EST-SSR分子标记在水生动物遗传研究中的应用

EST(Expressed Sequence Tag,基因表达序列标签)是指从cDNA文库中随机挑选单克隆进行测序,所获得的序列片段,长度一般约60～500 bp.自Adams等[1]首先提出EST计划并测定了609条人脑组织的EST以来,EST计划在不同物种，尤其是水生动物中得到了不断的扩展和深入的研究.三大EST数据库:NCBI的dbEST、TIGR的Gene Index和南非的STACK中都积累了的大量EST信息.     

鳜肌肉组织cDNA文库构建及其ESTs分析

以鳜(Siniperca chutasi)肌肉为实验材料,采用非均一化引物定向克隆技术构建了鳜肌肉组织cDNA文库,并进行大规模EST测序和序列分析。结果显示,cDNA文库的库容量为2.3×105,重组率达96.5%,平均插入片段长度为1.2 kb。随机挑选5456个克隆,成功测序5191个,其中高质量序列5063个,达97.5%。利用PHRAP程序聚类拼接后,得到1625条非冗余序列,包括443个重叠群(Contigs),1182个单拷贝(Singlets)。使用BLAST软件将这些序列同GenBank等数据库进行比对、注释,发现1625个非冗余序列与鳜肌肉结构和发生相关,而其中991条序列与NCBI数据库中的其它物种已知序列存在显著的相似性,剩余的634条非冗余序列(占所有非冗余序列的39%)为在鳜中新发现的未找到同源序列的序列。740个基因为能够注释到Gene ontology(Go)中的序列数目。     

链状亚历山大藻抑制消减杂交文库的构建及分析

为了筛选链状亚历山大藻特异表达的发光相关基因,应用抑制消减杂交技术,构建了链状亚历山大藻特异表达的cDNA消减文库,共获得500个克隆,通过基因PCR初步筛选表明插入片段的大小主要集中在250～1000 bp,随机挑选10个阳性克隆进行双向测序和序列比对分析,有2个克隆基因片段与已知基因序列高度同源,分别为荧光素结合蛋白和羧化酶/加氧酶,另有8个克隆基因片段在GenBank中未查找到相应的同源基因,可能为未知新基因序列.这些基因的获得为进一步研究链状亚历山大藻特异表达基因,阐明其发光机理及建立特异甲藻的新型检测方法提供重要依据.     

坛紫菜6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)家族基因的克隆及表达特征分析

6-磷酸海藻糖合成酶(TPS)是植物海藻糖合成的关键酶,在植物逆境胁迫应答中发挥着重要的作用.实验以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE技术克隆获得坛紫菜的3条TPS基因序列:PhTPS1,PhTPS2-1和PhTPS2-2.序列分析结果表明,PhTPS1(收录号:KM580358)序列全长3 557 bp,包含一个3 462 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 153个氨基酸,分子量为124.2 ku,等电点为6.73,属于TPS Ⅰ亚家族;PhTPS2-1(收录号:KM519457)序列全长4 264 bp,包含一个4 044 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 374个氨基酸,分子量为145.2 ku,等电点为5.96;PhTPS2-2(收录号:KM519458)序列全长3 733 bp,包含一个3 324 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含1 107个氨基酸,分子量为120.2 ku,等电点为5.42.PhTPS2-1和PhTPS2-2属于TPSⅡ亚家族.基因表达水平的定量分析结果表明高温胁迫条件下,3条PhTPS基因的表达模式基本一致,均表现为先上调后下调,再上调的趋势;而PhTPS1和PhTPS2-1基因在中低水平的失水条件下,基因表达水平均没有发生显著变化,只在高水平失水胁迫下显著上调,PhTPS2-2基因在中高水平失水条件下,表达水平显著上调.说明PhTPS基因可能只在高度失水胁迫下发挥应激调节作用.     

