抗弧菌海洋细菌BN-1菌株几种胞外酶活性的测定

采用平板透明圈法初步测定海洋细菌BN-1菌株产淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶活性。试验结果表明,BN-1菌在淀粉酶和蛋白酶鉴别培养基上能形成明显清晰的透明圈,具有较强的产蛋白酶、淀粉酶能力;在脂肪、纤维素鉴别培养基上形成的透明圈直径较小。比色法测定结果表明,BN-1菌株产淀粉酶和蛋白酶能力较强,培养16h蛋白酶活性高达1076.14U/mL,培养18h淀粉酶活性可达1053.49U/mL。培养16h纤维素酶活性高达127.03U/mL,20h脂肪酶活性可达474.83U/mL。     

一株海洋中性蛋白酶高产菌S-3685的鉴定及产酶条件

通过生理生化、分子生物学、单因子优化等方法研究了来自南海海域一株产中性蛋白酶菌株S-3685,并对其在250 ml摇瓶中的培养条件进行了优化。结果显示,该菌株初步确定为芽孢杆菌属(Bacillus),发酵培养的最佳碳、氮源分别为葡萄糖10 g/L和豆面10 g/L,牛肉膏5 g/L,酵母膏5 g/L。无机盐MgSO4·7H2O、Na2CO3、KH2PO4最佳浓度分别为0.2 g/L、2.0 g/L、1.0 g/L;菌株在培养基起始pH=7.0、4%接种量、15 ml/250 ml (v/v)装液量和30℃的条件下,发酵72 h获得较高的酶产量。在最佳培养条件下产酶量为4250 U/ml,是优化前的5倍。     

具抑菌活性海洋微生物的筛选

从采集于上海郊区海域的海水和海泥样品中分离出 193株海洋细菌，从中筛选抑菌活性菌株。 分别利用琼脂块法和管碟法对分离出的菌株进行初筛和复筛，结果显示，有 29株海洋细菌具有抑菌活性， 占总分离菌株的 15%，其中抑菌能力较强的 G4，抑菌谱较广，能同时抑制革兰氏阳性和阴性指示菌。     

产胞外多糖的近海海洋细菌的筛选

海洋微生物是海洋生物的重要组成部分，海洋微生物可产生大量不同于陆生生物的活性物质，是重要的海洋药物资源。实验所用泥样采集于黄海近海海岸，对其进行海洋细菌的分离与纯化，获得了25株纯化的海洋细菌。采用苯酚-硫酸法和乙醇沉淀法检测这些菌株的发酵液中是否含有胞外多糖，进一步筛选出胞外多糖的高产菌株。实验结果表明，胞外多糖产量高于0．22g／L的菌株共7株，占总测定菌株数的28％，胞外多糖产量高于0．20g／L的菌株共13株，占总测定菌株数的52％。有48％的菌株胞外多糖产量介于0．19g／L和0．20g／L之间。其中以MBN003中多糖含量为最高，产量达到0．2305g／L。此研究结果表明MBN003菌株具有较高的产胞外多糖能力，可以选用MBN003作为胞外多糖提取物研究的来源。     

2株海水鱼源潜在益生菌的分离、鉴定及特性分析

为筛选用于微生态制剂研发的海水鱼源益生菌，本研究对海捕野生许氏平鲉(Sebastes schlegelii)和大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)的消化道内壁黏膜样品进行细菌分离纯化，获得80株可培养细菌。使用选择性培养基对菌株的产酶能力进行测定，选取海水鱼常见病原菌为指示菌测定分离菌株产物的抑菌活性，筛选出2株潜在益生菌TS2和TH8，并进行菌株的生理生化检测、16S rDNA序列分析、生长特性及其对宿主安全性的研究。结果显示，TS2产蛋白酶(protease)、淀粉酶(amylase)和脂肪酶(lipase)，其无菌培养产物可显著抑制鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harvey)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)的生长。TH8产蛋白酶和脂肪酶，其无菌培养产物可显著抑制鳗弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌、假交替单胞菌、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)的生长。基于细菌生理生化检测和16S rDNA序列比对，鉴定TS2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，TH8为河流漫游球菌(Vagococcus fluvialis)。TS2在温度为15~40 ℃、NaCl浓度为0~0.08 g/L、pH为5~9时生长较快，6 h进入对数期，26 h后进入稳定期；TH8在温度为20~40 ℃、NaCl浓度为0~0.08 g/L、pH为5~12时生长较快，2 h进入对数期，14 h后进入稳定期。菌株对同源宿主的安全性检测发现，TS2和TH8在108 CFU/mL浓度条件下对同源宿主是相对安全的。筛选的枯草芽孢杆菌TS2、河流漫游球菌TH8产酶能力强，其产物能抑制多种病原菌的生长，具有广温、广盐、耐酸碱、生长速度快等优点，可作为候选菌株开发为微生态制剂，研究结果为其在海水鱼养殖业中的应用提供数据支撑。     

