草鱼线粒体细胞色素b基因的克隆与序列分析

用DNAExtractionKit提取草鱼(Ctenopharyngodonidella)肝脏的总DNA,合成特异引物,进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖电泳检测、纯化后克隆到pGEM Teasyvectorsystem的T载体上,筛选转化子,提取质粒,酶切鉴定。重组质粒序列测定的结果显示克隆了草鱼线粒体细胞色素b(cytb)基因1140个碱基及两侧部分序列共1254bp。用DNA分析软件VectorNTI6.0比较草鱼与GenBank中18种鱼类cytb的序列,显示草鱼与它们的cytb基因具有较高的同源性;根据草鱼与这18种鱼的cytb基因序列同源性所建立的进化树,与传统的分类地位基本吻合。     

草鱼胰岛素样生长因子_基因克隆及序列分析

采用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,从草鱼肝脏的总ＲＮＡ中扩增出胰岛素样生长因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）基因序列,定向克隆至质粒pUC18,测宇了该基因序列,推导期编码的蛋白序列,克隆的cDNA序列编码包括Ｂ,Ｃ,Ａ,Ｄ和Ｅ五个区域的１７个氨基酸,与鲤ＩＧＦ－Ｉ成熟肽比较,核酸序列和氨基酸序列的同源性分别为９３．８％和９７．１％,E区域分析结果表明,所克隆的草鱼ＩＧＦ－Ｉ序列属于ＩＧＦ－ＩＥa-2亚型。     

草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建

以据草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白的全基因序列(GeneBank AF403394)为模板,采用RT-PCR构建了草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白基因植物表达载体的构建。结果显示:实验构建的pCR 2.1-VP6重组质粒含有NcoⅠ和BglⅡ酶切位点;pCR 2.1-VP6重组质粒经PCR扩增和测序显示含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因读码框片段。将目的片段VP6酶切、克隆到携带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pCAMBIA1302中,再经酶切、PCR扩增和序列测定显示,pCAMBIA1302-VP6含有1.3 Kbp的草鱼呼肠孤病毒VP6基因片段,说明已插入植物表达载体pCAMBIA1302绿色荧光蛋白基因前,成功构建了融合表达草鱼呼肠孤病毒VP6蛋白和绿色荧光蛋白的植物表达载体pCAMBIA1302-VP6。     

“全鱼”Mx基因重组构建与转导分析

通过分子重组将鲫Mx1基因的编码序列克隆到鲤β肌动蛋白基因启动子下游,构建成能在鱼体内表达的转“全鱼”Mx基因的重组分子.采用显微注射方法,将含有鲤β肌动蛋白基因启动子和鲫Mxl基因序列的重组片段转入草鱼受精卵中,经人工孵化和养殖获得转全鱼Mx基因草鱼.经PCR和Southern杂交检测分析,证实重组分子成功整合到2月龄转基因草鱼基因组中,为草鱼抗病育种研究奠定了基础.     

霍乱弧菌TcpA蛋白的表达及其免疫活性分析

采用PCR方法从鱼源霍乱弧菌Y1株（Vibrio cholerae Y1）扩增毒素共调菌毛蛋白A(toxin-corcgulated pilin A,TcpA)基因并克隆至pMD 18-T载体.序列分析显示tcpA基因ORF长675 bp,编码224个氨基酸(GenBank登录号EU649677).同源性比对发现,该基因与GenBank中登录的7个霍乱弧菌参考株相应基因序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性均很高,分别为99.6％～ 99.7％和98.7％～ 99.1％,表明TcpA蛋白相当保守.将tcpA基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,并进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现分子量约为47.0 kD的重组TcpA融合蛋白主要以包涵体形式表达.Western blot检测结果显示,重组TcpA融合蛋白可与鼠抗Vc Y1菌株菌毛蛋白抗血清发生特异性结合反应.用纯化的重组TcpA融合蛋白免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)制备抗血清,双相免疫扩散试验检测抗体效价达1:16,且该抗血清能够明显抑制Vc Y1菌株对HEp-2细胞的黏附.草鱼免疫后第25天用Vc Y1菌株攻毒,结果相对免疫保护率达到73.33％.研究结果表明,组TcpA蛋白仍保留着天然菌毛蛋白的免疫原性、免疫反应性和免疫保护性,重组TcpA蛋白可作为霍乱弧菌的候选诊断抗原和疫苗抗原.     

