尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因的克隆、表达及多态性分析

为进一步了解鱼类MHC ⅡA基因的特点及其在免疫反应中的功能,采用同源克隆、RACE-PCR、巢式PCR等技术,从健康的尼罗罗非鱼体获得1 205 bp的MHC ⅡA基因cDNA全序列(Orni-DBA-0101,Genebank登录号:JF719813)及1 388 bp的基因组序列。序列分析发现,尼罗罗非鱼MHC ⅡA基因含4个外显子和3个内含子,开放阅读框长720 bp,编码239个氨基酸。从4尾尼罗罗非鱼中共得到8条不同的cDNA序列,分别编码不同的氨基酸序列。氨基酸序列比对后发现,序列间存在丰富的多态性,且主要集中在α-1区,多态性位点数远远高于半滑舌鳎MHC ⅡA基因。生物信息学分析表明,尼罗罗非鱼MHC ⅡA编码的蛋白质分子包含1个信号肽、2个胞外结构域、1个跨膜区和1个胞质区,存在4个保守的半胱氨酸残基以及丰富的磷酸化位点,与其他物种的相似性为23%～65%。RT-PCR结果表明,MHC ⅡA基因在脾、肾、肠、鳃、性腺、肝、心脏表达量很高,在鳔和肌肉中表达量最低。人工感染嗜水气单胞菌后,肝、脾、肾、鳃、肠5个组织中MHC ⅡA基因的mRNA水平均发生了不同程度的变化,提示MHC ⅡA分子作为一种重要的免疫因子,在清除病原的免疫反应中起着重要作用。     

圆斑星蝶MHC ⅡB基因结构、多态性及组织表达分析

通过表达序列标签法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,分离和克隆了圆斑星鲽(Verasper variegatus)主要组织相容性复合体(MHC)IIB的全长cDNA序列,该cDNA全长为1 144 bp,5'UTR(untranslated region)为7 bp,3'UTR为450 bp,开放阅读框(ORF)长度为687 bp,可编码228个氨基酸,包含信号肽、抗原结合域(β1),IGC区(β2),跨膜区和胞质区5个结构域.同源分析表明,圆斑星鲽MHC IIB氨基酸序列与其他硬骨鱼具有49%-79%的同源性,与鼠、人、红原鸡和护士鳖的相似性较低,分别为34%,33%,31%和30%.圆斑星鲽MHC IIB基因含有5个内含子,与其他硬骨鱼不同,其β2结构域编码区内存在I个109 bp的内含子.根据获得的MHC IIB基因组序列设计特异性引物,在10尾野生圆斑星鲽中扩增了包括完整内含子1和外显子2的长度约388 bp的DNA片段,PCR产物直接测序后发现在270 bp的抗原结合域中共有23个位点发生变异,密码子第1位和第2位的变异明显高于第3位.利用荧光定量PCR分析组织表达发现,MHC IIB基因在健康圆斑星鲽9种组织中均有表达,但表达量存在差异,肾的表达量最高,肌肉的表达量最低,肾、心、脾脏和鳃的表达量显著高于肝、皮肤、脑、血和肌肉.本研究旨在为MHC基因家族的遗传进化分析、结构与功能的解析提供基础,同时为圆斑星鲽的分子免疫学和标记辅助育种研究提供参考依据.     

黄鳝载脂蛋白A1的基因结构及表达谱分析

根据克隆的黄鳝载脂蛋白A1基因的部分序列,进行5′RACE扩增和内含子的克隆并采用荧光定量PCR分析该基因的表达谱。结果表明,该基因cDNA全长1207bp,5′UTR区域长32bp,编码1个262aa的多肽;在长1391bp的gDNA上,只发现了1个长184bp的内含子。荧光定量PCR对该基因在不同组织和病原细菌嗜水气单胞菌感染后的表达情况分析表明,该基因转录本在肝脏中表达量最高,在胃、肾脏、小肠、脑、皮肤和血液中表达量中等,而在心脏、脾脏和肌肉中表达量很低;病原细菌感染会显著影响该基因在小肠、肝脏和脾脏中的表达水平。以上结果显示黄鳝的载脂蛋白Apo-A1基因可能参与了鱼体的天然免疫反应。     

