抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用

用抑制性消减杂交技术（SSH）研究与鲤鱼（Cyprinus carpio）抗寒性状相关的基因。通过对荷包红鲤抗寒品系（Cyprinus carpio wuyanensis Tchang）和柏氏鲤（Cyprinus pellegnini Tchang）杂交F2代进行降温诱导实验，获得不同温度下的实验材料。利用抑制消减杂交技术构建了一个低温下差异表达基因的消减cDNA文库，共含有2000个克降。对其叶1480个克隆进行斑点杂交筛选，共得到60个阳性克隆，选取其中29个克隆测序。通过序列分析比对，13个克隆与已知基因序列高度同源，同源性为85％-98％；另外的13个克隆为未知新基因序列。在13个同源性较高的克隆序列巾，有brevican基因、AMP—acid连接酶、CFL2基因、催产素基因、主要组织兼容复合体（MHC）Ⅱβ链、锌指蛋白、细胞色素氧化酶、EPD-1基因、透明质酸结合蛋白多糖类、核受体／类视色素信号调节器等，其中9个基因上调表达，另有4个则抑制表达。这些基因的获得可为研究鱼类抗寒性状以及从分子水平上阐明其机制提供重要依据。     

链状亚历山大藻抑制消减杂交文库的构建及分析

为了筛选链状亚历山大藻特异表达的发光相关基因,应用抑制消减杂交技术,构建了链状亚历山大藻特异表达的cDNA消减文库,共获得500个克隆,通过基因PCR初步筛选表明插入片段的大小主要集中在250～1000 bp,随机挑选10个阳性克隆进行双向测序和序列比对分析,有2个克隆基因片段与已知基因序列高度同源,分别为荧光素结合蛋白和羧化酶/加氧酶,另有8个克隆基因片段在GenBank中未查找到相应的同源基因,可能为未知新基因序列.这些基因的获得为进一步研究链状亚历山大藻特异表达基因,阐明其发光机理及建立特异甲藻的新型检测方法提供重要依据.     

三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性消减杂交技术构建了三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库。经检验，差异表达基因均被富集了 2¹⁰倍左右，证明构建的 cDNA 消减文库具有很强的消减效率。PCR 鉴定发现，在随机挑取的阳性克隆中，95% 的克隆均含有 0.2～1.0 kb 的插入片段，这些片段可能是三角帆蚌瘟病病毒感染后差异表达基因的cDNA片段。测序共获得 214 个有效 cDNA 序列，分别属于8 大类，共 98 个基因。其中细胞分裂基因 2个、细胞结构与运动基因 9 个、代谢基因 10 个、信号传导基因 7 个、细胞防疫基因 10 个、基因与蛋白表达基因 20 个、未知功能蛋白基因 26 个，GenBank中找不到任何同源序列的基因 14 个。结果说明，构建的差异表达cDNA文库，可较好地反映三角帆蚌瘟病病毒对三角帆蚌影响的基因信息。     

海带雄配子体抑制消减cDNA文库的生物信息学分析

对海带(Landnaria japonica Axesch.)雄配子体抑制消减cDNA文库进行生物信息学分析,并通过Northern印迹杂交进一步验证了雄配子体2个优先表达的基因.结果表明,(1)由627个克隆产生的618条高质量cDNA可聚类成187条非冗余序列(NRS);其中93条Contig由524条cDNA拼接而成,剩下的94条为Singleton(只有单条cDNA),冗余率达69.74%.(2)5条NRS因与rRNA基因相匹配而不进行分析;60条NRS与GenBank中注释蛋白基因显著匹配;122条NRS无显著匹配.(3)大部分已知功能的基因与物质和能量代谢(26.7%)、生长发育(13.3%)有关,其中与叶绿体光捕获蛋白复合体有关的基因有106条cDNA,所涉及的有lhcf6基因(62条cDNA)与fcp基因(12条cDNA)等.(4)经Northern印迹杂交证实lhcf6和fcp2个基因在处于营养生长期的雄配子体中优先表达.(5)90条Contig的总G+C含量平均值为52.58%,表明了密码子的使用对G、C有明显的倾向性;20个推测功能蛋白(1520密码子)密码子第三位碱基的使用偏好C(40.7%),其次是G(33.9%);终止密码子的使用偏好TGA(54.5%).本研究为海带雌、雄配子体差异表达基因克隆、分析和功能基因组学等研究提供了信息.     

