草鱼免疫球蛋白M重链基因的克隆及表达

用RACE-PCR方法扩增出草鱼免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM) 分泌型的重链全长cDNA.其cDNA全长为1 940 nt,包含5'非编码区20 nt,3'非编码区189 nt,开放阅读框1 731 nt,编码576个氨基酸.序列比对分析表明草鱼IgM与鲤的相似性高达68%,与斑马鱼、斑点叉尾鱼回、鳜以及大西洋鳕的相似性分别为61%、43%、33%和30%.ClustalX比对结果显示:草鱼IgM中存在半胱氨酸和色氨酸的保守位点.进化分析表明,草鱼IgM与斑马鱼的IgM聚为一枝.荧光定量PCR显示草鱼IgM的mRNA主要在头肾、中肾和脾脏中表达,表明了这三个免疫器官是IgM表达的主要场所.     

大鳍鳠免疫球蛋白M 重链基因的克隆及表达分析

用RACE-PCR和RT-PCR方法获得大鳍鳠分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列.大鳍鳠sIgM的cDNA全长为1 992 bp,包含5 '非编码区53 bp,3’非编码区226 bp,开放阅读框1 713,编码570个氨基酸.推测的大鳍鳠sIgM蛋白质序列可变区含有4个骨架区(FR)和3个互补决定区(CDR),恒定区(CH)含有CH1、CH2、CH3和CH4 4个部分.与其它6种硬骨鱼类IgM氨基酸序列比对分析表明,大鳍鳠sIgM存在半胱氨酸和色氨酸保守位点;其氨基酸序列与斑点叉尾鲴IgM的相似性最高,为54.3％;与石斑鱼的相似性最低,为24.6％.进化树分析表明,大鳍鳠sIgM与斑点叉尾鲴聚为一支.RT-PCR显示,大鳍鳠IgM基因主要在血细胞、脾脏、头肾和中肾中转录表达;注射嗜水气单胞菌后,血细胞、脾脏和头肾IgM重链基因转录表达量在1～10 d内有显著上升.     

大鳍鳠免疫球蛋白轻链3型基因cDNA的克隆及表达

应用同源克隆和RACE-PCR方法获得大鳍鳠免疫球蛋白轻链3型(IgL3)基因的全长cDNA序列,并分析了该基因在组织中的表达。大鳍鳠IgL3的cDNA全长为947 bp,包含5非编码区58 bp,3非编码区184 bp,开放阅读框705 bp,编码234个氨基酸。推测的蛋白质序列分为可变区(VL)和恒定区(CL)。VL被进一步划分为4个骨架区(FR)和3个互补决定区(CDR)。大鳍鳠与其它6种硬骨鱼类免疫球蛋白轻链L3氨基酸序列比对分析表明,大鳍鳠氨基酸序列与斑点叉尾IgL3型(F型)的相似性最高,为68.8%,与南极鱼IgL3型的相似性最低,为47.2%。进化树分析表明,大鳍鳠IgL与斑点叉尾IgL3型(F型)聚为一支并与其它硬骨鱼类IgL3型聚为一簇,明显与L1和L2进化支不同。实时荧光定量PCR显示,大鳍鳠IgL3基因主要在头肾、脾脏和血细胞中转录表达;注射嗜水气单胞菌后,头肾、脾脏和血细胞IgL3基因转录表达量有显著上升。研究表明,头肾、脾脏和血液是大鳍鳠IgL3型基因主要的表达器官,在免疫反应中起重要作用。     

鳜胃泌素与胆囊收缩素基因cDNA全长的克隆与表达特征

为探明鱼类消化液分泌的相关调控因子,采用RACE技术分别克隆了鳜(Siniperca chuatsi)两种肠道激素——胃泌素(gastrin,GAS)与胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)基因的cDNA序列。鳜GAS基因cDNA全长581 bp,5′非翻译区长100 bp,3′非翻译区长145 bp,开放阅读框长336 bp,编码111个氨基酸;鳜CCK具有2种类型:CCK1与CCK2,CCK1 cDNA全长为843 bp,5′非翻译区长60 bp,3′非翻译区长369 bp,开放阅读框414 bp,编码137个氨基酸;CCK2 cDNA全长846 bp,5′非翻译区长112 bp,3′非翻译区长332 bp,开放阅读框403 bp,编码134个氨基酸。鳜GAS与CCK成熟肽C末端具有相似的八肽结构(DYQGWVDF/DYLGWMDF),仅在C末端第3位和第6位氨基酸发生替换。荧光定量PCR分析表明,鳜GAS mRNA主要表达于肠和幽门垂,CCK1与CCK2 mRNA在脑中表达量最高,在肠和幽门垂也有较高表达,表明GAS与CCK同为消化调控因子,而CCK还是神经分泌因子。鳜GAS与CCK mRNA表达贯穿于整个幼体早期发育阶段(孵化后0～22 d),前期表达水平较高,后期表达水平较低,并趋于平稳,GAS与CCK mRNA发育表达水平变化可能与这一时期消化道生长发育旺盛有关。     