稀有鮈鲫MHCⅡβ基因克隆及鲁氏耶尔森菌感染后的表达分析

为探究稀有鲫MHCⅡβ基因的分子特征及其表达特点,采用PCR扩增技术获得了稀有鲫MHCⅡβ cDNA序列810 bp,包括开放阅读框(ORF)759 bp,编码252个氨基酸。生物信息分析表明,MHCⅡβ氨基酸序列存在4个保守的半胱氨酸残基和GXXGXXXGXXXXXXG结构,与其他亲缘鱼类的一致性为51.78%～80.56%,其编码的蛋白质分子包括1个信号肽、1个MHCⅡβ (β-1)结构域、1个IGc1 (β-2)结构域和1个跨膜螺旋区域。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示,MHCⅡβ在脾脏表达量最高,头肾、鳃、皮肤表达量较高。人工感染鲁氏耶尔森菌后,6 h时在头肾表达呈显著上调,肝脏中在12 h开始出现极显著上调,皮肤中在24 h和48 h表达极显著,鳃中在6～24 h表达极显著,脾脏中则是在6 h出现极显著下调,于96 h接近对照组表达水平。初步研究表明,MHCⅡβ在鱼类抵御细菌感染的免疫反应中发挥着重要作用,为进一步揭示稀有鲫MHC家族的功能提供了参考依据。     

圆斑星鲽MHC IIB基因结构、多态性及组织表达分析

通过表达序列标签法和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,分离和克隆了圆斑星鲽(Verasper variegatus)主要组织相容性复合体(MHC)IIB的全长cDNA序列,该cDNA全长为1144bp,5'UTR(untranslated region)为7bp,3'UTR为450bp,开放阅读框(ORF)长度为687bp,可编码228个氨基酸,包含信号肽、抗原结合域(β1)、IGC区(β2)、跨膜区和胞质区5个结构域。同源分析表明,圆斑星鲽MHCIIB氨基酸序列与其他硬骨鱼具有49%～79%的同源性,与鼠、人、红原鸡和护士鲨的相似性较低,分别为34%、33%、31%和30%。圆斑星鲽MHC ⅡB基因含有5个内含子,与其他硬骨鱼不同,其β2结构域编码区内存在1个109bp的内含子。根据获得的MHC ⅡB基因组序列设计特异性引物,在10尾野生圆斑星鲽中扩增了包括完整内含子1和外显子2的长度约388bp的DNA片段,PCR产物直接测序后发现在270bp的抗原结合域中共有23个位点发生变异,密码子第1位和第2位的变异明显高于第3位。利用荧光定量PCR分析组织表达发现,MHCIIB基因在健康圆斑星鲽9种组织中均有...     

玻璃红鲤MHCⅡ类基因多态性与组织表达分析

以cDNA为模板进行PCR扩增和克隆分析,从7尾玻璃红鲤(Cyprinus carpio var.wananensis)的70个有效克隆中,获得长度为624 bp的MHC IIα/β不同编码序列25/31个,分属于7/10个不同等位基因,揭示玻璃红鲤MHC II类基因的多态性仍较丰富。其中Cyca-DXA17*01和Cyca-DAB1*1201、Cyca-DAB1*1301、Cyca-DAB3*1901、Cyca-DAB3*2001、Cyca-DAB3*2101、Cyca-DAB3*2201为新发现的7个基因。分析表明,α1/β1结构域的核苷酸/氨基酸变异位点数明显高于α2/β2结构域;α1、β1结构域抗原结合位点(PBR)的ω值(ω=dN/dS,5.209和1.703)都大于1,揭示玻璃红鲤MHC II类基因在进化过程中受到正向选择作用。半定量分析显示,玻璃红鲤MHC II类基因在肾和脾中有较强表达,中等程度表达于胃、肝和肠,而鳃、心和眼的表达较弱。     