重组抗菌肽的制备及其对水产养殖中常见病原菌的抑菌效果

采用YEPD培养基诱导发酵生产重组抗菌肽。经 72h培养 ,由重组酵母表达并分泌到培养基中的抗菌肽活性可高达 5 0 0 0U/ml。用纸片扩散法和试管稀释法测定重组抗菌肽对水产养殖常见病原菌的抑菌效果。结果表明 ,抗菌肽对水产养殖常见病原菌嗜水气单胞菌 (Aeromonashydrophila)、梅氏弧菌 (Vibriometschnikovi)、迟钝爱德华氏菌 (Edwardsiellatarda)及温和气单胞菌 (A .sobria)有较好的抑菌效果 ,最小抑菌质量浓度为 4 μg/ml、杀菌质量浓度为 8μg/ml。对抗菌肽抑菌过程的超微结构观察表明 ,抗菌肽的抑菌方式是通过作用于细菌的细胞膜而导致菌体裂解死亡。本研究目的在于探讨基因工程抗菌肽在水产养殖中的应用。     

菲律宾蛤仔酶解产物的抑菌活性

以菲律宾蛤仔为原料,比较其胃蛋白酶、酸性蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解产物的抑菌活性;利用正交实验优化抑菌活性最强的酶解产物的制备工艺,并测定最优酶解条件下酶解产物的相对分子质量分布。结果表明,菲律宾蛤仔胃蛋白酶酶解产物的抑菌活性最强,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和副溶血弧菌均有一定的抑菌活性,其中对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌活性较高,对四联微球菌则未见明显的抑菌活性。胃蛋白酶的最优酶解工艺条件为：酶解时间2h,温度35℃,pH 2.0,加酶量3 000U/g,料水比1∶4;该条件下酶解产物的相对分子质量主要分布在5000以下。     

产虾青素海洋酵母菌YS-185的鉴定及发酵条件优化

以26S rDNA法将实验室保藏的1株产虾青素的海洋酵母菌YS-185鉴定为粘红酵母。以海洋酵母菌YS-185为试验菌株,运用摇瓶发酵优化的方式,探索培养基组分和发酵工艺条件对该菌发酵的影响。实验结果表明,该菌生长最适培养基组分为葡萄糖8 g/L、蛋白胨8 g/L,最适生长起始pH值为5.5、转速220 r/min、接种量8%、温度20℃;虾青素合成的最佳培养基组分葡萄糖8 g/L、蛋白胨8 g/L,最佳虾青素合成条件:pH 5.5,转速220 r/min,接种量8%,培养温度25℃。发酵优化后的虾青素产量2.670μg/ml,较优化前的1.572μg/ml提高了69.8%。温度对酵母菌的生长和虾青素的合成都有显著影响。海洋酵母菌YS-185优化后的发酵条件有规模化生产虾青素的应用潜力。     

一株水产用益生枯草芽孢杆菌液体发酵初步研究

为解决工业化生产中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)活菌数量低、成本高的问题,通过正交试验、单因素试验和100 L发酵罐中试,确定了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HJ02工业生产用的优化液体培养基和发酵工艺条件。最佳培养基配方为:葡萄糖10 g/L、玉米粉8 g/L、豆粕粉25 g/L、硫酸锰30.8 mg/L、硫酸镁5 g/L、磷酸二氢钠0.52 g/L、磷酸氢二钠2.33 g/L;最优发酵工艺条件为:培养温度30℃,初始pH 7.0;最佳接种菌龄是18 h。优化后培养基成本降低了50%以上,细菌浓度达到了7.19×109个/mL。     

