水科院完成首个鲤鱼高密度SNP分型芯片开发

<正>日前,中国水产科学研究院生物技术研究中心在国际期刊BMC Genomics(IF=4.4)上发表了以许建博士为第一作者,徐鹏和孙效文研究员为通讯作者的研究论文,系统报道了该中心完成的鲤鱼高密度SNP分型芯片的研发成果。生物技术研究中心近两年来先后完成了鲤鱼全基因组测序和图谱绘制、全球代表性鲤鱼品系的基因组重测序和基因组遗传变异图谱绘制工作,获得了超过2000万个单核苷酸多态性位点(SNP)。在此基础上,进一步筛选了25万个高质量的SNP位点,这些多态性位点均匀分布在     

利用GoldenGate分析的高通量SNP芯片对鲤基因进行分型

单核苷酸多态性(SNPs)标记在大多数物种基因组中数量巨大且分布均匀,是许多水产物种遗传研究的理想标记,因此快速发展了几种高通量、快速的SNP标记分型平台。本研究利用Golden Gate分析技术对鲤Cyprinus carpio转录组测序的1 536个SNP标记合成了一张中等密度SNP芯片,对5个鲤群体的480份样本进行基因分型。结果表明:1 235个SNP标记成功分型,约占80%;915个标记至少在一个家系中呈现多态性,占74.1%;标记最小等位基因频率(MAF)介于0.05~0.5之间,平均为0.334,其中48.9%的标记最小等位基因频率(MAF)大于平均值;5个群体中SNP标记平均多态性信息含量(PIC)在0.3左右,为中度多态,杂合度为0.010~0.990,平均为0.5左右,暗示群体具有丰富的遗传多态性,育种价值及性状改良潜力很大。本研究分型的多态性SNP标记可广泛应用于遗传多样性研究、标记-性状关联分析以及分子标记辅助育种。     

基于不同密度SNP面板的凡纳滨对虾AHPND抗性基因组预测准确性分析

为评估不同SNP标记密度对凡纳滨对虾AHPND抗性基因组预测准确性的影响，本实验对26个全同胞家系进行Vp AHPND侵染，收集686尾个体的存活时间数据，对其中242尾个体利用液相芯片“黄海芯1号”(55.0 K SNP)进行基因分型，基于A、G和H亲缘关系矩阵估计Vp AHPND侵染后存活时间的遗传参数；采用随机和等距抽取方式，基于55.0K SNP构建了8个低密度SNP面板(40.0、30.0、20.0、10.0、5.0、1.0、0.5和0.1 K)，利用GBLUP和ssGBLUP等方法预测Vp AHPND侵染后存活时间的基因组育种值，利用交叉验证方法计算其预测准确性，并与BLUP方法进行对比分析。遗传参数估计结果显示，Vp AHPND侵染后存活时间表现为高遗传力水平，估计值为0.68～0.79。在55.0 K SNP密度下，针对242尾基因分型个体数据集(G242)，利用BLUP、GBLUP和ssGBLUP方法获得的预测准确性分别为0.424、0.450和0.452,GBLUP和ssGBLUP比BLUP分别提升了6.13%和6.60%；针对686尾表型测定个体数据集(P686)...     

紫贻贝EST-SNP的筛选及多态性检测

利用EST 数据库开发SNP是筛选SNP标记的重要途径。本研究利用EST数据库开发紫贻贝的SNP标记,利用QualitySNP软件对紫贻贝已有的19 709条EST序列中含有4条以上同源序列的重叠群进行分析,在含有4条以上同源序列的963个重叠群中,筛选得到候选SNP位点4 833个,SNP的平均频率为129.1 bp,其中C/T和 A/G突变较多,分别占总数的28.8%和27.4%。 根据候选SNP位点设计30组引物,通过等位基因特异性PCR结合溶解曲线分析,在30个野生个体中进行基因分型验证,6组引物(20%)没有扩增产物,10组引物(33%)没有多态性,〖JP2〗14组(47%)引物具有二等位基因多态性,稀有等位基因的频率为0.083~〖JP〗0.446,观测杂合度和期望杂合度的范围分别为0.166 7~0.615 4和0.155 4~0.503 2。序列比对结果显示,14组引物中的12个SNP位点位于基因编码区,并且全部为同义突变。研究结果表明,EST数据库中存在大量的SNP位点,差异熔解曲线法是一种高效便捷的SNP分型方法,所筛选的SNP标记可用于紫贻贝遗传学分析。     