青石斑鱼细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（COXⅠ）基因的克隆鉴定及表达分析

细胞色素氧化酶(Cytoehrome oxidase,COX)是线粒体内呼吸链电子传递的终末复合物,是线粒体氧化能力的关键调节物质.细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COX Ⅰ)是细胞色素C氧化酶具有酶催化活性的3个亚基之一.本研究以本实验室构建的青石斑鱼消减杂交cDNA文库中长587 bp的EST序列为基础,采用RACE-PCR方法克隆鉴定出青石斑鱼(点:pinephelusawoara)细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因.研究结果表明:青石斑鱼COXⅠ全长1 659 bp,5'端非编码区3 bp,3'端非编码区105bp,开放阅读框1 551 bp,编码516个氨基酸.序列分析表明,青石斑鱼COXⅠ与线纹刺尾鲷COXⅠ同源性最高,达96.9%.采用半定量RT-PCR方法研究COXⅠ基因在青石斑鱼各组织中的表达特征,结果表明COXⅠ基因在正常的青石斑鱼和注射了副溶血弧菌灭活疫苗的青石斑鱼的脾、肝、心、头肾、肾、肌肉和鳃中都有转录表达.注射副溶血弧菌灭活疫苗后,除了鳃组织,其他组织中COXⅠ基因表达量较对照组都有显著提高(P＜0.05),而鳃组织中的COXⅠ基因表达量没有显著变化.     

海带雄性配子体差异表达基因片段的克隆及筛选

利用抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization，SSH）获得了海带雌、雄配子体差异表达的cDNA片段，将雄配子体差异表达的cDNA片段克隆于pGEM-T载体并转化大肠杆菌（Escherichia coli）JM109，构建雄配子体差异表达的cDNA消减文库。自750个阳性克隆中随机挑选100个进行PCR扩增鉴定，电泳图谱表明插入片段大小在200～1000bp之间。进一步经过Southern斑点杂交筛选后，选取10个阳性克隆进行测序和序列分析，有7个片段与GenBank数据库中已知基因序列无明显同源性，初步判断为新的基因序列，3个片段与已知脚基因和Lhcf6基因的同源性分别达到88％和98％。     

红笛鲷头肾消减cDNA文库的构建与分析

应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾消减cDNA文库,筛选红笛鲷免疫相关基因的EST.以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活疫苗体内诱导红笛鲷为实验组,以注射无菌生理盐水的红笛鲷为驱动组,通过SSH技术构建红笛鲷头肾消减.DNA文库.利用PCR技术和斑点杂交对文库进行筛选,从2 424个含插人片段的阳性克隆中筛选了680个克隆在上海生工进行了序列测定.使用BLASTx和BLASTn工具对获得的ESTs与GenBank数据库进行同源性比较并根据相似性序列的名称通过GO法对ESTs进行注释.结果获得了30个与红笛鲷免免疫防御相关基因的EST,如组织相容性抗原复合物基因(MHC I和MHCII),免疫球蛋白基因(IgH和IgL)、热休克蛋白基因(HSP10,HSP70和HSP90)等.本研究构建了哈氏弧菌灭活疫苗免疫后与正常组织差异表达的消减cDNA文库,并获得一批与红笛鲷免疫防御相关的ESTs,旨在为探讨红笛鲷分子免疫防御机制、筛选参与免疫防御调控相关的功能基因,揭示红笛鲷免疫抗病机制、提高机体抗病力、实现遗传改良奠定基础.     

坛紫菜两种Hsp90基因的克隆及表达特征分析

以坛紫菜转录组测序获得的unigene序列为基础,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术克隆获得了坛紫菜的两条Hsp90基因序列:PhHsp90-1和PhHsp90-2。序列分析结果表明,PhHsp90-1序列全长2 572 bp,包含一个2 427 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含809个氨基酸,分子量为90.2 ku,等电点为4.79,属于Hsp90内质网亚家族(登录号:KF732651);PhHsp90-2序列全长2 510 bp,包含一个2 280 bp的开放阅读框,所编码的多肽包含760个氨基酸,分子量为86.2 ku,等电点为4.81,属于Hsp90细胞质亚家族(登录号:KF732652)。基因表达水平的定量分析结果表明,高温和失水胁迫对两条PhHsp90基因的表达水平均有显著影响,但在表达模式上存在明显差异。高温胁迫不同时间水平下,两条PhHsp90基因的表达均表现为先上调后下调的趋势;而在失水胁迫下,当失水率小于60%时,两条基因的表达水平均没有发生显著变化,但当失水率大于60%时,两条基因的表达水平均显著上调,说明两条PhHsp90基因均在应答高温胁迫和高度失水胁迫中发挥着重要作用。     

