红笛鲷头肾消减cDNA文库的构建与分析

应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾消减cDNA文库,筛选红笛鲷免疫相关基因的EST.以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活疫苗体内诱导红笛鲷为实验组,以注射无菌生理盐水的红笛鲷为驱动组,通过SSH技术构建红笛鲷头肾消减.DNA文库.利用PCR技术和斑点杂交对文库进行筛选,从2 424个含插人片段的阳性克隆中筛选了680个克隆在上海生工进行了序列测定.使用BLASTx和BLASTn工具对获得的ESTs与GenBank数据库进行同源性比较并根据相似性序列的名称通过GO法对ESTs进行注释.结果获得了30个与红笛鲷免免疫防御相关基因的EST,如组织相容性抗原复合物基因(MHC I和MHCII),免疫球蛋白基因(IgH和IgL)、热休克蛋白基因(HSP10,HSP70和HSP90)等.本研究构建了哈氏弧菌灭活疫苗免疫后与正常组织差异表达的消减cDNA文库,并获得一批与红笛鲷免疫防御相关的ESTs,旨在为探讨红笛鲷分子免疫防御机制、筛选参与免疫防御调控相关的功能基因,揭示红笛鲷免疫抗病机制、提高机体抗病力、实现遗传改良奠定基础.     

哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因克隆、表达及DNA疫苗的免疫效果

参照GeneBank上登录的哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因序列,设计引物扩增OmpW的开放阅读框,序列分析结果显示该基因全长645 bp,编码214个氨基酸。将其定向克隆到原核表达载体pET-32a( ),在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白,融合蛋白分子量约为43.8 ku,且主要以包涵体形式存在。优化的表达条件为温度37 ℃,IPTG浓度0.1 mmol/L,诱导时间5 h。将纯化的融合蛋白免疫SPF昆明小鼠制备多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价达1:30,000,Western-blot结果表明鼠抗OmpW血清能与诱导后的重组蛋白发生特异反应,提示OmpW可能是哈维氏弧菌的一种重要保护性抗原。为了进一步研究哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护效果,构建了真核表达重组质粒pCDNA-OmpW,然后将真核质粒免疫接种红笛鲷。PCR结果显示,免疫接种第7、28 d,在红笛鲷的肌肉、头肾、肝脏和脾脏组织均存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种第7、28 d,红笛鲷不同组织均有目的基因的表达。ELISA结果表明,红笛鲷体内血清产生了抗OmpW蛋白的高效价抗体。Western- blot分析表明,DNA疫苗免疫后红笛鲷体内表达了相应的目的蛋白,并诱导产生了相应抗体。攻毒试验结果表明,免疫保护率高达60 %,可见pCDNA-OmpW可作为红笛鲷预防哈氏弧菌感染的有效候选疫苗之一。     

红笛鲷MAPKK5基因的克隆及生物信息学分析

利用本实验室构建红笛鲷头肾cDNA文库中的MAPKK5基因EST序列,通过RACE PCR技术克隆红笛鲷MAPKK5基因cDNA全长(Ls-MAPKK5,登录号为KM657202)。序列分析结果显示,Ls-MAPKK5cDNA全长2632bp,其中开放阅读框1317bp,可编码438个氨基酸,预测其编码蛋白的分子量为49.29ku,理论等电点为6.12。SignalP 4.0、TMHMM Server 2.0和SoftBerry-Psite预测结果显示,Ls-MAPKK5没有信号肽和跨膜结构,含有22个磷酸化位点。氨基酸序列分析显示LsMAPKK5具有保守的PB1与S_TKc结构域。利用MEGA5.0软件,根据邻位相连法构建MAPKK5系统进化树,结果显示Ls-MAPKK5与雀鲷、吉富罗非鱼该蛋白有较近的亲缘关系。     

建鲤MHC class Ⅰ基因全长cDNA的克隆与序列分析

采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法克隆了建鲤(Cyprinus carpio var.jian)MHC class Ⅰ基因全长cD-NA并进行了序列分析.结果显示:实验得到了1914 bp的建鲤的MHC class Ⅰ全长cDNA序列;建鲤MHC class Ⅰ基因包括1044 bp的开放阅读框(ORF),11...     