海洋细菌S-12-86的产溶菌酶条件

从中国东海海域底泥中筛选获得一株产溶菌酶的海洋细菌S-12-86,采用摇瓶发酵的方式,分别从培养基组分与发酵条件两个方面对海洋细菌S-12-86产酶的影响进行研究。结果表明,菌株S-12-86能够利用麦芽糖、淀粉、甘油和葡萄糖作为碳源,不能利用蔗糖与甘露醇;能够利用牛肉膏、酵母膏、蛋白胨和硫酸铵作为氮源,其中牛肉膏效果最佳,而硝酸钾、氯化铵和尿素几乎不能被利用;Zn2 、Mn2 、Cu2 对菌株S-12-86的生长和产酶均有抑制作用;Fe2 对菌体生长无明显影响,但明显抑制菌体产酶;Na 、K 对菌体的生长和产酶无明显影响;Ca2 对菌体生长有促进作用;Mg2 对菌体生长和产酶均有促进作用。菌株S-12-86最适发酵条件为:培养温度30℃、接种体积比4.0%、装液量体积比10.0%、产酶高峰在发酵开始后24 h。与白色链霉菌G(Streptomyces albusG)、灰色链霉菌P-51(S.griseusP-51)、枯草芽孢杆菌77(Bacillus subtilis77)等产溶菌酶微生物的产酶条件相比较,菌株S-12-86具有易培养、产酶量较高、生产成本较低等优点。因此,菌株S-12-86有较大的生产开发潜力。     

来自鳗鲡的二株益生菌适宜培养基的研究

用正交试验法,通过研究培养基基础成分、主要添加成分和无机盐对养殖鳗鲡(Anguilla japonica)肠道益生菌枯草芽孢杆菌(A40209CDC4)和少动鞘氨醇单胞菌(A31009NA)的生长影响,确定了优化的培养基。菌株A31009NA的优化配方为:蛋白胨1.0%,牛肉膏0.1%,食盐0.5%,酵母膏0.5%,葡萄糖1.0%,硫酸铵0.05%,MgSO4.7H2O 0.1 g/L,CuSO4.5 H2O 0.15 mg/L,MnSO4.H2O 1.5 mg/L,CoCl.H2O 0.15 mg/L;A40209CDC4优化培养基配方为:蛋白胨1.0%,牛肉膏0.1%,食盐1.0%,酵母膏0.5%,硫酸铵0.05%,MgSO4.7 H2O 0.1 g/L,MnSO4.H2O 1.5 mg/L,CoCl.H2O 0.15 mg/L,CaCl20.02 g/L。优化培养基与普通营养肉汤(蛋白胨1.0%,牛肉膏0.3%,食盐0.5%)培养对照试验结果表明,优化培养基有效地提高了细菌产量。     

网箱养殖沉积环境中硫氧化菌的分离鉴定及生长特性

从网箱养殖区沉积物中分离硫氧化细菌,并研究其生长特性。从以硫代硫酸钠为唯一能源底物的培养基中分离得到一株硫氧化菌B1-1,经过平板菌落形态观察及其形态学特征研究,并结合16S rRNA基因序列分析及分子系统发育树的构建结果,确定菌株的种类。结果表明,菌株B1-1呈革兰氏阴性,短杆状,鉴定为Halothiobacillus hydrothermalis(GenBank登录号为KU362926)。在28℃、初始pH=8、150 r/min培养条件下,细菌在12 h进入对数生长期,36 h开始氧化硫代硫酸盐(S_2O_3~(2-)),至60 h培养液p H下降到4.8,S_2O_3~(2-)浓度从最初的2.28 g/L降到0.36 g/L,氧化率达84.2%。     

副溶血性弧菌增菌培养基及培养条件的改进

对副溶血性弧菌增菌培养基及培养条件进行了改进和优化,建立一种更适用于副溶血弧菌增菌的方法。针对能够决定副溶血弧菌综合营养需求的2个最为关键的因素:混合蛋白胨、酵母浸膏以及两者交互作用,进行试验设计,结合统计学软件对结果进行直观分析和方差分析,验证最佳培养基和培养条件。直观分析表明,副溶血弧菌增殖过程中,混合蛋白胨是最主要因素,其次为酵母浸膏。方差分析表明,混合蛋白胨与酵母浸膏对副溶血弧菌生长的影响均显著。最佳培养基配方为:混合蛋白胨2%(胰蛋白胨1%、鱼蛋白胨1%)、酵母浸膏0.2%、NaCl 3.5%、pH8.6;最佳培养条件为:(36±1)℃+摇床120 r/min+2层牛皮纸封口。本优化培养基与培养条件用于副溶血弧菌增菌培养,在相同培养时间内,其增菌菌液浓度为GB/T4789.7-2008方法的(1.8±0.6)倍。     