皱纹盘鲍外套膜耐维生素E缺乏消减cDNA文库的构建

为了克隆维生素E缺乏时皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)外套膜差异性表达的基因,本研究配制了维生素E缺乏水平(3.5 mg/kg)和正常添加水平(52.8 mg/kg)的人工饲料,喂养皱纹盘鲍幼鲍,初始体质量为(0.71±0.00)g,初始壳长为(15.49±0.04)mm,240 d后,采用抑制消减杂交法(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)构建了维生素E缺乏组与正常组外套膜组织差异表达的cDNA消减文库。经检验,差异表达的基因均被富集了25-28倍,证明构建的cDNA消减文库具有很强的消减效率。从文库中随机挑取100个白色克隆摇菌液进行PCR鉴定,95%的克隆中均有100-900 bp的插入片段,这些片段可能是维生素E缺乏差异表达基因的cDNA片段。选取含插入片段大小不同的48个克隆测序,其中有16个新基因,10个谷胱甘肽转移酶的基因,5个谷胱甘肽过氧化物酶基因,2个过氧化氢酶基因,3个羟基类固醇脱氢酶基因,4个酪氨酸激酶基因,1个类甲状腺过氧化物酶蛋白基因,3个纤维素酶基因,1个cAMP效应元件结合蛋白基因,3个贝壳生物矿化相关蛋白的基因。总的来说,利用抑制消减杂交的方法构建差异表达cDNA文库,可以比较好地反映维生素E对皱纹盘鲍影响的基因信息,为研究其他营养素对皱纹盘鲍基因表达的影响提供了基础数据。     

鲤的微卫星标记与体质量、体长、体高和吻长的相关分析

采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术研究皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino.)Vc缺乏诱导的差异表达基因.实验用皱纹盘鲍成鲍初始体质量为(74.32±0.43)g,初始壳长为(84.36±0.24)mm.配制了Vc缺乏(0.0 mg/kg)和高剂量添加(4 967.5 mg/kg)2个水平的人工饲料进行饲喂.经过170d的养殖后,分别构建肝胰腺和肾脏Vc缺乏消减cDNA文库.消减杂交效率分析显示,差异表达的基因分别被富集了大约25和25～210倍.从两个文库中随机挑选阳性克隆进行测序.在肝胰腺消减cDNA文库中获得63个片段,其中已知功能基因占54.0%,Gene ontology(GO)按照功能将其分为4类:代谢相关基因占15.9%,细胞代谢相关基因占30.2%.生物调节相关基因占4.8%,其他功能基因占3.2%.未知功能基因占46.0%.在肾脏消减cDNA文库中获得39个片段,其中已知功能基因占53.8%,GO将其分为3类:代谢相关基因占5.1%,细胞代谢相关基因占28.2%,生物调节相关基因占20.5%.未知功能基因占46.2%.其中,获得了包括细胞色素c氧化酶、葡萄糖-1脱氢酶、α-葡萄糖苷酶、β-1,3-D-葡聚糖酶、纤维素酶、藻酸盐裂解酶以及铁蛋白等在其他动物中被证明与Vc合成相关的基因,为进一步研究皱纹盘鲍Vc的合成和代谢奠定了基础.     

海带配子体中孢子形成相关蛋白(SRP)基因的克隆及其原核表达

从已构建好的海带雄配子体抑制消减cDNA文库中,通过Southern点杂交及序列分析,发现一未知功能的差异表达基因片段(克隆b9)。首先根据该克隆序列设计基因特异性引物,利用cDNA末端快速扩增技术,自雄配子体中克隆了一条长831 bp的cDNA序列,其中开放阅读框450 bp,5′-非翻译区182 bp,3′-非翻译区199 bp且具有明显的poly(A)尾巴。同样利用PCR方法自雌配子体中克隆了该基因的cDNA序列,它与雄配子体的完全一致。蛋白同源搜索结果显示,该基因编码蛋白与点形念珠藻含有SpoIID/LytB结构域蛋白(SpoIID/LytB domaincontaining protein:一种孢子形成时起作用的蛋白质)具有30%相似性,故暂命名为孢子形成相关蛋白基因(sporulationrelated protein gene,srp)(GenBank登录号:EF490313)。然后构建了srp基因原核表达载体pET-28a-srp,并将其转化至大肠杆菌BL21中进行表达,获得了分子量大小约19.3 ku的目的蛋白,且表达量与诱导物IPTG的量成正比。通过高效液相色谱-质谱分析证实,重组蛋白的氨基酸序列与推测的目的蛋白一致。最后纯化重组了SRP蛋白并制备其多克隆抗体,利用该抗体并运用Western印迹技术,在海带配子体中证实SRP蛋白的存在。     