草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ的融合表达、纯化和抗血清制备

采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)cDNA,使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX-4T-1载体中,构建草鱼IGF-Ⅰ融合蛋白表达质粒pGEX-IGF.质粒转化大肠杆菌BL21菌株.该菌株经IPTG诱导可表达分子量约34kD的特异蛋白.在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白.经30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后,裂解液上清经glutathionesepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST-IGF.以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF-Ⅰ的抗血清.凝胶双扩散试验显示抗血清效价为1:64,说明表达产物具免疫原性.     

圆斑星鲽MHCⅠα基因的克隆与组织表达分析

采用表达序列标签法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,成功获得了圆斑星鲽主要组织相容性复合体MHC Ⅰα的全长cDNA序列.该cDNA全长2171 bp,5'UTR为20 bp,3'UTR为1053bp,开放阅读框(ORF)长度为1098 bp,可编码365个氨基酸,包含信号肽、抗原结合域(α1、α2),IGC类似...     

溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护研究

为研究溶藻弧菌鞭毛蛋白flaC基因DNA疫苗对红笛鲷的免疫保护作用,实验构建了重组真核表达质粒pcDNA-flaC并将该质粒肌肉注射红笛鲷,采用PCR、RT-PCR、ELISA和攻毒试验等方法检测了该真核表达质粒在红笛鲷组织内的分布、表达和对红笛鲷的免疫保护.PCR结果显示,免疫接种7和28 d,注射点周围肌肉、鳃、肾脏、肝脏和脾脏都存在质粒分布;RT-PCR结果显示,免疫接种后第7天、14天和28天,红笛鲷不同组织内均有目的基因表达.ELISA结果表明,鱼血清内产生了抗FlaC蛋白的抗体,表明DNA疫苗免疫后鱼体表达了目的蛋白,并诱导产生了相应抗体.攻毒实验表明,免疫后的红笛鲷能较好地抵抗致病性溶藻弧菌的感染.结果表明,质粒pcDNA-flaC可能是抵抗溶藻弧菌感染的有效的疫苗候选物.     

半滑舌鳎ＨＩＦ １α基因的原核表达与多克隆抗体的制备

根据半滑舌鳎HIF-1αcDNA序列设计特异性引物,从半滑舌鳎肝脏中扩增HIF-1d用于表达片段,连接至载体pMD18-T,分别以KpnⅠ和XholⅠ对含有目的基因的质粒和pET-30a进行酶切,连接并转化大肠杆菌BL21中,构建了半滑舌鳎HIF-1α原核蛋白表达载体.以IPTG进行诱导表达.表达产物通过Ni-NTA亲和层析进行纯化,免疫接种日本大耳白兔,制备了兔抗HIF-1α多克隆抗体.Western blot检测显示该多克隆抗体具有较好的特异性,能够与HIF-1α表达宿主菌蛋白特异性结合.     

半滑舌鳎生长激素及其受体基因的原核表达

根据已克隆的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)生长激素(GH)基因和生长激素受体Ⅰ(GHR-Ⅰ)基因的cDNA序列信息设计引物,用于扩增半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因序列。随后,分别利用表达载体pET-32a和pGEX-6P-1成功构建了包含半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ基因ORF全序列及不同ORF片段的6个重组质粒,并将获得的重组质粒在表达宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示:重组GH的pET-32a-CSGH质粒在40 kD处有特异性的蛋白条带,重组GHR-Ⅰ胞内区的pGEX-6P-1-CSGHR1-2质粒在70 kD处发现诱导的蛋白条带,其表达量分别占细胞蛋白总量的37.6%和20.2%;而构建的pGEX-6P-1-CSGH重组质粒和含有GHR-Ⅰ基因跨膜区的重组质粒(pET-32a-CSGHR1-1、pET-32a-CSGHR1-2和pGEX-6P-1-CSGHR1-1)均未获得表达产物。由此可见,半滑舌鳎GHR-Ⅰ基因的跨膜区可能影响其在大肠杆菌中的表达。研究结果为实现半滑舌鳎GH、GHR-Ⅰ制剂的开发及应用于养殖生产实践奠定基础。     