乳酸菌利用罗非鱼下脚料水解液发酵L-乳酸的探讨

以罗非鱼（Oreochromis spp.）下脚料为原料,采用高温热水抽提法提取其蛋白质作为乳酸菌发酵L-乳酸的氮源。以酵母膏作为对照,探讨了保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophi-lus）和鼠李糖乳杆菌（L.rhamnosus）在罗非鱼下脚料水解液培养基中的生长情况及L-乳酸的产量。结果显示,3种乳酸菌在2种培养基中均能良好地生长,pH下降明显;L-乳酸产量随乳酸菌菌种不同而异,其中鼠李糖乳杆菌在罗非鱼下脚料水解液培养基中发酵10 h后,L-乳酸净产量为3.38 g.L-1,与以酵母膏作为氮源的产酸水平相当。可见罗非鱼下脚料水解液可以替代酵母膏作为L-乳酸发酵的一种低成本氮源。     

Enhancement of innate immune system,survival and yield in Penaeus monodon reared in ponds using Streptococcus phocae PI80

The objective of this study was to evaluate the effect of dietary and water supplementation of probiotic Streptococcus phocae PI80 on growth, immune response and feed utilization of tiger shrimp Penaeus monodon in earthen ponds. The probiotic bacterium S. phocae PI80 was cultured in large fermenter (50 L) by adding additional carbon source in the form of molasses and glucose along with yeast extract as nitrogen source to enrich S. phocae PI80 biomass. This enriched S. phocae PI80 was administered to shrimp in feed (6.5 × 10¹³ bacterial cells mL^?1) as well as in pond water (5 L/pond). Shrimp growth performance was significantly improved (P < 0.05) in 120 days culture when the average body weight of treated molasses + yeast extract (MY) (28.41 ± 0.874 g), glucose + yeast extract (GY) (27.013 ± 0.698 g) was significantly higher than control (23.63 ± 0.684 g). Food conversion ratio FCR was also found to be reduced significantly in ponds treated with probiotics when compared with control pond (1.89 ± 0.09). Vibrio and luminescent bacteria were found to be lower in the treatment receiving MY group, and we hypothesize that this may lead to greater shrimp survival. Furthermore, fermentation product of S. phocae PI80 added to pond water and feed additives enhanced the shrimp immune system. The results indicated that total haemocytes count (THC), phenoloxidase (PO) activity, NBT reductase assay and phagocytic activity significantly increased in shrimps treated with S. phocae PI80. Our study demonstrates that administration of S. phocae PI80 in the water and feed at 6.5 × 10¹³ colony‐forming units (CFU) mL^?1 bacterial cells induce immune modulation and enhances the immune ability of P. monodon in pond‐reared shrimp and increased the shrimp production.     

Growth in juvenile pikeperch (Sander lucioperca L.) stimulated with yeast,Saccharomyces cerevisiae,extract

Thanks to the content of valuable bioactive substances, yeast, Saccharomyces cerevisiae, is finding wider applications in aquaculture and marine fish husbandry. Highly bio‐available and bio‐assimilable yeast extracts, which are obtained through processes that remove cell walls, are of special interest. The current study examined the impact of yeast extracts added to commercial feed at concentrations of 2% (group F2), 4% (group F4) and 6% (group F6) on growth, blood biochemistry parameters, liver and intestinal morphology, proximate body composition and the content of free amino acids in the muscle tissues of European pikeperch, Sander lucioperca (initial body weight = 10 g). At the termination of the experiment that ran for 60 days, the highest increases in body weight were noted in all the groups of fish that had received yeast extract (final body weight ≈ 35 g vs. control group ≈ 31 g). The daily and specific growth rates indexes were the highest in group F6. The alanine aminotransferase activity in this group was half of that in the control group (group C) (p < .05). The lowest levels of plasma bilirubin were noted in groups F4 and F6, while these groups had the highest hepatosomatic indexes that differed significantly to those of group C (p < .05). Microscopic analysis of the intestines indicated significant growth in the enterocyte height and supranuclear zone, or the so‐called absorption space, as the quantity of yeast extract added to the diets increased. Yeast supplementation was not noted to have a significant impact on the proximate body composition or the contents of free amino acids in the fish muscle tissues. In conclusion, the lowest analysed dose of yeast (i.e. 2% yeast extract) stimulates the growth of pikeperch.     