中华鳖MHCⅡα基因cDNA的克隆及组织表达分析

为了探究中华鳖(Pelodiscus sinensis)的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)的结构和功能,本研究利用RACE技术成功克隆获得中华鳖MHCⅡα基因的cDNA全长序列,其长度为1296 bp,开放阅读框(ORF)为807 bp,共编码268个氨基酸,分为信号肽序列、Ⅱ类组织相容性抗原α结构域、IGc1结构域及跨膜结构域4个功能结构域。通过NJ法构建的系统进化树分析显示,中华鳖与西部锦龟(Chrysemys picta bellii)亲缘较近,而与哺乳类、鸟类及鱼类亲缘关系较远。荧光定量PCR结果显示,MHCⅡα mRNA在中华鳖8个组织中均有表达,在脾、心、肝及肠组织中表达水平较高,在肌肉组织中表达量最低。感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) 12 h后,中华鳖MHCⅡα mRNA在肝和肠组织中的表达显著上调;感染1 d时,在脾组织中的表达显著上调;感染1 d及5 d时,在肾组织中的表达显著上调。研究表明,中华鳖MHCⅡα基因参与了中华鳖免疫反应。     

圆斑星鲽促性腺激素释放激素基因克隆及表达特性

采用RACE技术,在圆斑星鲽(Verasper variegatus)脑中克隆到3种GnRH基因的cDNA序列: cGnRH-Ⅱ、sGnRH和sbGnRH.每种GnRH都包括1个信号肽、1个Gly-Lys-Arg连接序列和1个GnRH相关肽.其中, cGnRH-Ⅱ的cDNA全长为568 bp,编码85个氨基酸, ORF为255 bp,5′UTR为141 bp,3′UTR为169 bp.sGnRH的cDNA全长为457 bp,编码90个氨基酸, ORF为270 bp,5′UTR为41 bp,3′UTR为143 bp.sbGnRH的cDNA全长为381 bp,编码98个氨基酸, ORF为294 bp,5′UTR为48 bp,3′UTR为36 bp.分析了3种GnRH基因的编码氨基酸序列与其他脊椎动物的同源性,圆斑星鲽 GnRH 与鲽形目鱼类氨基酸同源性最高,其次为鲈形目鱼类.对3种 GnRH 基因的系统进化分析表明,圆斑星鲽 GnRH 基因与其他鲽形目鱼类亲缘关系最近,其次为鲈形目、鲑形目和鳗鲡目鱼类.荧光定量PCR分析表明,3种GnRH基因都在脑中表现出最高表达水平且具有性别特异性表达模式:雌性中不同组织的 GnRH mRNA 表达水平都相应高于雄性.组织表达分析表明, cGnRH-Ⅱ的 mRNA 仅在脑中表达,而sbGnRH在各个组织都有表达, sGnRH仅在脑、垂体和性腺中表达.脑中sbGnRH mRNA的表达水平在卵巢成熟过程中变化显著(P<0.05),而其他两种GnRH的mRNA表达水平变化不显著(P>0.05).本研究首次在圆斑星鲽脑中克隆到3种GnRH基因,其组织和季节表达水平变化表明sbGnRH可能是圆斑星鲽生殖调控的关键GnRH类型,本结果可为圆斑星鲽生殖调控机制和人工繁育技术研究提供理论支撑.     

军曹鱼白细胞介素1β基因的克隆、分析及表达

采用同源克隆和锚定PCR技术，从军曹鱼(Rachycentron canadium Linnaeus)中克隆到白细胞介素1β(interleukin-1β)基因cDNA的全序列。军曹鱼IL-1β的cDNA全长1104bp，3′非编码区域(UTR)为255bp，5′UTR为108bp，开放阅读框(ORF)为741bp，编码246个氨基酸，分子量大约为27．68kD，理论等电点为5．71。同源性分析表明，该序列与其他鱼类甚至哺乳动物的IL-1β基因具有很高的相似性，并含有白细胞介素家族的签名序列(signature)。同时，利用RT—PCR技术，对特异性病原刺激下该基因在鱼体内的表达情况进行初步研究，发现IL-1β基因在鱼体的多种组织中都有表达，而经过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后，目的基因在组织中的表达明显增加，但是在不同组织内的表达存在差异。研究显示，军曹鱼IL-1β基因存在组成型和诱导型2种表达调控机制，在抵御病原感染过程中发挥重要作用。     