鳜免疫球蛋白单克隆抗体的制备及特性

鳜（Siniperca chuatsi）是我国传统名贵淡水鱼。近年来,随着鳜养殖业的发展,鳜病害也日益猖獗。暴发性疾病的发生与流行阻碍了鳜养殖业的健康发展。要解决这些问题,除了加强管理、提高养殖技术外,还必须重视其病原学、免疫学等领域的研究,将免疫预防手段引入到鳜养殖业,通过免疫手段有效增强鱼体主动防御能力,减少疾病发生机率。然而对鳜免疫学的研究还处于初始状态,张永安等提纯了鳜血清免疫球蛋白并进行亚单位分子量的测定。     

基于转录组测序对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi) 2种肌球蛋白重链基因的克隆与分析

肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MYH)是骨骼肌粗肌丝的重要组成单位,其表达量高低影响肌纤维的组成和肌肉生长.为了解其在翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)早期生长过程中的作用,本研究从前期生长差异显著的2组(快长组和慢长组)翘嘴鳜幼鱼转录组差异表达Unigene中筛选出2个MYH基因,RACE (Rapid amplification of cDNA ends)克隆到其全长cDNA(MYH-7a,MYH-7b).MYH-7a全长为6071bp,开放阅读框为5820 bp;MYH-7b全长为5896 bp,开放阅读框为5745 bp.序列分析显示,2个MYH均有Loopl、Loop2环、ATP结合位点等关键结构域;进化树聚类分析显示,MYH-7a与MYH-7b均属于慢肌球蛋白.实时荧光定量PCR验证发现,其在快长组样本中表达量显著高于慢长组,与转录组测序结果一致;检测其在翘嘴鳜心肌、红白肌和皮肤等14种组织的表达水平,结果显示,MYH-7a主要在心肌中表达,而MYH-7b主要在红肌中表达;在胚胎发育不同阶段,二者随着胚胎发育的进行,表达量不断增加;在幼鱼早期生长过程(孵化出膜后15 dph、30 dph和60 dph)的翘嘴鳜白肌中,在15 dph和30 dph快长组的表达量显著高于慢长组,而到60 dph时快长组的表达量均显著低于慢长组.翘嘴鳜MYH-7a、MYH-7b在快长组与慢长组鱼中的差异表达提示它们在翘嘴鳜胚胎及其早期生长发育过程中发挥重要作用.     

半滑舌鳎促滤泡激素基因全长cDNA的克隆与组织表达分析

从半滑舌鳎Cynoglossus semilaevis Günther脑垂体中提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到半滑舌鳎促滤泡激素（FSH）基因全长cDNA序列。半滑舌鳎FSHcDNA全长为541bp,开放阅读框为393bp,编码130个氨基酸（GenBank序列登录号：JQ277933）。发现一个N-糖基化位点：24～27NTT。与其他脊椎动物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比较表明,半滑舌鳎FSH与鲽形目和鲈形目鱼类FSH同源性为42％～49％,与鲤形目和高等脊椎动物FSH同源性为27％～319/5。用MEGA4．0软件构建了NJ树,获得的进化树表明,半滑舌鳎FSH与其他鱼类FSH聚类,亲缘关系较近。实时荧光定量组织表达分析表明,FSHmRNA除在垂体中大量表达外,其他组织也有表达,尤以脑、性腺表达量较高。半滑舌鳎FSHmRNA在垂体以外组织中的广泛表达,暗示FSH可能具有广泛的生理功能。     

鳜IRAK4基因的克隆、组织表达及病毒感染后表达分析

为了研究鳜IRAK4生物学特性及其在抗病毒免疫应答中的作用,根据鳜转录组数据中筛选出的IRAK4 unigene序列设计引物,利用SMART-RACE技术克隆得到CDS全长为1389 bp的c DNA(命名为Sc IRAK),编码462个氨基酸,含有1个N端死亡结构域和1个保守的中央蛋白激酶结构域。采用荧光定量RT-PCR方法分析了Sc IRAK4在健康鳜各组织中的表达差异及病毒感染后在脾脏中的表达变化,结果显示,健康鳜中Sc IRAK4在肝脏中表达量最大,与其他组织差异显著,而在血液、脑和胃中表达量最低;传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)感染鳜后Sc IRAK4的表达量呈现下调趋势,24 h脾脏中的表达量达到最低,为对照组的45%;而鳜弹状病毒(siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)感染鳜后Sc IRAK4的表达量呈现上调趋势,12 h脾脏中Sc IRAK4的表达量达到最高,为对照组的8.17倍,表明Sc IRAK4在抗ISKNV和SCRV的免疫应答中可能发挥不同的作用。本研究为进一步揭示Sc IRAK4的抗病毒免疫反应机制提供了依据。     