高盐胁迫下大弹涂鱼MHC Iα基因对病毒拟似物poly(I:C)的免疫反应

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)是一类编码细胞表面糖蛋白的基因,在所有硬骨鱼的适应性免疫系统中起着至关重要的作用,而关于 MHC 基因的研究一直是鱼类分子免疫学和鱼类抗病辅助育种的研究热点之一。本研究首次分析了大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris) MHC Iα基因的 cDNA 序列特征,构建了系统发生树,评估了大弹涂鱼 MHC Iα基因 mRNA在健康个体不同组织中的表达差异,研究了注射病毒拟似物 poly(I:C)后 MHC Iα基因在机体主要免疫器官肝和脾的表达情况。结果显示,大弹涂鱼 MHC Iα基因具有由1101 个碱基组成的开放阅读框(ORF),共编码 366 个氨基酸残基,具有 3 个蛋白激酶 C-磷酸化位点、1 个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和 1 个 N-糖基化位点。系统发育分析显示与大弹涂鱼 MHC Iα基因亲缘关系最密切的是河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)。RT-PCR 分析显示, MHC Iα基因 mRNA 在不同组织中均有表达,其中肾和脾组织中表达量最高,鳃和肠组织中表达次之。大弹涂鱼在腹腔注射 poly(I:C)后,肝和脾组织中 mRNA 表达量明显上升,在12 h 时, MHC Iα基因 mRNA 表达量在肝和脾中均达到峰值。本研究结果表明, MHC Iα基因参与了大弹涂鱼在高盐胁迫下的免疫应答。     

黄鳝醛酮还原酶基因的重组表达及多抗制备

为实现原核表达黄鳝醛酮还原酶基因并制备其多克隆抗体,笔者利用基因特异性引物自黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝醛酮还原酶全长序列,将之克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建了重组表达载体;经测序验证后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和柱纯化了重组蛋白,通过多次免疫新西兰兔制备了多克隆抗体;采用Western blot和免疫组化法鉴定兔抗醛酮还原酶多克隆抗体的特异性,用间接ELISA技术检测多抗的效价。结果发现成功构建pET/Eakr原核表达载体,并实现了重组蛋白的融合表达和纯化;Western blot检测表明制备的兔多克隆抗体不仅能特异性地识别来源于黄鳝4种组织的醛酮还原酶蛋白而且还可识别来源于黄颡鱼、团头鲂、乌鳢、鲫鱼和草鱼的同源蛋白。免疫组化结果提示该多抗可特异性识别黄鳝小肠、肝胰组织和脾脏的醛酮还原酶蛋白。制备的多抗效价达1∶6400。     

鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析

从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白对ISKNV的攻击具有保护作用,攻毒后15 d,093免疫组平均相对保护率为45.3%。结果说明重组093蛋白具有一定的免疫原性,可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。本研究通过中和实验及免疫保护实验对重组093蛋白的免疫原性进行分析,旨在为鳜ISKNV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。     

草鱼胰岛素样生长因子-I的融合表达、纯化和抗血清制备

采用PCR方法改造已克隆到的草鱼胰岛素样生长因子 Ⅰ (IGF Ⅰ )cDNA ,使其成为成熟肽cDNA并亚克隆到pGEX 4T 1载体中 ,构建草鱼IGF I融合蛋白表达质粒pGEX IGF。质粒转化大肠杆菌BL2 1菌株。该菌株经IPTG诱导可表达分子量约 34kD的特异蛋白。在不同的温度条件下分别产生以可溶性的和包涵体形式为主的特异蛋白。经 30℃诱导的菌体经溶菌酶消化、超声破碎及高速离心后 ,裂解液上清经glutathionesepharose亲和层析纯化获得高纯度的GST IGF。以此纯化的融合蛋白为抗原制备兔抗草鱼IGF I的抗血清。凝胶双扩散试验显示抗血清效价为 1∶6 4 ,说明表达产物具免疫原性     