半滑舌鳎多聚免疫球蛋白受体(pIgR)基因的克隆和表达分析

本研究根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)基因组数据库中预测的多聚免疫球蛋白受体(Polymeric immunoglobulin receptor, pIgR)序列,通过PCR和RACE技术获得了半滑舌鳎pIgR基因cDNA,全长为1419 bp,开放阅读框(ORF)为1020 bp,编码339个氨基酸,5′UTR区域为109 bp,3′UTR区域为290bp。保守结构域分析显示,半滑舌鳎pIgR蛋白包含1个信号肽,2个免疫球蛋白功能域(Ig-like domain, ILD)和1个跨膜结构域。经蛋白序列同源比对和系统进化树分析,发现半滑舌鳎pIgR与大菱鲆(Scophthalmus maximus)和牙鲆(Paralichthy solivaceus)的pIgR亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析显示,pIgR基因在健康半滑舌鳎的不同组织中均有表达,在鳃中表达较高,在肌肉中表达最低。经哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)病原感染刺激后,pIgR基因在半滑舌鳎的5个组织(肝脏、脾脏、肾脏、肠和鳃)中均呈先上升后下降的趋势,其中,在脾脏和鳃中48 h达到最高值,在肝脏、肾脏和肠中72 h达到峰值。与内脏组织不同的是,pIgR基因在皮肤中呈一直上升的趋势。上述结果表明,pIgR基因在半滑舌鳎抵御哈维氏弧菌的免疫应答中发挥重要作用。     

奥利亚罗非鱼、尼罗罗非鱼MyoD1和MyoD2基因特征及差异

采用RT-PCR和RACE法,分离了奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)、尼罗罗非鱼(O.niloticus)MyoD1和MyoD2基因全长cDNA。结果显示,2种罗非鱼MyoD1全长均为1090bp,包括5′非翻译区(UTR)137bp,3′UTR50bp,开放阅读框(ORF)903bp,编码300个氨基酸,其中第110～161个氨基酸为bHLH结构,第233～249个氨基酸为helixIII结构;MyoD2全长均为1478bp,包括5′UTR215bp,3′UTR471bp,ORF792bp,编码263个氨基酸,其中第91～142个氨基酸为bHLH结构,第212～228个氨基酸为helixIII结构。2种罗非鱼MyoD1与其他鱼类MyoD1的相似性为73%～92%;MyoD2与其他鱼类MyoD2的相似性为74%～79%。系统发育树显示,MyoD1和MyoD2分属两支,MyoD1所反映的不同鱼类间的亲缘关系符合传统分类。2种罗非鱼的MyoD1、MyoD2cDNA序列之间只存在个别碱基的差别,而氨基酸序列一致;奥利亚罗非鱼MyoD1的2个内含子均比尼罗罗非鱼的长。根据MyoD1内含子2的差异构建鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼基因混杂的标记,对形态上典型的15尾奥利亚罗非鱼、18尾尼罗罗非鱼及15尾奥尼罗非鱼[Oreochromis aureus(♂)×Oreochromis niloticus(♀)]进行鉴定。结果其中1尾奥利亚罗非鱼中在MyoD1位点混杂了尼罗罗非鱼的基因,尼罗罗非鱼和奥尼罗非鱼则与预期的一致。该研究为选择基因纯合的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼提供了新的分子手段。     

三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

采用RTPCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1 483 bp,由长92 bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),257 bp的3′非翻译区,和1 134 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为41.9 ku,理论等电点为5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178,Ser305,Ser321,Pro325,Val331,Pro346等6个氨基酸残基具有特异性,此外还发现3个特殊的氨基酸残基位点以及2个软体动物特有的氨基酸残基。三角帆蚌β-actin氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达98%~99%。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。RT-PCR显示β-actin基因在外套膜、血液、肝、肾、胃、肠、鳃、斧足共8个组织的表达基本一致,具有良好的稳定性。     