盐碱胁迫下青海湖裸鲤鳃基因表达差异

采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,研究了青海湖裸鲤(Gymnocyprisprzewalskii)在高盐碱胁迫下转录水平上的基因表达差异,实验获得差异表达序列91条,其中成功注释60条。以同是鲤科鱼类的斑马鱼(Danio rerio)的基因ID作为参照,用DAVID软件对这些序列进行功能分类,结果从正向文库获得28条功能基因片段,反向文库获得14条。按功能将其分为10类,其中,催化活性、细胞、部分结合相关基因表达上调,结合、免疫相关基因表达下调。分析发现,高盐碱胁迫会改变鱼类的渗透压和酸碱平衡,对免疫系统产生一定的抑制作用,对此,鱼类通过增强离子调控、提高血清尿素氮浓度、合成应激蛋白等,来维持渗透压和酸碱平衡,缓解应激反应。     

干出胁迫对孔石莼生长及生理影响

通过人工模拟干出条件研究孔石莼(Ulva pertusa)在不同干出条件下的生理生化反应。以采自大连潮间带的孔石莼为材料,测定在不同的干出时间(0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h)下其叶绿素a(Chla)含量、可溶性糖含量、脯氨酸(proline,Pro)含量、丙二醛(MDA)含量和过氧化物酶(POD)活性的变化。结果表明:干出胁迫会对孔石莼的生理生化过程产生明显的影响。随着干出时间的延长,孔石莼中叶绿素a含量呈现下降的趋势;丙二醛和可溶性糖的含量呈现缓慢的升高趋势;过氧化物酶活性和脯氨酸含量呈现明显的升高趋势。这些结果为孔石莼的抗性生理研究提供了补充和参考。     

大黄鱼EST微卫星标记初步筛选

通过构建大黄鱼性腺线性化cDNA文库，并经测序后获得3535条EST，对其二碱基至六碱基重复序列进行筛选，共发现微卫星位点150个，占EST序列的4．24％；其中包括二碱基重复序列64条，三碱基重复序列80条，四碱基重复序列5条，五碱基重复序列1条；三碱基重复序列是最丰富的重复单元，占53．3％。在这些微卫星序列中，（TG／GT／AC／CA）n形式在二碱基重复中最为常见，（GAG／AGG／GGA／CCT）n形式在三碱基重复序列中最为常见，分别占微卫星序列总数的26％和14％。选取其中的62条微卫星序列进行引物设计、合成与多态性检测，经过PCR扩增，2．0％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得呈多态性微卫星引物8对，多态率为12．9％。本研究为开发大黄鱼EST微卫星分子标记和大黄鱼基因编码区微卫星的功能研究提供有价值的信息。     

条斑紫菜细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA克隆和序列分析

利用已知甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的特征性保守区域获得的探针筛选条斑紫菜cDNA文库，获得了1个全长的cDNA克隆GAP2，编码细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPC)。其中GAP2 cDNA插入片段为1596bp，包括一个1008bp的开放阅读框编码336个氨基酸的细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPC)蛋白。将获得的GAPC蛋白的氨基酸序列与其它物种的GAPDH序列进行多重序列比较后，发现条斑紫菜的GAPC氨基酸序列包含了4个高度保守的结构域。条斑紫菜GAPC的cDNA序列中GC含量很高，为64．2％，与紫菜EST分析中得到的结果(65．2％)近似。通过GAPDH的分子发育进化分析，对红藻的分类地位进行了初步探讨，条斑紫菜的细胞质甘油醛-3-磷酸脱氢酶的cDNA序列已登记到GenBank数据库，序列号分别为：AY273820。     

三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性消减杂交技术构建了三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库。经检验，差异表达基因均被富集了 2¹⁰倍左右，证明构建的 cDNA 消减文库具有很强的消减效率。PCR 鉴定发现，在随机挑取的阳性克隆中，95% 的克隆均含有 0.2～1.0 kb 的插入片段，这些片段可能是三角帆蚌瘟病病毒感染后差异表达基因的cDNA片段。测序共获得 214 个有效 cDNA 序列，分别属于8 大类，共 98 个基因。其中细胞分裂基因 2个、细胞结构与运动基因 9 个、代谢基因 10 个、信号传导基因 7 个、细胞防疫基因 10 个、基因与蛋白表达基因 20 个、未知功能蛋白基因 26 个，GenBank中找不到任何同源序列的基因 14 个。结果说明，构建的差异表达cDNA文库，可较好地反映三角帆蚌瘟病病毒对三角帆蚌影响的基因信息。     