大黄鱼性别特异SNP标记的开发与验证

大黄鱼是我国养殖量最大的海水经济鱼类,其雌鱼生长显著快于雄鱼,但两性的外部形态差异不明显,也没有异形性染色体,依靠传统方法无法对其活体准确进行生理性别和遗传性别的判别与鉴定,需要开发性别特异的分子标记。本研究从2尾雌鱼和2尾雄鱼、以及分别由50雌鱼与50尾雄鱼组成的2个混合样品的基因组重测序数据比较中筛选与性别显著关联的SNP位点,对其中11个位点分别设计引物在15尾雌鱼和15尾雄鱼中扩增出PCR产物进行Sanger测序验证,鉴定出1个与性别完全连锁的位点(SNP6,15尾雌鱼均为纯合、15尾雄鱼均为杂合)。然后,设计等位基因特异性PCR引物,其中包括2条雌性与雄性通用引物和1条雄性特异引物,在闽—粤东族与岱衢族大黄鱼合计近2 200个个体中进行扩增,结果在全部雌鱼中都只扩增出1个348 bp的条带,而在全部雄鱼中还扩增出1个194 bp的Y染色体特异条带,检出率达到100%。研究表明,大黄鱼属于XX♀-XY♂类型的性别决定。本研究鉴定出一个雄性特异SNP标记,并建立了一种新的大黄鱼遗传性别鉴定技术,为大黄鱼单性育种、基因组选择育种和性别决定分子机制研究提供了重要的技术手段。     

鲑鳟通用型低通量单核苷酸多态性芯片的开发

为开发常见鲑鳟养殖物种通用的遗传分析工具,本研究利用Affymetrix虹鳟(Oncorhynchus mykiss) 57K高通量单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)芯片,对国内代表性鲑鳟养殖群体开展了分型检测,包括山女鳟(Oncorhynchus masou masou)、银鲑(Oncorhynchus kisutch)、美洲红点鲑(Salvelinus fontinalis)、白斑红点鲑(Salvelinus leucomaenis) 4个物种,从57,501个SNP标记中筛选出96个共享多态性标记,应用Fluigidm 96.96动态芯片平台,构建了大麻哈鱼属(Oncorhynchus)和红点鲑属(Salvelinus)通用型低通量SNP芯片。该芯片分型结果准确性较高,与Affymetrix高通量芯片分型一致性达到96.55%。使用该芯片对来自6个家系的48尾银鲑个体及其候选亲本进行检测,应用Cervus 3.0.7软件进行亲权鉴定,结果能够准确重现复杂家系的真实系谱。在用于单亲本亲权鉴定时,第一亲本非排除率(Non-exclusion probability for first parent, NE-1P)为4.120×10~(–4);用于双亲本亲权鉴定时,双亲非排除率(Non-exclusion probability for parent pair, NE-PP)低至6.219×10~(–12),表明该芯片在鲑鳟养殖群体系谱鉴定应用中具有较高的准确性。使用该芯片开展4个鲑鳟养殖群体遗传结构分析,样本分群聚类结果与其所属的分类阶元相符,能够准确反映群体遗传组分构成和遗传关系。本研究构建的低通量SNP芯片在常见鲑鳟养殖物种中具有良好的通用性,将其应用于养殖群体遗传分析,能够为鲑鳟制种、育种和引种等科学决策提供基因组信息参考。     

刺参(Apostichopus japonicus)重要经济性状相关SNP标记的验证分析

本研究在前期构建的刺参(Apostichopus japonicus)高密度遗传连锁图谱和QTL分析的基础上，筛选出26个与体长、体重、体宽、棘刺总数、抗病力相关的SNP位点，设计出可用于HRM检测的SNP扩增引物13对。在扩大群体中利用HRM小片段法对这13个刺参重要经济性状相关的候选SNP位点进行分型和多态性检测，并结合扩大群体的相关性状数据进行了QTL位点验证。多态性结果显示，13个位点中有3个单态性位点，其余10个多态性位点中有3个位点为低等位多态性，7个位点为中等位多态性。10个多态性位点的最小等位基因频率(MAF)介于0.016(SNP113)~ 0.332(SNP160)之间，平均值为0.173；各位点的观测杂合度(Ho)介于0.031(SNP113)~0.818(SNP9)之间，平均值为0.433；期望杂合度(He)介于0.031(SNP113)~0.834(SNP9)之间，平均值为0.402；多态信息含量(PIC)介于0.030(SNP113)~0.393(SNP160)之间，平均为0.248，有6个位点偏离Hardy- Weinberg平衡。QTL验证结果表明，SNP40和SNP160位点为与生长(体长、体重、体宽)相关的位点，各位点的优势基因型分别为SNP40(CC)和SNP160(AA)；SNP88、SNP112和SNP126这3个位点为与抗病力相关的位点，各位点的优势基因型为SNP88(CC)、SNP112(AA)和SNP126(TT)。基于这5个位点构建生长和抗病二倍型，发现二倍型K1(CC AA TT)抗病力最强，S1(CC AA)、S3(CC AC)在生长方面优势显著，相关研究结果可为分子标记辅助育种在生产中应用提供基础数据。     

