved domains and motifs required for ROS generation. Phylogenetic analysis suggested tilapia NADPH oxidase genes were close to those of Fundulus heteroclitus. After 2 weeks of TCMBS application showed significant upregulation in expression of NADPH oxidase genes, antioxidant genes (i.e., superoxide dismutase, catalase, and glutathione‐disulphide reductase), and an increase in the production of ROS compared to the control in splenic neutrophils of tilapia. Collectively, our study provides evidence of the structure of tilapia NADPH oxidase genes and demonstrate that TCMBS application could modulate their activity in neutrophils to improve immunity in tilapia.     

草鱼胞质苹果酸脱氢酶(cMDH)的序列克隆及分析

以实验室构建的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道cDNA文库苹果酸脱氢酶(cMDH)EST序列为基础,采用末端快速扩增法(RACE),从健康雌性草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肠道细胞RNA中获得1391 bp的草鱼肠道cMDH的cDNA序列(NCBI登录号:EU569765)。结果显示:该序列包含62 bp的5′非编码区(5′-UTR),330 bp的3′非编码区(3′-UTR),典型加尾信号AATAA位于polyA起点上游16 bp。开放阅读框ORF长999 bp,共编码333个氨基酸,预测蛋白等电点为6.67,大小为36 kDa。多序列比对显示草鱼胞质苹果酸脱氢酶具有典型的苹果酸脱氢酶功能区保守序列,该酶与斑马鱼cMDH相似度最高达到95.5%,与模式植物拟兰介的相似度为57.8%,其预测三级结构具有典型cMDH功能区。Southern杂交结果表明草鱼cMDH属于多拷贝基因家族。     

罗非鱼催乳素Ⅰ基因的组织分布及盐胁迫对其表达的影响

采用同源克隆方法从橙色莫桑比克罗非鱼（Oreochromis mossambicus）、荷那龙罗非鱼（O.hornorum）及其正反交子代垂体中克隆了催乳素Ⅰ基因（PRLⅠ）,并对其核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行了比对分析。结果显示,4种罗非鱼的PRLⅠ基因序列长度均为798 bp,ORF长639 bp,共编码212个氨基酸;橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼仅在31号位点存在一个氨基酸残基差异。用q PCR方法分析橙色莫桑比克罗非鱼和荷那龙罗非鱼PRLⅠ基因在不同组织或器官中的表达,结果表明罗非鱼PRLⅠ基因在垂体中的表达量最高,在其他组织中的表达量较低;盐胁迫后4种罗非鱼垂体中的PRLⅠmRNA水平均显著降低,而在其他组织中的表达变化不大。由此可知PRLⅠ基因主要在垂体表达,参与罗非鱼的渗透压调节。     

剑尾鱼IgZ基因的克隆及疫苗免疫对其在组织中表达的影响

为研究剑尾鱼Ig Z基因序列及其在疫苗免疫后的表达规律,本实验根据已知的EST库设计引物,利用RT-PCR等方法,获得剑尾鱼Ig Z基因c DNA全长序列,并进行生物信息学分析和疫苗免疫后组织表达分析。结果显示,剑尾鱼Ig Z基因全长序列为5 420 bp,包含4个外显子和3个内含子;c DNA序列全长1 527 bp,包含一个1 299 bp的完整ORF框,该基因编码432个氨基酸,预测其编码蛋白的分子量大小为47.48 ku,并具有Ig Z的基本结构,与其他硬骨鱼类Ig Z氨基酸序列一致性为28%~54%。荧光定量PCR分析结果显示,Ig Z基因主要在剑尾鱼的头肾、脾脏和肠中分布,且疫苗免疫后11天内,Ig Z基因在头肾、脾脏和肠组织中均表现为先上升后下降的趋势。头肾中Ig Z基因的表达量在第4天时最高,为对照组的2.12倍;脾脏中Ig Z基因在第4天时呈现最高峰,为对照组的4.65倍;肠组织中Ig Z基因的表达量在12 h时有一个小高峰,第2天时最高,为对照组的11.41倍。本研究获得了剑尾鱼Ig Z基因c DNA全长序列,并对其表达规律进行了初步研究,发现Ig Z在肠道黏膜免疫中具有重要作用,这将为进一步验证其在黏膜免疫中的作用以及剑尾鱼作为疾病研究模式动物和疫苗免疫评价模型奠定基础。     

斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析

研究以斑节对虾(Penaeus monodon)转录组获得的几丁质酶基因(Pm Chi)片段,运用RACE技术克隆了PmChi基因c DNA全长,命名为PmChi-2。PmChi-2基因c DNA全长2 050 bp,其中5'-非编码区(5'-UTR)144 bp、3'-UTR 319 bp和开放阅读框(ORF)1 587 bp,编码528个氨基酸。生物信息学分析显示,PmChi-2与其他甲壳动物Chi-2的相似性为78%~97%。实时荧光定量PCR结果显示,PmChi-2在蜕皮前期(D期)表皮中表达水平最高,在胃、鳃、腹神经节和眼柄中表达水平依次降低,在其他组织(肝胰腺、肠、肌肉、心脏)中几乎不表达。不同蜕皮阶段,PmChi-2在鳃、胃和表皮3种组织中的表达变化模式基本一致,均在蜕皮期(E期)表达量最低,而最高表达量在鳃中出现在蜕皮后期(A期),在胃和表皮中为D期。幼体不同发育阶段分析揭示PmChi-2 mRNA在幼体发育阶段的无节幼体到糠虾幼体第二期表达量维持在一个低水平,在糠虾幼体第三期PmChi-2 mRNA表达水平显著升高,在仔虾期又显著下降,推测PmChi-2 mRNA可能与斑节对虾幼体发育密切相关。研究结果表明PmChi-2基因可能在斑节对虾蜕皮以及幼体的变态发育中发挥重要作用,为深入研究斑节对虾几丁质酶发育调控提供了重要信息。     

奥利亚罗非鱼雌激素β受体两种亚型cDNA的克隆、组织分布及雌激素对其表达的影响

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了奥利亚罗非鱼β雌激素受体基因(estrogen receptorβ,ERβ)两种亚型的cDNA全序列(ERβ1和ERβ2)。荧光定量PCR分析雌雄奥利亚罗非鱼两种亚型的组织分布,并观察注射外源雌激素对雄性奥利亚罗非鱼下丘脑-垂体-性腺轴雌激素受体ERα和β(β1/β2)基因表达的影响。序列分析表明,ERβ1cDNA全长为4262bp,其中包含239bp5′非编码区,2349bp3′非编码区和1674bp的开放阅读框,共编码557个氨基酸。ERβ2 cDNA全长为2506bp,包含5′非编码区393bp,3′非编码区109bp,阅读框为2004bp,共编码667个氨基酸。氨基酸序列同源性分析显示奥利亚罗非鱼ERβ1与尼罗罗非鱼的相似性高达99.1%,而与鲈形目其它鱼类的相似性为82.6%～94.2%。ERβ2氨基酸序列与尼罗罗非鱼的相似性为98.7%,与大口黑鲈、虹鳟、底鳉及斑马鱼的相似性分别为81.8%、76.3%、64.7%和55.0%。在系统进化树上奥利亚罗非鱼的ERβ1和ERβ2分别与尼罗罗非鱼的相应受体聚类。奥利亚罗非鱼ERβ1/β2基因在所检测的10种组织中均有...     

大口黑鲈两种脂蛋白脂肪酶基因cDNA的克隆及表达特征分析

为促进肉食性鱼类人工配合饲料开发的理论基础研究,分析鱼类脂肪代谢的机制,实验克隆了大口黑鲈2个脂蛋白脂肪酶基因LPLtype1和LPLtype2的cDNA。序列分析表明,LPLtype1基因cDNA序列全长2 156 bp,编码516个氨基酸;LPLtype2基因cDNA序列全长1 710 bp,编码346个氨基酸。大口黑鲈LPLtype2与LPLtype1氨基酸序列之间的同源性为43.5%。系统进化分析表明,大口黑鲈LPLtype1和鳜LPL聚为一支,大口黑鲈LPLtype2和大麻哈鱼LPLtype2紧密聚为一支。预测分析发现,大口黑鲈LPLtype1和LPLtype2基因编码蛋白的活性中心位点、N-糖基化位点、二聚体形成的保守疏水残基位点、肝素结合域等主要功能域与硬骨鱼类和其他脊椎动物对比都比较保守。运用实时定量PCR方法检测脂蛋白脂肪酶mRNA的组织分布,发现LPLtype1和LPLtype2都在肝脏中表达量最高,推测这与肝脏是最主要的营养诱导性储脂部位有关。     

中华鲟piwil1基因的克隆表达特征研究

Piwi是鱼类配子发生和性腺发育的重要调控因子。本研究从中华鲟(Acipenser sinensis)性腺中克隆得到了piwi基因的全长c DNA序列,该序列长3 393 bp,开放阅读框为2 583 bp,编码860个氨基酸。氨基酸序列多重对比发现,该序列具有PAZ和PIWI保守结构域,与其他鱼类piwil具有较高同源性;系统进化分析显示,中华鲟piwil聚于piwil1分支;因此,所得序列为piwi-like 1基因,命名为Aspiwil1。荧光定量PCR研究表明,Aspiwil1为母源表达,且其表达量随着胚胎发育逐渐降低;Aspiwil1在性腺中大量表达,在脑组织中也有较低水平的表达。性腺组织切片RNA原位杂交结果表明,Aspiwil1仅在生殖细胞表达,且其杂交信号随着卵子发生逐渐增强、精子发生逐渐减弱。本研究为中华鲟配子发生过程中Aspiwil1的功能研究提供了基础。