利用DD-PCR分离鳗弧菌刺激相关的牙鲆差异cDNA及表达

本研究采用mRNA差异显示技术(mRNA differentid display,DD-PCR)分离得到20个鳗弧菌(Vibrio anguillarum)诱导前后差异表达的牙鲆(Paralichthys olivaceus)cDNA片段。通过对差异片段进行回收、再扩增、克隆、测序、序列比对以及验证分析后,得到9个阳性片段,其中2个片段与已知基因高度同源,一个与牙鲆C3补体高度同源,同源性98%,另一个与牙鲆TEGT(睾丸增强基因转录子)基因高度同源,同源性98%;其余7个为新的cDNA片段。基因表达分析表明,这9个差异片段均在处理组、对照组的不同器官和时间段差异表达,而且多数片段经鳗弧菌诱导后都在肝脏、肾脏、脾脏等鱼类主要免疫器官中上调表达,初步推测它们都是和牙鲆免疫或鳗弧菌病相关的基因。对这些基因进一步的功能研究将对牙鲆的抗病育种及养殖业提供重要的参考。     

施氏鲟精巢和卵巢差减cDNA文库的构建和差异表达EST的筛选

应用抑制差减杂交（SSH）技术构建了施氏鲟（Acipenser schrenckii）精巢和卵巢组织的SMART cDNA文库及其cDNA差减文库，从两个差减文库中随机挑取200个克隆进行PCR检测，随机挑选其中的123个cDNA克隆测序。将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较，发现有55个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性，68个片段与已报道的基因有较高的同源性，其中17个cDNA片断为精巢中特异表达的基因，而51个为卵巢中特异表达的基因。精巢中大量表达的主要为延长因子（EF-1）和脂肪酸连接蛋白等与精子生成发育有关的基因，而卵巢主要为ZPC、组蛋白和周期蛋白等与卵细胞发育成熟相关的基因。这些EST数据为进一步筛选和克隆鲟鱼性腺组织特异性表达基因提供了材料平台，为鲟鱼基因组数据增补了大量信息。     

孔石莼在干出胁迫下上调表达基因消减cDNA文库的构建及分析

利用抑制消减杂交技术构建了潮间带绿藻孔石莼(Ulva pertusa)在干出胁迫状态下上调表达基因的消减cDNA文库.获得的阳性克隆经测序得到150条上调表达的EST片段,其中21条为冗余序列(RS),137条非冗余序列(NRS).片段中最长833 bp,最短106 bp,平均长度364 bp.参与比对的EST片段按照...     

红笛鲷头肾消减cDNA文库的构建与分析

应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾消减cDNA文库,筛选红笛鲷免疫相关基因的EST.以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活疫苗体内诱导红笛鲷为实验组,以注射无菌生理盐水的红笛鲷为驱动组,通过SSH技术构建红笛鲷头肾消减.DNA文库.利用PCR技术和斑点杂交对文库进行筛选,从2 424个含插人片段的阳性克隆中筛选了680个克隆在上海生工进行了序列测定.使用BLASTx和BLASTn工具对获得的ESTs与GenBank数据库进行同源性比较并根据相似性序列的名称通过GO法对ESTs进行注释.结果获得了30个与红笛鲷免免疫防御相关基因的EST,如组织相容性抗原复合物基因(MHC I和MHCII),免疫球蛋白基因(IgH和IgL)、热休克蛋白基因(HSP10,HSP70和HSP90)等.本研究构建了哈氏弧菌灭活疫苗免疫后与正常组织差异表达的消减cDNA文库,并获得一批与红笛鲷免疫防御相关的ESTs,旨在为探讨红笛鲷分子免疫防御机制、筛选参与免疫防御调控相关的功能基因,揭示红笛鲷免疫抗病机制、提高机体抗病力、实现遗传改良奠定基础.     