红笛鲷主要组织相容性复合物Ⅰα抗原基因的克隆与表达分析

为研究红笛鲷免疫防御相关基因的作用机理和调控机制,实验应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)成功克隆了红笛鲷组织相容性复合物Ⅰα(MHCⅠα)抗原基因的全长cDNA序列,MHCⅠα的全长序列为1 369 bp,编码354个氨基酸残基。BLAST分析显示,红笛鲷MHCⅠα与其他已知物种MHCⅠα基因的最高同源性为84%。构建的系统进化树显示,红笛鲷MHCⅠα与石斑鱼等MHCⅠα亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明,MHCⅠα在头肾中的最大表达量出现在哈氏弧菌ZJ0706诱导后6～15 h内;构建的重组表达质粒pET32a-MHCⅠα经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了正确表达。将纯化后的重组蛋白与佐剂混合后免疫新西兰纯种大白兔制备多克隆抗体。ELISA检测显示,所获得的兔抗血清效价约为1∶40 000。Western blot检测发现,本实验制备的抗血清能特异性地与重组蛋白发生抗原抗体反应。     

海带雄性配子体差异表达基因片段的克隆及筛选

利用抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization，SSH）获得了海带雌、雄配子体差异表达的cDNA片段，将雄配子体差异表达的cDNA片段克隆于pGEM-T载体并转化大肠杆菌（Escherichia coli）JM109，构建雄配子体差异表达的cDNA消减文库。自750个阳性克隆中随机挑选100个进行PCR扩增鉴定，电泳图谱表明插入片段大小在200～1000bp之间。进一步经过Southern斑点杂交筛选后，选取10个阳性克隆进行测序和序列分析，有7个片段与GenBank数据库中已知基因序列无明显同源性，初步判断为新的基因序列，3个片段与已知脚基因和Lhcf6基因的同源性分别达到88％和98％。     

禽多杀性巴氏杆菌PlpB基因交叉保护力研究

根据报道的PM70菌株的PlpB基因序列,设计PlpB基因一对寡核苷酸引物。以C48-1菌株为实验材料,成功扩增PlpB基因的全序列,该片段共831bp。将扩增基因插入原核表达载体pGEX-KG,成功构建了重组表达质粒pKG-PlpB,并对pKG-PlpB重组表达质粒进行序列测定,结果表明:扩增序列与GenBank上所报道的PM70株的PlpB基因序列核苷酸同源性在99%以上。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导获得大小约56KDa的表达蛋白。Western blot检测表明,该表达蛋白具有良好的反应原性。     

草鱼PGC-1α基因的表达及饲喂n-3 HUFAs对其影响

获得了草鱼过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助活化因子1α(PGC-1α)部分cDNA序列(GenBank注册号为HM015283),并进行了序列同源性分析;采用实时定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)方法,检测了PGC-1α基因在草鱼不同组织的表达状况;研究了投喂高不饱和脂肪酸(HUFAs)对草鱼肝胰脏PGC-1α基因时序表达的影响。结果显示,所获得的草鱼PGC-1α基因部分cDNA序列长度为612bp,与人、牛、小鼠、斑马鱼和金鱼等动物的同源性为75%～97%;该基因在草鱼肝胰脏、肾脏、肌肉、心脏、鳃等10个组织中均有表达,其中在肾脏和心脏中表达丰度最高,在精巢和脾脏中表达丰度最低;草鱼摄食HUFAs饲料后第7天PGC-1α基因的表达水平极显著升高,随后又迅速下降。研究首次克隆得到草鱼PGC-1α基因部分cDNA序列,并发现该基因在草鱼能量代谢水平高的组织中表达较高,且其表达受到HUFAs的调控,其时序表达模式为先升高,然后恢复到正常水平。     

半滑舌鳎生长激素及其受体基因的原核表达

根据已克隆的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长激素(GH)基因和生长激素受体Ⅰ(GHR-Ⅰ)基因的cDNA序列信息设计引物,用于扩增半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因序列。随后,分别利用表达载体pET-32a和pGEX-6P-1成功构建了包含半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因ORF全序列及不同ORF片段的6个重组质粒,并将获得的重组质粒在表达宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示:重组GH的pET-32a-CSGH质粒在40 kD处有特异性的蛋白条带,重组GHR-Ⅰ胞内区的pGEX-6P-1-CSGHR1-2质粒在70 kD处发现诱导的蛋白条带,其表达量分别占细胞蛋白总量的37.6%和20.2%;而构建的pGEX-6P-1-CSGH重组质粒和含有GHR-Ⅰ基因跨膜区的重组质粒(pET-32a-CSGHR1-1、pET-32a-CSGHR1-2和pGEX-6P-1-CSGHR1-1)均未获得表达产物。由此可见,半滑舌鳎GHR-Ⅰ基因的跨膜区可能影响其在大肠杆菌中的表达。研究结果为实现半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ制剂的开发及应用于养殖生产实践奠定基础。     