抑制差减杂交法克隆牙鲆变态早期差异表达的基因

为了克隆变态早期牙鲆头部差异表达的基因，采用抑制差减杂交法，以变态前的仔鱼头部表达的RNA作为驱动RNA，建立了牙鲆变态早期的差减cDNA文库，并利用相对定量RT-PCR对其进行了筛选。差减库的平均插入片段558bp左右，阳性率为81．8％。随机测定的45个克隆，在剔除假阳性克隆后，共得到22个不同的基因，其中13个为已知cDNA的同源基因，而另外9个为已知蛋白的同源基因，分别为prolactin receptor-like，COL1A1，M3-muscarinic receptor，Sfrs3，tropomyosin，ribosomal protein L27，ribosomal [rpteom S12，GAPDH，COL1A3。在所有22个基因中，COL1A1基因在差减库中的分布频率最高，为22．2％。RT-PCR检测结果表明，在所检测的11个基因中，所有基因在右眼移动前后的牙鲆头部均有表达，只是体现在表达水平上的不同。     

基于16S rRNA和Cyt b基因序列探讨2种梅童鱼的遗传分化

比较分析了棘头梅童鱼（Collichthys lucidus）和黑鳃梅童鱼（C.niveatus）的16SrRNA和Cytb基因片段序列差异及遗传分化程度。在长度为526bp的16SrRNA和379bp的Cytb基因片段的核苷酸序列中，2种间共检测到44处核苷酸替代。分析结果表明，2个基因片段的鸟嘌呤（G）含量较低，在Cytb蛋白质编码基因第三密码子位点上表现尤为明显。基于16SrRNA和Cytb基因片段分析结果显示，2种间平均遗传距离分别为0．012和0．111。构建的系统树显示2种梅童鱼在这2个基因片段上存在显著的遗传分化。根据Cytb基因2％／百万年的进化速率推断，棘头梅童鱼与黑鳃梅童鱼的分化时间约为550万年，发生于上新世（Pliocene）早期。     

基于EST序列的鲤鱼生长相关SNP发掘

以本研究室454测序获得的EST序列和公共数据库中下载的共255，768条鲤鱼EST序列为源序列，鉴定出与生长相关的EST序列5，375条；采用QualitySNP软件，在31个EST重叠群中检测到69个可信度高的与生长相关的SNP，SNP发生频率为0．29／100个碱基。其中包括转换型35个，颠换型30个和缺失型4个。非同义SNP为46个，同义SNP为23个，二者比值为2．0。对所鉴定的SNP进行注释表明，这些包含SNP的生长相关基因归为20类，数量最多的为血纤维蛋白溶酶原基因4个、其次是载脂蛋白基因和磷酸甘油醛脱氢酶基因分别为3个。本研究所开发的SNP将促进鲤鱼生长性状的分子基础研究，为鲤鱼分子育种服务。     

大黄鱼、鮸鱼及美国红鱼线粒体DNA的Cyt b基因序列比较

利用PCR技术对大黄鱼Pseudosciaena crocea、鮸鱼Scioenops ocellatus和美国红鱼Miichthys miiuy线粒体DNA的细胞色素b（Cytb）基因片段进行了扩增，PCR产物直接测序，分别获得大黄鱼和美国红鱼1140bp的序列，鮸鱼1125bp的序列。通过对3种鱼的cnb序列的比对分析，得出3种鱼序列的相似性为91．49％；分析了3种鱼序列的碱基组成及碱基变异情况，发现3种鱼的序列差异明显，碱基替换较多，可以将cytb基因作为种间分子鉴定或更高分类界元遗传分析的分子标记；计算了3种鱼序列的遗传距离并构建了系统树，结果显示，鮸鱼与美国红鱼的遗传距离较近。