编码鹰爪虾蜕皮抑制激素基因的cDNA片段的克隆和序列分析

提取鹰爪是眼柄总RNA，以眼柄总RNA为模板，根据日本对虾的具有蜕皮抑制活性的神经肽Pej-SGP-Ⅳ的氨基酸设计兼并引物，进行RT-PCR扩增，在适宜条件下得到一特异性片段。将这一特异性片段克隆到载体中进行测序，测得鹰爪虾的特异性cDNA片段由213个碱基对组成，推测的氨基酸序列由71个氨基酸组成。序列比较发现许多甲壳动物的CHH家庭神经肽与它相似。在所有与该序列推测的氨基酸序列相似的甲壳动物CHH家族神经肽中，MIH与它的相似度最高，表明由鹰爪虾眼柄特异性cDNA片段椎定的氨基酸基酸序列可能是鹰爪虾的MIH片段，它相当于MIH成熟肽的第5至75个氨基酸。     

Characterization of 95 novel microsatellite markers for Zhikong scallop Chlamys farreri using FIASCO-colony hybridization and EST database mining

ABSTRACT:   In order to construct a simple sequence repeat (SSR)-based genetic linkage map and to promote molecular marker-assisted selection (MAS) in scallop breeding, the methods of Fast Isolation by AFLP of Sequences COntaining repeats (FIASCO)-colony hybridization and expressed sequence tag (EST) database mining were modified and used to develop 95 novel microsatellite markers for Zhikong scallop. The SSR-enriched library constructed by the FIASCO method consisted of 830 clones, and 295 (35.5%) positive clones were identified after colony hybridization. One hundred and fifty clones were randomly sequenced and the results showed all clones contained at least one microsatellite. Of 91 primer pairs designed, 72 were amplified scorable polymerase chain reaction (PCR) products and 70 were polymorphic with the allele number range of 3–16 alleles/locus (average 7.0 alleles/locus). When EST database mining was performed, 66 microsatellites containing ESTs were identified from 3467 sequences deposited in GenBank. Based on cluster analysis of length and GC content of the flanking regions, 47 primer pairs were designed and 23 scorable EST SSRs were obtained. Compared with genomic SSRs developed in this study, EST SSRs showed lower genetic variability with an average of 4.2 alleles/locus. The results in the present study demonstrate that modified FIASCO-colony hybridization is an efficient and low-cost method for the isolation of large numbers of microsatellite markers for scallop species.     

Development of a polymerase chain reaction (PCR) procedure for the detection of baculovirus associated with white spot syndrome (WSBV) in penaeid shrimp

The causative viral agent was purified from diseased shrimp Penaeus japonicus with white spot syndrome (WSBV). Several hundred clones were obtained from libraries of the purified viral genomic DNA. According to the results of nucleotide sequence analysis, none of the WSBV clones showed considerable sequence homology with those of other known viruses, indicating that WSBV is a new virus causing a serious disease in shrimp. Based on the sequence data of WSBV genomic DNA, a pair of polymerase chain reaction (PCR) primers was designed. After 30 cycles of PCR amplification of viral genomic DNA extracted from WSBV, a single product of the expected size was detected. Southern blot hybridization confirmed that the amplified product was specific to the DNA of WSBV. The PCR system was able to detect 1 pg of WSBV DNA after 30 cycles, and efficiently amplify the target region of WSBV gene in the total nucleic acids extracted either from the diseased shrimp or hatchery shrimp with no signs of viral infection.     

Use of cloned cDNA probes for diagnosis of infectious pancreatic necrosis virus infections

Abstract. A dot-blot hybridization test has been developed for the detection of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in infected fish. For this purpose, cloning of the dsRNA of the West Buxton strain of IPNV was carried out. Two cDNA clones (WB and A4) were characterized for use as diagnostic probes and corresponded to IPNV genome segments A and B. respectively. Clone WB1, with an insert of 812 base pairs, showed an 87 and 77% nuclcotidc sequence homology with the corresponding sequences of Jasper and N1 strains, respectively. Clone A4, with an insert size of 596bp, presented a nuclcotidc sequence homology of 90 and 80% with the corresponding sequences of the Jasper and Sp strains, respectively. Both probes were able to detect 15 ng of purified dsRNA, and were highly efficient in detecting the RNA of American IPNV strains. However, the A4 probe was less effective than WB1 in hybridizing to RNA from European and Spanish strains of IPNV. Both probes detected IPNV RNA in cells 4–8h post-infection with the homologous West Buxton strain, 8–12h post-infection with other American strains and 24h post-infection with the European strains of IPNV. The method was less sensitive in detecting IPNV RNA directly in infected fish tissues. However, the present authors obtained a 100% effectiveness to detect viral RNA in cells inoculated with fish tissues confirmed by conventional diagnostic methods as being infected with IPNV. Therefore, the hybridization test is appropriate if combined with conventional diagnostic procedures, e.g. applying the dot blot hybridization test on tissue cultures 12–24 h after inoculation with infected fish tissue homogenates.     