鱼类Hox基因簇结构、表达和进化方面研究进展

Hox基因（horneobox genes,同源异型盒基因）是一类含有同源框、参与动物早期胚胎发育的关键基因。其在胚胎发育中的表达水平对组织和器官的形成有重要的调控作用。脊索动物如文昌鱼（Branchiostoma floridae）有1个Hox基因簇,包括15个基因;哺乳动物有4个基因簇,各含有约13个Hox基因,位于4条染色体上;硬骨鱼类的连锁群更多,如斑马鱼（拉丁名）基因组中有7个Hox基因连锁群。分析不同鱼类的同源框基因家族（Homobox gene familv,Hox）的结构组成,揭示Hox基因家族在不同进化时间的进化动态和规律,以更好地阐释在新基因形成、物种分化以及维持遗传系统稳定性等作用,探讨DNA序列的同源性和不同物种间的亲缘关系,这对于保护生物多样性,尤其是遗传多样性、揭示生物进化历程及其机理具有参考意义。     

鱼类嗅觉受体基因研究进展

嗅觉是鱼类感知外界环境的重要器官,参与觅食、定位、避敌以及生殖洄游等行为。嗅觉功能基于嗅觉信号通路并由嗅觉受体蛋白识别外界环境中的气味分子而实现。嗅觉受体基因编码G蛋白偶联受体蛋白,在脊椎动物中已发现的嗅觉受体基因有5个家族,即主嗅觉受体基因(MOR)、犁鼻器Ⅰ型受体基因(V1R/ORA)、犁鼻器Ⅱ型受体基因(V2R/OlfC)、痕量胺相关受体基因(TAAR)和甲酰基肽受体基因(FPR)。鱼类占脊椎动物所有种类的50%以上,近年有关鱼类嗅觉受体基因的研究越来越多,新的发现不断涌现,但目前国内的相关文献甚少。本文总结了鱼类嗅觉受体基因家族的研究进展,整理了研究中遇到的有关问题和相应对策,并对研究前景作了展望,旨在为国内鱼类嗅觉受体基因的研究提供参考资料。     

A novel multiplex PCR method for detecting virulent strains of Vibrio alginolyticus

The bacterial strains obtained from various origins were tested with the novel primers targeting the collagenase gene, ompK gene and toxR gene to establish a multiplex polymerase chain reaction (PCR) method. These primers successfully recognized all virulent strains of Vibrio alginolyticus, but the avirulent strains were not recognized by the multiplex PCR because of lack of the collagenase and toxR genes. In a 50 μL multiplex PCR mixture, the lowest detection limit is 8.8 × 10² cells of virulent strains of V. alginolyticus. The multiplex PCR method was successfully developed to identify virulent strains of V. alginolyticus, and provides a rapid, sensitive, specific and reliable technology for diagnosing virulent strains of V. alginolyticus. Therefore, the novel multiplex PCR in the present paper can be useful for any laboratory working with vibriosis detection of aquatic animals.     

脊尾白虾14-3-3 基因cDNA 全长的克隆和表达分析

利用本实验室构建的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)血细胞cDNA文库中脊尾白虾14-3-3巨球蛋白基因EST序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆获得脊尾白虾14-3-3基因c DNA全长,命名为Ec14-3-3。该基因全长2905 bp,包含744 bp的开放阅读框,编码247个氨基酸组成的蛋白质,分子量为27.95 kD,理论等电点为4.65。同源性分析表明,脊尾白虾Ec14-3-3氨基酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)14-3-3的同源性最高,达到98%。荧光定量PCR分析结果表明,Ec14-3-3基因在血细胞、卵巢、肝胰腺等组织中均有表达,其中血细胞中Ec14-3-3相对表达量最高。感染鳗弧菌和WSSV后6 h,脊尾白虾血细胞和肝胰腺中Ec14-3-3基因的表达量较对照组均显著增加(P0.05),且具有明显的时间差异性。本研究结果表明,Ec14-3-3基因在脊尾白虾免疫反应中发挥重要作用。     