仿刺参疣足数量SNP遗传力评估

随着测序技术的发展，基于单核苷酸多态性(SNP)分子标记的遗传力估计比传统法准确性更高，已被广泛应用于动植物育种中。本研究对不同地理仿刺参(Apostichopus japonicus)群体的疣足数量进行重测序全基因组水平的SNP遗传力估计，结果显示，次等位基因频率(Minor allele frequency, MAF) >0.05时，在50K SNP基础上均匀抽样，不同SNP密度的仿刺参疣足数量SNP遗传力估计均值范围为(0.566±0.022)~(0.612±0.003)；MAF>0.1时，SNP遗传力估计均值范围为(0.586±0.015)~(0.615±0.016)，说明50K低密度SNP标记足够捕获数量性状基因座(QTL)大效应和小效应；同时，染色体水平SNP遗传力估计值显示，单个染色体对遗传力的贡献和其长度显著相关，暗示仿刺参疣足数量是一个复杂的数量性状，与该性状相关的基因效应位点散布在各染色体，并由多基因共同作用。本研究结果可为海参低密度SNP芯片的设计开发及海参遗传参数评估提供一定的理论依据。     

刺参(Apostichopus japonicus)重要经济性状相关SNP标记的验证分析

本研究在前期构建的刺参(Apostichopus japonicus)高密度遗传连锁图谱和QTL分析的基础上,筛选出26个与体长、体重、体宽、棘刺总数、抗病力相关的SNP位点,设计出可用于HRM检测的SNP扩增引物13对。在扩大群体中利用HRM小片段法对这13个刺参重要经济性状相关的候选SNP位点进行分型和多态性检测,并结合扩大群体的相关性状数据进行了QTL位点验证。多态性结果显示,13个位点中有3个单态性位点,其余10个多态性位点中有3个位点为低等位多态性,7个位点为中等位多态性。10个多态性位点的最小等位基因频率(MAF)介于0.016(SNP113)～0.332(SNP160)之间,平均值为0.173;各位点的观测杂合度(Ho)介于0.031(SNP113)～0.818(SNP9)之间,平均值为0.433;期望杂合度(H_o)介于0.031(SNP113)～0.834(SNP9)之间,平均值为0.402;多态信息含量(PIC)介于0.030(SNP113)～0.393(SNP160)之间,平均为0.248,有6个位点偏离HardyWeinberg平衡。QTL验证结果表明,SNP40和SNP160位点为与生长(体长、体重、体宽)相关的位点,各位点的优势基因型分别为SNP40(CC)和SNP160(AA);SNP88、SNP112和SNP126这3个位点为与抗病力相关的位点,各位点的优势基因型为SNP88(CC)、SNP112(AA)和SNP126(TT)。基于这5个位点构建生长和抗病二倍型,发现二倍型K_1(CC AA TT)抗病力最强,S_1(CC AA)、S_3(CC AC)在生长方面优势显著,相关研究结果可为分子标记辅助育种在生产中应用提供基础数据。     

基于SLAF-seq技术的鱼康浪白鱼SNP位点开发

为进一步开展鱼康浪白鱼的分子生物学研究,采用SLAF-seq(specific length amplification fragment sequencing)技术获取鱼康浪白鱼大量多态性SLAF标签,进而通过序列分析开发一批特异性高的单核苷酸多态性(SNP)标记。试验共获得688615个SLAF标签,平均测序深度为107.73 x,其中多态性SLAF标签205138个,通过序列分析检测到487 639个SNP标记。试验表明,SLAF-seq技术可较好地用于鱼康浪白鱼SNP位点开发,其效率远远高于ISSR(inter-simple sequence repeat)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、RAPD(random amplified polymorphism DNA)等传统分子标记技术。从全基因组范围获得的SNP位点标记可用以进一步完成后续群体进化分析和特异性SNP标记的开发。     