军曹鱼MHC-Ⅰα基因全长cDNA的克隆及其组织表达分析

采用同源克隆和末端快速扩增（RACE）方法，得到1330bp的军曹鱼（Rachycentroncanadum）MHC-Ⅰα全长cDNA片段。该序列包括76bp的5’末端非编码区（UTR），189bp的3’UTR及1065bp的开放阅读框（ORF），编码354个氨基酸，预测其蛋白质分子量约40．10kDa，等电点5．70。构建MHC-Ⅰα氨基酸序列的系统进化树并进行氨基酸相似性比对，结果表明，军曹鱼和已知鱼类及人类（Homosapiens）MHC-Ⅰα氨基酸的同源性在27．9％～67．1％之间。所推测的蛋白序列具有一些重要特征，包括前导肽、α1、α2、α3区、CP／TM／CYT区和保守的半胱氨酸等。Real—timePCR检测结果显示，MHC-Ⅰα基因在各个正常军曹鱼组织中均表达，但表达量各有不同，其中较强的表达于头肾；中等程度表达于鳃、脾和肠；在心、脑和肌肉中表达较弱。     

败血症鲢肝与肾cDNA文库构建及MHC classⅠ的克隆与分析

采用CloneMinerTM cDNA文库构建试剂盒构建了患败血症的鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肝和肾的cDNA文库.经检验,文库的滴度为1.34×107 cfu/mL,总库容为2.68×107 cfu,阳性克隆率为97.5％,平均插入片段大于1.2 kb.对80个随机挑选的克隆进行两端测序,结果显示有74个测序成功.经在GenBank上BLAST比对,其中57个为已知功能基因,属于45个不同基因,另外17个没有明显的同源序列.在已知功能的57个克隆中,含有全长编码区序列的克隆共有49个,全长cDNA比率为61.25％.采用PCR法对文库进行筛选,获得一个含MHC classⅠ完整编码区的序列,该序列具有典型的脊椎动物MHC class Ⅰ的序列特征.本研究完成鲢肝和肾较高质量的cDNA文库的构建,旨在为今后开展鲢功能基因研究奠定基础.     

剑尾鱼卵黄蛋白原基因片段克隆、表达及蛋白检测方法的建立

本研究通过对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)卵黄蛋白原基因片段的克隆和表达,建立了剑尾鱼卵黄蛋白原蛋白检测方法.根据已发表的底鳉(Fundulus heteroclitus)卵黄蛋白原mRNA序列设计引物,利用RT-PCR法扩增出1段1 118 bp的剑尾鱼卵黄蛋白原cDNA片段,序列分析表明该片段与其他鱼类卵黄蛋白原基因序列相似性较高,其中与底鳉和食蚊鱼(Gambusia affinis)的同源性分别达87.4%和96.7%.在对该片段所编码氨基酸序列可能抗原位点分析的基础上,进行PCR改造构建原核表达载体,预期得到258个氨基酸的表达蛋白.表达载体转入大肠杆菌DH5α,经热诱导后,SDS-PAGE分析有29 kD的表达蛋白产生,与预期相符.以重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得抗血清.雌激素(β-雌二醇)对剑尾鱼诱导后,用重组蛋白抗血清作一抗,进行Westernblot分析.结果表明,该抗血清能与剑尾鱼卵黄蛋白原特异结合,可应用于剑尾鱼卵黄蛋白原的检测.卵黄蛋白原是环境雌激素研究中较为特异、灵敏的生物标志物,剑尾鱼卵黄蛋白原检测方法的建立,为剑尾鱼环境监测应用提供良好基础.     