一株病原发光杆菌的分离与鉴定

从三疣梭子蟹育苗场发病且大量死亡的大眼幼体中分离到优势生长的菌株SX1,人工感染试验证明,SX1对健康三疣梭子蟹大眼幼体及Ⅲ期幼蟹有较强的致病性;对菌株SX1进行了形态特征、理化特性等表型生物学特性检验,并进行了菌株SX1的16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因的同源性检索与系统发育学分析。结果显示,菌株SX1具有发光杆菌属的特征,且16S rRNA、gyrB和rpoA 3种基因序列均与发光杆菌具有较高的同源性,在系统发育树中与Photobacteriumganghwense聚为一个分支,自举数据值达100%。综合菌株SX1的形态特征、理化特性及3种基因的同源性检索与系统发育学分析,研究表明菌株SX1与P.ganghwense亲缘关系更近,鉴定SX1为P.ganghwense且为本次引起三疣梭子蟹大眼幼体大量死亡的病原菌。     

斑马鱼BLT1-like基因的克隆和表达分析

利用RACE技术克隆得到了斑马鱼(Danio rerio)白三烯B4受体样(BLT1-like)基因BLT1-like1和BLT1-like2的全长cDNA序列,其分别编码339和356个氨基酸。序列和结构分析发现,其编码的两个蛋白均属于G蛋白偶联受体家族视紫红质蛋白亚族,并具有典型的G蛋白偶联受体的特征,与人的BLT1同源度达31%以上。进一步将两基因与绿色荧光蛋白融合表达,发现其具有较好的细胞膜定位功能;Western印迹检测也证实,重组表达细胞的全细胞蛋白可与人源BLT1的多克隆抗体发生特异性相互作用。此外,荧光定量PCR分析结果显示,在斑马鱼幼鱼发育过程中,BLT1-like1基因在胚胎发育12 h显著上调,mRNA表达量上升至1 h的18倍,而BLT1-like2基因在胚胎发育24 h发生显著上调,表达量上升至1 h的34倍;而在斑马鱼成鱼中两个基因在心脏和肝脏中表达量相对较高,而肠、皮和眼睛中表达量相对较低。本研究的结果说明斑马鱼中可能存在多个BLT1基因,并为鱼类BLT1基因的克隆和功能鉴定提供基础。     

高温诱导对性成熟尼罗罗非鱼性腺中性别分化相关基因表达的影响

利用qRT-PCR系统分析了高温诱导对8月龄尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)性腺组织中8个性别分化相关基因、4个热激蛋白基因及2个甲基转移酶基因表达的影响。结果显示, 高温诱导能显著下调卵巢发育相关基因Cyp19a1a、ERα和ERβ的表达水平(P<0.05), 但对雌鱼精巢发育相关基因Cyp11b2和Dmrt1的表达水平没有显著影响(P>0.05), 这与高温对性腺分化期罗非鱼性别分化相关基因表达的影响不同。高温诱导后雌雄鱼性腺中Hsp70的表达水平显著上升(P<0.05), 而DNAJB1的表达水平却显著下降(P<0.05), Hsp27和Hsp90的表达水平无显著变化。高温诱导能显著上调雌鱼性腺中Dnmt1与Dnmt3a基因的表达水平(P<0.05)。本研究通过分析高温诱导对性成熟尼罗罗非鱼性别分化相关基因表达的影响, 旨在揭示高温诱导对罗非鱼性别分化相关基因表达的影响具有一定的时期特异性, 为研究温度影响鱼类性别分化的分子机理提供基础。

     