合浦珠母贝微卫星DNA标记分离与分析

采用生物素标记的（CA）15、（AG）12、（ACA）15、（GATA）8、（GATT）75个探针和磁珠富集法构建马氏珠母贝（Pinctada martensii Dunker）基因组微卫星富集文库。随机挑选500个进行PCR筛选，得到138（27．6％）个候选克隆，测序分析发现130个克隆含有微卫星基重复单元。进一步通过序列比对，最终获得109个具有特异微卫星序列的阳性克隆，其中包含179个微卫星DNA结构域。获得的微卫星序列中，属于完全型序列的有154条，不完全型重复型序列有19条，复合型重复序列有6条。序列长度为70～490bp，平均295bp。微卫星核心序列两碱基重复3到39次，绝大多数序列重复次数大于10。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了13对能够在马氏珠母贝基因组有效扩增的微卫星引物。本研究旨为进一步开展马氏珠母贝分子育种及资源评价分析提供基础资料。     

锯缘青蟹蜕皮抑制激素cDNA的分子克隆及其表达分析

根据近缘种类同源序列设计简并引物,采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术,首次扩增获得锯缘青蟹(Scylla serrata)眼柄组织中编码蜕皮抑制激素(MIH)成熟肽全长cDNA序列及部分信号肽序列。将该序列克隆到pUCm—T载体上进行序列测定。结果表明,编码锯缘青蟹MIH成熟肽的cDNA由234个碱基组成,由此推测MIH成熟肽含78个氨基酸残基。该序列不仅与其它短尾类甲壳动物的MIH氨基酸序列具有高度的同源性(79％～9l％),还与该激素同一家族的性腺抑制激素、大颚器抑制激素的氨基酸序列具有较高的相似性。RNA斑点杂交结果显示,MIH基因在眼柄神经节及脑组织中均有表达,而在肌肉、中肠腺中不表达。     

Development of a Penaeus monodon-type baculovirus (MBV) DNA probe by polymerase chain reaction and sequence analysis

Abstract. Penaeus monodon -type baculovirus (MBV) was isolated and purified from the hepatopancreases of MBV-infected Penaeus monodon Fabricius. MBV DNA was extracted and used as a template in a polymerase chain reaction (PCR). The primers were chosen from conserved regions of the polyhedrin gene of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). One DNA fragment (674 base pairs) was amplified after PCR. There was a 65% homology between the predicted amino acid sequence of this PCR product with that of the polyhedrin polypeptide of AcNPV. Nucleotide sequence analysis indicated that the amplified DNA is the open reading frame of the MBV polyhedrin gene. This 674 bp DNA fragment was subsequently used as a probe in a dot blot analysis. The probe was able to hybridize with the DNA extracted from the purified MBV and from the MBV-infected P. monodon , but not from the MBV uninfected P. monodon.     

海带配子体碳酸酐酶(CA)基因的克隆及其特征分析

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库2个长为376 bp的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),Blastn搜索发现它们与掌状海带的碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)基因序列(GenBank登录号:AJ130777)有70%的相似性,结合该EST以及掌状海带CA基因保守序列设计引物,扩增得到海带配子体CA基因部分开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,再以此为基础设计基因特异性引物,然后利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆得到一条长2 804 bp的cDNA序列(GenBank登录号:JF827608),其中5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长166 bp,3′-UTR长1 765 bp,且具有明显的polyA尾巴,ORF长873 bp。它编码一个由290个氨基酸组成的前体蛋白,预测在20 Gly-21 Val处有一个典型的信号肽酶切位点,酶切后的成熟蛋白由270个氨基酸组成,具有3个锌结合的His残基所构成的催化活性中心,其分子量为30.44 ku,等电点为5.06。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体CA基因都没有差异,且无内含子。Southern-blotting杂交结果显示,海带配子体CA基因为单拷贝基因。蛋白同源性搜索,发现该基因的编码蛋白与掌状海带的α-CA蛋白有87%的同源性。基于36个CA蛋白的氨基酸序列所构建的邻接(Neighbor-Joining)系统进化树显示,自海带配子体中所克隆的CA基因位于α-CA蛋白所组成的一支,推测它可能为α-型,因而不在线粒体中起作用。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-RT-PCR)结果表明,在增加CO₂浓度的条件下,CA基因在海带雌、雄配子体中的日表达量均较未增加的条件下有所增加,由此推测该CA基因不属于胞外CA;基于海带配子体CA蛋白仅具有一个信号肽,可以推测它是定位于叶绿体外膜上,以泵的方式为叶绿体光合作用提供充足的CO₂。