条斑紫菜HSP90基因的克隆与表达分析

为了研究HSP90在条斑紫菜胁迫耐受中的作用,克隆了条斑紫菜HSP90基因(命名为PyHSP90),采用定量RT-PCR研究了其表达规律。PyHSP90基因包含一个长2274nt的完整开放阅读框,编码757个氨基酸。PyHSP90蛋白定位于细胞质中,具有HSP90蛋白家族的特征序列和保守结构域,与多种生物的HSP90具有较高的序列一致性。在进化树上条斑紫菜等红藻的HSP90与隐藻的亲缘关系最近,与绿藻和陆生植物亲缘关系较远。低温和高温胁迫都能显著性地诱导条斑紫菜叶状体PyHSP90基因的表达,而且表达量与胁迫程度成正相关;低盐胁迫下PyHSP90基因表达上调;而失水胁迫下PyHSP90基因表达下调。     

军曹鱼Ig μ重链的全长克隆及在各组织中的定量分析

采用同源克隆和RACE技术,克隆了军曹鱼Igμ重链的cDNA全序列,并通过荧光定量技术分析其在组织中的表达。军曹鱼Igμ的cDNA全长1933bp,3的非编码区域(UTR)为164bp,5UTR为26bp,开放阅读框为1743bp,编码580个氨基酸,分子量为64.831ku,理论等电点6.6。推测的军曹鱼Igμ全长氨基酸序列与已报道的鱼类的相似性最高为60%,最低为30%,同两栖类的相似度在30%~33%,同其他高等的动物相似度不足30%。较保守的CH4区和鱼类相似性在64%~71%,同其他生物的相似度仅为31%~33%,具有较强的物种特异性。军曹鱼Igμ中存在半胱氨酸和色氨酸的保守位点以及FR2骨架区的GKGLEW和在FR3的YYCAR保守序列。Igμ链基因在健康鱼体中除了肾以外在其它各组织中均有表达,在肠中的表达量最高。经鲨鱼弧菌刺激48、96、192h后,在采样的各个组织中均有表达,心脏、鳃、肠道在刺激后48h表达量明显增加,脾脏、胃和脑0h时的表达量较高,肝脏、头肾以及肾脏192h后表达较显著。从时间上看,黏膜免疫屏障最先抵御外来抗原,其后,依次是肝脏、肾、头肾产生免疫应答,说明系统免疫在长时间的抵御外来抗原时发挥着重要作用。     

翘嘴鳜生长激素cDNA克隆及其真核表达载体的构建

根据GenBank上大眼鳜生长激素cDNA序列(收录号:AY155227)设计了1对特异性引物,应用RT-PCR技术从翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)脑垂体中克隆了生长激素基因(scGH)编码区序列并对其真核表达载体的构建进行了研究。结果显示:扩增片段全长615 bp,共编码204个氨基酸。该序列与GenBank上大眼鳜生长激素cDNA序列同源性为99.84%。将scGHcDNA序列定向插入pYES2/CT真核表达载体中,经过筛选、酶切和测序,证明重组子中确实插入了翘嘴鳜GH片段。     

鳜胃蛋白酶原基因cDNA全长的克隆与序列分析

利用RT–PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆鳜(Siniperca chuatsi)胃蛋白酶原基因cDNA全长序列,并对该基因的结构特征和系统进化关系进行了分析。鳜胃蛋白酶原基因cDNA序列全长1367 bp,5′端非翻译区43 bp,3′端非翻译区187 bp,开放阅读框(ORF)1137 bp,共编码378个氨基酸。鳜胃蛋白酶原氨基末端存在信号肽和激活肽序列,序列中含有催化活性必需的2个天冬氨酸残基和构成二硫键的6个半胱氨酸残基。鳜胃蛋白酶原氨基酸序列与其他脊椎动物胃蛋白酶原氨基酸序列的同源性为59.9%～91.2%,表明胃蛋白酶原基因在脊椎动物的长期进化中比较保守。鳜胃蛋白酶原基因的成功克隆不仅为进一步研究该基因的时空表达奠定基础,而且为鱼类胃蛋白酶原的分子特征和进化提供了新的资料。     