6个不同海域文蛤地理群体的亲缘关系分析

为探究中国辽东半岛海域(辽宁群体)、长江口及其两翼海域(江苏群体)、台湾海峡西部海域(福建群体)、珠江口及其两翼海域(广东群体)、北部湾海域(广西群体)以及日本伊势湾海域(三重群体)6个不同海域文蛤(Meretrix meretrix)地理群体的亲缘关系,采用18S rRNA基因、线粒体细胞色素氧化酶c亚基Ⅰ(COⅠ)及16S rRNA基因3种分子标记进行序列测定与分析。测序结果显示,3种基因序列长度分别在1 854、658、596 bp左右;18S rRNA基因碱基组成无偏异,序列较为保守;COⅠ与16S rRNA基因A+T平均含量明显大于G+C含量,符合线粒体基因组成特征。通过Meg Align软件比对6个地理群体文蛤,序列相似百分比分别为99.7%~100.0%(18S)、91.7%~99.8%(COⅠ)、90.2%~99.8%(16S),其中三重文蛤序列差异最大;以文蛤属的帘文蛤(Meretrix lyrata)作外群,采用MEGA 5.03软件中相邻连接法(NJ)构建系统发育树显示,我国沿海5个文蛤群体聚为一枝且与日本三重文蛤分开,自展值分别为67%(18S)、99%(COⅠ)、98%(16S);我国沿海5个文蛤群体中,辽宁、江苏、福建文蛤群体首先聚在一起,其次是广西文蛤群体,最后是广东文蛤群体。研究结果表明,辽宁、江苏、福建文蛤群体同源性较高,亲缘关系最近;广西文蛤群体、广东文蛤群体与我国其它文蛤群体间遗传差异较大,地理遗传分化明显;而日本三重文蛤与我国沿海文蛤可定为文蛤的2个地理亚种。     

施氏鲟下丘脑神经肽基因的克隆、序列分析及表达特征

为了解下丘脑神经肽(kisspeptin)在施氏鲟(Acipenser schrenckii)生殖调控中的作用,采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和RACE技术首次克隆得到施氏鲟2个kisspeptin基因的全长cDNA序列,命名为kiss1和kiss2,并对它们编码氨基酸序列的特征及时空表达模式进行分析。结果表明,施氏鲟kiss1基因的cDNA全长为522 bp,编码130个氨基酸;kiss2基因的cDNA全长为518bp,编码149个氨基酸;Kiss1和Kiss2均以α-螺旋和无规则蜷曲为二级结构中的主要元件,且为含有信号肽、无跨膜结构、分泌到细胞外的不稳定亲水性蛋白质。氨基酸序列比对及进化分析表明,施氏鲟Kiss1和Kiss2具有高度保守区域,与达氏鲟(Acipenser dabryanus)Kiss1和Kiss2蛋白序列一致性最高,亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,施氏鲟kiss1和kiss2的表达具有组织特异性,其中kiss1在性腺中的表达量最高,而kiss2在脑中的表达量最高。kiss2在早期性腺发育过程中的表达量检测显示,在孵化后0～49 d, kiss2的表达量较低,而kiss1的表达量则较高,在孵化后21 d达峰值;随着性腺的发育(孵化后64～199 d), kiss2的表达水平逐渐升高并在139 d达到最高,随后下降;与kiss2表达模式不同, kiss1的表达量在孵化后184 d达到峰值。以上结果表明, kisspeptin基因在施氏鲟早期性腺发育过程中具有重要的作用,且其调控功能存在差异。本实验为进一步阐明kiss1和kiss2的生理功能和分子调控机制奠定了理论基础。     

三角帆蚌kinase X基因的克隆及功能初探

三角帆蚌是我国特有的淡水育珠蚌,在养殖业中占有重要地位,在实际养殖过程中,雄性个体有着明显的产珠优势,因此对性别决定的相关研究至关重要。研究发现Sox9基因在许多物种中起到性别决定的作用,kinase X基因是蛋白激酶(PKA)合成中至关重要的基因,而Sox9基因很可能受到PKA激酶的调控。实验通过RACE法克隆kinase X基因的全长cDNA序列,使用荧光定量PCR的方法检测该基因在2龄雌雄三角帆蚌各组织中的相对表达量,利用RNA干扰技术研究干扰链对kinase X基因及下游基因Sox9基因表达的影响。结果显示,kinase X基因全长1 652 bp,编码430个氨基酸;荧光定量PCR结果显示,kinase X基因在雄性性腺中表达量最高,雌雄间差异极显著;RNA干扰结果显示,合成的干扰链均对kinase X基因有着一定的干扰效率,其中干扰链1的干扰率最高,在雌性中的干扰率为83.1%,雄性中为81.9%,同时干扰链1干扰后Sox9基因的表达量在雌性中下降了90.3%,雄性中下降了56.6%,推测这两个基因可能参与性别决定过程。本实验为三角帆蚌性别决定和雄性单性化育种研究提供理论基...