Estimation of variation of virulence of Renibacterium salmoninarum by survival analysis of experimental infection of salmonid fish

The variation of virulence of Renibacterium salmoninarum , the causative agent of bacterial kidney disease (BKD) in salmonid fish, was studied by infecting rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), with two isolates (strains 325 and 932) from diseased Atlantic salmon, Salmo salar L., and one isolate (strain 4366) from an apparently healthy Atlantic salmon. Coho salmon, Oncorhynchus kisutch (Walbaum), were injected with the strain 932 to estimate difference in fish species resistance. Fish were removed by random sampling for other study purposes, a study design possible with analysis of lifetime distributions incorporating both sampling-, death- and survival-times. At the end of the experiment, the rainbow trout infected with strains 325, 932 and 4366 had a survival probability of 33%, 51% and 72%, respectively. The coho salmon infected with strain 932 had a 26% survival probability. The strain differences were significant according to the log-rank test, and the risk ratio between the strains ranged from 1·8 to 5·4. The strain from the apparently healthy fish was least virulent. The survival of the fish species was different over time. Rainbow trout were more likely to die early in the time course, but high numbers of coho died later, resulting in an overall risk of mortality of 1·4 in favour of rainbow trout. Differences in virulence may reflect changed selective pressure on R. salmoninarum when introduced from feral stocks into the environment of fish farms.     

Characterization of protease inhibitors of seminal plasma of cyprinids

Anti-proteinase activity was demonstrated in the seminal plasma of cyprinid fish species (bream, chub, ide, dace, asp, goldfish, roach, common carp) using electrophoretic techniques combined with a detection method based on inhibition of bovine trypsin. We found species-specific protease inhibitors in the seminal plasma of cyprinids. At least three bands of protease inhibitors with different migration rates could be identified by native PAGE. Higher variability was characterized for bands with slower migration rates. Visualization of inhibitors after SDS-PAGE under non-reducing conditions allowed estimation of their molecular weights. Apparent molecular weights were within the range of 51–59 and 47–54 kDa for the bands with slower and moderate migration rates, respectively. The molecular weight of fast migration bands for roach and common carp were estimated to 23 and 30 kDa, respectively. Inhibitors of common carp seminal plasma differed in their affinity toward serine proteases. Three inhibitors in common carp seminal plasma could be visualized using cod and bovine trypsin, but only two inhibitors (of high molecular weight) were recognized with chymotrypsin. There were differences in anti-proteinase activity and seminal plasma protein concentration in relation to the origin of common carp seminal plasma (breeding lines) and time of milt collection (spawning vs. post-spawning season).     

母猪胎衣不下的病因与防治要点

猪的胎盘属于弥散型胎盘,这种胎盘的结构特点和饲养管理的不当,常常导致母猪胎衣不下发生,给生猪的生产繁殖带来极大损失。本文针对母猪胎衣不下发生病因、综合防治进行详细阐述,旨在对预防和治疗胎衣不下能有所帮助。     

水硬度对七彩神仙鱼幼鱼发育的影响

采用不同硬度的水对七彩神仙鱼幼鱼进行饲养。6周龄幼鱼在硬度为7.94°dH±0.30°dH时饲养84d后,比在硬度为14.71°dH±0.23°dH水中的幼鱼个体大,生长速度快。表明较高硬度的水有利于七彩神仙鱼幼鱼的生长发育。     

牙鲆刺激隐核虫病的防治

2005年七、八月份,乐亭、滦南一带多家工厂化牙鲆养殖场发生刺激隐核虫病,此种病虫害发病急、传染快、死亡率高。发生过该病的养殖场牙鲆死亡率一般都在50％～80％之间,这种病害给牙鲆养殖业带来很大损失。     