刺激隐核虫α-微管蛋白基因的克隆、原核表达及在生活史不同阶段的mRNA表达

从本实验室已有刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)转录组数据中筛选获得α-微管蛋白基因片段,利用5'RACE和3'RACE技术首次克隆获得其cDNA,全长为1602 bp,包含1356 bp的开放阅读框,编码451个氨基酸,预测蛋白质分子量为49.78 kD。生物信息学分析表明α-微管蛋白为亲水性非跨膜蛋白,氨基酸序列的第142～148位有特异且保守的GTP核苷酸结合位点(GGGTGSG)。对刺激隐核虫α-微管蛋白氨基酸序列进行同源性比对及进化树分析,发现其与间日疟原虫(Trypanosoma vivax)、丹氏锥虫(Trypanosoma danilewskyi)、八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)、尾刺耐格里原虫(Naegleria gruberi)、眼虫(Euglena gracilis)等的序列一致性高达94%～95%,且在系统进化树上聚为一支。采用实时荧光定量PCR技术对α-微管蛋白基因在刺激隐核虫3个生活史阶段的表达进行检测,结果显示α-微管蛋白基因的表达量在纤毛虫时期显著高于包囊和滋养体时期(P0.05)。我们进一步构建了α-微管蛋白重组表达载体,并转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行原核表达,SDS-PAGE分析表明,诱导表达的重组蛋白分子量约为50 kD,与预测的结果一致,即成功诱导表达α-微管蛋白。本实验结果为后续制备α-微管蛋白有效亚单位疫苗防治刺激隐核虫病奠定了基础。     

黄鳝血清转铁蛋白多克隆抗体的制备及检测

为实现黄鳝血清转铁蛋白基因的原核表达并制备其多克隆抗体,利用基因特异性引物从黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝转铁蛋白的C端序列,亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建pET/Tf-C重组表达载体;转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和层析技术纯化Tf-C蛋白,并免疫新西兰兔制备多克隆抗体;通过间接ELISA技术和组织蛋白印迹对制备的多克隆抗体进行检测。试验结果表明,成功构建pET/Tf-C原核表达载体,并实现了蛋白的表达和纯化;制备的多克隆抗体效价大于1∶25 600,并能特异性地识别来源于黄鳝不同组织的血清转铁蛋白。研究结果对黄鳝血清转铁蛋白功能的研究奠定了基础。     

中华鳖MHCⅡα基因cDNA的克隆及组织表达分析

为了探究中华鳖(Pelodiscus sinensis)的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)的结构和功能,本研究利用RACE技术成功克隆获得中华鳖MHCⅡα基因的cDNA全长序列,其长度为1296 bp,开放阅读框(ORF)为807 bp,共编码268个氨基酸,分为信号肽序列、Ⅱ类组织相容性抗原α结构域、IGc1结构域及跨膜结构域4个功能结构域。通过NJ法构建的系统进化树分析显示,中华鳖与西部锦龟(Chrysemys picta bellii)亲缘较近,而与哺乳类、鸟类及鱼类亲缘关系较远。荧光定量PCR结果显示,MHCⅡα mRNA在中华鳖8个组织中均有表达,在脾、心、肝及肠组织中表达水平较高,在肌肉组织中表达量最低。感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) 12 h后,中华鳖MHCⅡα mRNA在肝和肠组织中的表达显著上调;感染1 d时,在脾组织中的表达显著上调;感染1 d及5 d时,在肾组织中的表达显著上调。研究表明,中华鳖MHCⅡα基因参与了中华鳖免疫反应。     

草鱼Mx蛋白基因的克隆与原核表达

根据已报道的Mx蛋白cDNA序列设计合成特异引物，应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，从草鱼呼肠孤病毒(GCRV)诱导的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肝脏总RNA中扩增获得Mx蛋白cDNA，回收纯化后克隆到pGEM-T Easy Vector系统的T载体上。重组子的序列分析表明：所克隆的Mx蛋白cDNA长722bp，编码240个氨基酸，包括1个三联GTP结合区域和1个发动蛋白(dynamin)族特征的序列。与已知鱼类Mx蛋白基因序列比较表明，草鱼Mx蛋白基因序列与其它鱼类Mx基因相应序列具有较高的同源性，其中与斑马鱼Mx蛋白E型基因碱基序列比较同源性最高，为87．1％。将此基因改造后定向克隆至原核表达质粒pBV220，构建成重组草鱼Mx蛋白基因表达质粒pBVgcMx，并在大肠杆菌中获得高效表达，重组草鱼Mx蛋白的表达量占菌体总蛋白的26．6％。Q-sephrose FF层析柱分离纯化的重组草鱼Mx蛋白纯度达95．6％。