海带表面降油细菌的分离鉴定及降油性能研究

用柴油为唯一碳源的培养基选择分离海带表面具有降解柴油性能的细菌;对分离菌株进行了形态学、生理生化特性以及16SrDNA序列分析并测定其生长特性;测定了接菌不同浓度(7×107 cfu/mL、7×108cfu/mL、7×109 cfu/mL)分离菌对柴油的降解率;另外,测定了加入不同浓度葡萄糖(0.5g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L、10g/L)作用7d后分离菌对柴油的降解率。结果显示:从海带表面分离到2株降油细菌,编号为:HD-4和HD-6。HD-4菌株菌落形态圆形、直径1.5mm、黄色、不透明、边缘整齐,HD-6菌株菌落圆形,直径1.0mm,浅黄色、透明、边缘整齐。两株菌均为革兰氏阴性短杆菌。生理生化特征和16SrDNA序列分析确定HD-4菌株为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.),其16SrDNA同源性为99%;HD-6菌株为交替单胞菌(Alteromonas_sp.),其16SrDNA同源性为98%。2株菌最适生长温度均为15℃。HD-4和HD-6最适生长pH分别为9和8。适宜NaCl浓度分别为2%和4%;在25℃振荡培养(150r/min)7d,接菌量为7×107 cfu/mL、7×108 cfu/mL、7×109 cfu/mL时,HD-4对柴油的初始降解率分别为8.0%,22.1%和27.6%;HD-6初始降解率分别为23.7%、38.8%和43.2%。加入葡萄糖后2株菌的降油率均有所增高,加入4g/L葡萄糖时达最高值,3个接种浓度下HD-4菌株分别为85.4%、82.3%和80.4%,HD-6菌株分别为86.8%、93.7%和89.3%。当接菌量为7×107 cfu/mL,HD-4在葡萄糖含量为4g/L时作用7d,降油率可达到最大值86.72%,HD-6菌株在葡萄糖浓度6g/L达到最大值67.64%。葡萄糖浓度超过4g/L和6g/L时HD-4和HD-6菌株的降油性能有所下降。     

一株水产芽孢杆菌的鉴定及其培养基优化的研究

对从水产养殖环境中筛选出一株菌MM01进行了鉴定和培养条件优化研究。结果显示:此菌MM01能有效的降低养殖水水体中的氨氮和亚硝酸盐含量,经生理生化实验及16S rDNA测序鉴定其为枯草芽孢杆菌。单因素和正交实验结果显示:枯草芽孢杆菌MM01最佳发酵培养基配方为,玉米淀粉18 g/L、玉米浆12 g/L、NH4Cl6 g/L、MnSO4.H2O 0.2 g/L、KH2PO43 g/L、CaCl20.2 g/L、MgSO4.7H2O 0.2 g/L。     

3种品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)盐碱耐受性和生长比较

为评估尼罗罗非鱼的耐盐碱性能,分别测定了上海、山东、河北3种品系尼罗罗非鱼鱼种96 h的半致死盐、碱度,并在不同盐碱混合浓度(S0A0、S10A0、S10A2、S10A4、S10A6)中进行为期60 d的养殖生长比较。单盐、单碱耐性研究表明,上海、山东、河北3种品系尼罗罗非鱼鱼种的96 h半致死盐度分别为18.528 g/L、20.347 g/L、19.342 g/L,96 h半致死Na HCO3碱度为8.827g/L、8.540 g/L、8.542 g/L。盐碱混合条件下,盐度为10时,96 h半致死碱度分别为河北品系(4.377g/L)上海品系(3.561 g/L)山东品系(3.108 g/L),品系之间差异显著(P0.05);盐度为15时,96 h半致死碱度分别为河北品系2.144 g/L,上海品系2.183 g/L,山东品系2.183 g/L,品系之间无显著差异(P0.05),高盐度下尼罗罗非鱼鱼种的碱度耐受性明显低于低盐度下的碱度耐受性。结果表明,尼罗罗非鱼日均增重率在S0A0、S10A0组间无显著差异(P0.05),随着盐碱浓度增加,盐碱S10A4和S10A6组中日均增重率呈下降趋势,河北品系表现出相对生长优势(P0.05)。研究结果为尼罗罗非鱼适宜养殖的盐碱范围的确定、耐盐碱品系的筛选提供了基础资料。