鳜鱼病毒PCR诊断方法的建立

从ＲＡＰＤ扩增的鳜鱼病毒（ＳＣＶ）核酸电泳带中回收了二个片断，克隆子pUC19质粒（称为ＳＣＶＥ３６９和ＳＣＶＥ４５０），序列分析表明插入片段分别为３６９bp和450bp与ＧenBank序列没有显著的同源，根据克隆序列调计两对引物Ｐ１／Ｐ２和Ｐ３／Ｐ４ ，在健康鳜鱼，病鳜以及提纯的ＳＣＶ核酸中进行ＰＣＲ试验，结果表明，Ｐ１／Ｐ２组引物在ＳＣＶ基因组中扩增出特异性核酸片段，可作为鳜鱼病毒ＰＣＲ诊断，检测片段为３６９bp.     

鳜鱼病毒核酸的初步分析

提取鳜鱼病毒核酸,分别用ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ和绿豆芽核酸酸处理表明,该病毒为双链ＤＮＡ病毒,用带ＥｃｏＲⅠ酶切位点的随机引物扩增病毒核酸,获得扩增核酸带谱。经低熔点琼脂糖回收ＰＣＲ产物,与质粒ｐＵＣ１９连接,获得三个重组子,已经对两个小插入片断进行了序列分析,插入序列分别为３６９ｂｐ和４５０ｂｐ。ＧｅｎＢａｎｋ检测显示,尚未有类似的序列报导。     

约氏黄杆菌减毒活疫苗对鳜免疫效果评价

为获知约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)减毒活疫苗(M170株)浸泡免疫鳜(Siniperca chuatsi)后的免疫应答,采用荧光定量RT-PCR方法测定免疫后鳜肝脏溶菌酶(Lys)基因、脾脏免疫球蛋白(Ig M)基因表达动力学,并检测了血清中Lys活性和抗体效价变化规律。结果表明,约氏黄杆菌减毒活疫苗浸泡免疫后,鳜肝脏Lys基因表达量显著上调(P0.05),第48小时表达量达到峰值,是对照组的10.9倍(P0.05),直到第28天表达量仍显著高于对照组(P0.05)。同时免疫鱼血清Lys活性明显升高,第2天达到峰值,是对照组的4.35倍(P0.05),第6天与对照组水平相当;免疫鳜脾脏Ig M基因相对表达量从第7天开始上调并显著高于对照组(P0.05),至第28天其相对表达量为对照组的98.7倍(P0.05);而免疫鱼血清抗体效价在第7天开始高于对照组,第28天达到峰值(26)。免疫后第28天采用强毒株M168进行攻毒,结果显示,免疫组相对成活率显著高于对照组,其相对免疫保护率(relative percentage survival,RPS)达85.9%。结果表明约氏黄杆菌减毒株M170可引起鳜特异性和非特异性免疫应答,并提供良好的免疫保护效果。     

pH对大眼鳜和翘嘴鳜蛋白酶活性的影响

研究了不同pH值对大眼鳜消化道不同部位蛋白酶活性的影响及在最适pH条件下与翘嘴鳜消化道蛋白酶活力的差异。结果表明,大眼鳜消化道不同部位蛋白酶的活性强弱顺序为:幽门盲囊>胃>前肠>后肠,其最适pH分别是:10.4、2.8、9.5、10.1。翘嘴鳜的胃和幽门盲囊蛋白酶活力明显高于大眼鳜(P<0.01),而肠的蛋白酶活力略低,差异不显著(P>0.05)。     

FIASCO法筛选鳜鱼微卫星标记

通过FIASCO(Fast Isolation by AFLP Sequences Containing repeats)法构建鳜鱼(Siniperca chuatsi)基因组微卫星富集文库,分离微卫星DNA序列并对其特征进行分析。鳜鱼基因组DNA经MseⅠ限制性内切酶消化后,选取200~800 bp的片段与MseⅠ接头连接,用生物素标记的寡核苷酸探针(AC)8、(CT)8、(AT)7、(GATA)8、(GATT)7与其杂交,杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,变性洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增形成双链,然后克隆到pGEM-T载体上,转化至DH5α中,首次成功构建鳜鱼基因组微卫星富集文库。对其中100个阳性克隆进行测序,60个(60%)含有微卫星序列(GenBank Accession Number:DQ789247~DQ789306)。成功设计了47对鳜鱼微卫星引物,并合成21对引物进行PCR扩增,结果筛选出18个多态性微卫星标记。结果表明:FIASCO法能有效提高筛选微卫星标记的效率。本研究筛选的微卫星标记可以用于鳜鱼遗传背景分析和遗传连锁图谱构建,并将为鳜鱼基因组结构分析、标记辅助育种以及数量性状位点(QTL)基因的定位等研究提供候选微卫星标记。