虎斑乌贼受精卵卵黄营养成分分析

本实验对虎斑乌贼受精卵卵黄的营养成分进行分析,旨在探讨其幼体的营养需求量,为其幼体配合饲料研制提供参考数据。随机选取大约800个虎斑乌贼受精卵的卵黄,采用国家标准方法测定其水分、灰分、粗蛋白质、粗脂肪、氨基酸、脂肪酸和矿物元素含量。结果表明:1)虎斑乌贼受精卵卵黄中粗蛋白质含量为76.33%(干重基础);总氨基酸(TAA)和必需氨基酸(EAA)含量分别为71.22%和32.38%(干重基础),EAA/TAA为45.46%,氨基酸中以谷氨酸(Glu)含量最高(9.97%),必需氨基酸中亮氨酸(Leu)含量最高(7.58%)。2)其粗脂肪含量12.71%(干重基础);共检出17种脂肪酸,包括8种饱和脂肪酸(SFA)、5种单不饱和脂肪酸(MUFA)和4种多不饱和脂肪酸(PUFA),SFA、MUFA和PUFA分别占脂肪酸总量的43.47%、7.54%和49.25%,其中以DHA含量最高,达32.80%,EPA含量为7.70%,DHA/EPA为4.26。3)检测出Na、K、Ca、Mg、Sr、Mn、Fe、Cu、Zn、Al和As 矿物元素,微量元素中富含Zn、Al和Fe,含量分别为 0.77、0.71和0.43 mg/kg(鲜重基础)。由此可见,卵黄具有高蛋白、低脂肪,富含n-3PUFA的特点;虎斑乌贼幼体饲料中蛋白质需求量参考值为76.33%;氨基酸需求量参考值,如赖氨酸(Lys)为5.49%,蛋氨酸(Met)为2.63%;脂肪的需求量参考值为12.71%,DHA为4.17%,EPA为0.98%;微量元素需求量参考值,如Zn为2.77 mg/kg,Cu为0.19 mg/kg(干重基础)。     

斑节对虾虾苗活力检测方法

该研究通过肉眼观察、镜检，进行干露、饥饿、盐度突降、福尔马林等抗性试验，并采用病毒检测等方法，以期建立评估斑节对虾（Penaeus monodon）虾苗活力和质量标准。结果表明，斑节对虾健康虾苗具有趋光性、集群性，体表光洁，肌肉透亮，肠胃食物充盈等特性。测试虾苗干露时间以15min为宜，健康虾苗干露后能立即恢复活力，而病弱虾苗多出现死亡、昏迷现象；虾苗的成活率随饥饿时间的延长而降低，随福尔马林浓度升高和时间延长而降低，随盐度突降幅度增加而降低。健康虾苗能忍受100～200μL·L^-1福尔马林溶液30min，成活率近100％；在盐度20～30下虾苗的成活情况较好，而其在淡水中仅能存活1h。对虾苗进行病毒检测，可以避免养殖中因虾苗携带病毒而可能导致的病毒性疾病的暴发。     

金鳟、虹鳟苗种长途运输实例

鳟鱼发眼卵和旨种运输是养鳟生产的重要环节。发眼卵多在冬季和早春运输，苗种多在晚春和夏季运输。苗种运输大多以鱼篓充氧进行短距离汽车运输，长途运输冷水性鱼苗种的实例很少。本文总结了金鳟和虹鳟苗种长途运输方法，以期与养鳟业界共同交流提高。一、包装材料和方法内包装材料是苗种运输专用塑料袋，规格54×104cm，外包装是泡沫塑料箱，规格63.5×45.5×30．5cm，纸箱规格64×46×32．5cm。塑料袋采取双层式，内装苗种和水共12.5kg，其中苗种0.5-1．3kg，100－2000尾。起运前苗种停食1－2天。运鱼用水水温调至6℃，鱼、水入袋后袋内…     

头足类耳石微化学研究进展

耳石是位于平衡囊内起平衡作用的一对钙化组织,它是头足类的加速度感应器,记录其生命周期内的生物和生态信息。随着鱼类耳石微化学研究及应用的日趋成熟与完善,头足类耳石的相应研究也逐渐兴起。目前头足类耳石微化学的研究内容主要包括无机和有机大分子、微量元素、同位素、微化学标记等方面,其中微量元素是应用研究的重点,在头足类种群识别、生活史分析及栖息环境重建等方面发挥了重要作用。分析认为,头足类微量元素在与栖息环境尤其水温关系的研究中取得了很好的结果,被认为是测定头足类生活水温的温度计。然而,涉及种群识别、生活史分析以及与盐度和食物关系的研究还不够充分,且多集中于Sr/Ca的研究。因此,建议在今后的研究中要综合多种研究方法按时间和空间序列从日轮水平分析多种微量元素的含量与变化。     

不同品系盐生杜氏藻培养技术的研究

4种不同品系盐生杜氏藻培养结果表明：常温下,A33是最适宜培养的藻种,经4天培养,藻细胞密度可达到114×104cell／ml,细胞生长率达到0．369;其次是A23、A140、A5藻种,细胞生长率分别为0．317、0．314、0．234。控温条件下,4种品系杜氏藻细胞生长速度明显增高,是常温条件下的1．2倍。