大头鳕TNFSF6基因的结构分析及其在发育早期和病毒暴发时的表达水平

为揭示大头鳕TNFSF6基因的基本结构与功能及其在大头鳕发育和神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus, PCNNV)暴发时的响应机制,本研究通过基因克隆获得TNFSF6 cDNA开放阅读框序列,并对序列进行生物信息学分析,运用相对荧光定量PCR(qRT-PCR)方法对TNFSF6在不同组织、孵化后不同日龄仔鱼和PCNNV感染前后仔稚鱼中的表达水平进行检测。结果显示,大头鳕TNFSF6 cDNA长1 388 bp,5′UTR占315bp,3′UTR占500 bp,ORF全长573 bp,编码190个氨基酸。qRT-PCR结果显示,TNFSF6在各组织均有表达,但在脾脏和鳃组织中的表达量较高;大头鳕孵化后15、20、37和40 d TNFSF6基因的转录水平分别是其在5 d转录水平的0.28、0.15、0.12和0.13倍。在24 d和46 d PCNNV暴发时,病鱼TNFSF6基因的转录水平高于对照组;在77 d PCNNV暴发时,病鱼TNFSF6转录水平则显著低于对照组。研究表明,TNFSF6基因在大头鳕发育早期和仔鱼暴发PCNNV时发挥了重要的作用。     

中国对虾甘氨酸脱羧酶的基因克隆、表达及其与抗WSSV的关联分析

本研究采用RACE技术克隆获得中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)甘氨酸脱羧酶基因(Fc GLDC)的全长cDNA及DNA序列,并对其进行生物信息学分析。结果显示,FcGLDC基因的cDNA全长为3481 bp,其中,ORF为2829 bp,5￠UTR长17 bp,3￠UTR长86 bp。完整的阅读框编码942个氨基酸,分子量为104.66 kDa,预测的理论等电点为6.51。FcGLDC基因DNA序列全长共4964bp,包含12个外显子和11个内含子。同源性及系统进化分析显示,FcGLDC基因与节肢动物的GLDC基因聚为一类;氨基酸序列比对发现,Fc GLDC基因的蛋白序列与节肢动物的相似度最高,与内华达白蚁(Zootermopsis nevadensis)、体虱(Pediculus humanus corporis)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)的相似度分别为71%、68%和68%。在鳃、肝胰腺和肌肉中的荧光定量PCR结果显示,FcGLDC在肌肉中的相对表达量最高,鳃中最低。WSSV感染后,该基因在鳃、肝胰腺和肌肉中呈现出了不同的时空表达特点。使用直接测序法结合质谱法,在该基因内部发现4个SNP位点,但是各位点与抗WSSV性状均不相关(P0.05)。本研究表明,FcGLDC基因在对虾感染WSSV后的应答反应中或起一定作用。     

文蛤Clq基因的克隆与表达及其重组蛋白活性的研究

利用构建的文蛤cDNA文库,克隆得到了文蛤Clq基因全长cDNA序列,该序列全长1213bp,5′UTR为316 bp,3′UTR为372bp,开放阅读框长度为525bp,编码174个氨基酸.在文蛤Clq(MmClq)蛋白中,Clq结构域与软体动物、两栖类动物和脊椎动物中的Clq结构域均具有较高的同源性.通过荧光实时定量PCR,MmClq mRNA在所检测的各个组织中均有表达,在肝胰脏中表达量最高.在细菌感染试验中,文蛤受鳗弧菌感染后,Clq相对表达水平有明显的上升调节,注射2h,MmClqmRNA表达量最高,为对照组的2.19倍.包含成熟肽的MmC1q cDNA片段被重组,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用牛津杯法对MmClq重组蛋白进行体外抑菌试验,但并未检测到明显的抑菌活性.     

半滑舌鳎颗粒酶B基因的克隆和表达分析

颗粒酶(granzyme, Gzm) B是免疫炎症反应必不可少的介质,可激活半胱天冬酶3,进而诱导靶细胞的凋亡。本研究通过PCR扩增和RACE技术获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)颗粒酶B基因(CsGzmBl)的全长cDNA序列,并对其序列特征和表达水平进行了分析。结果显示,CsGzmBl cDNA全长为923 bp,开放阅读框长度为780 bp,编码259个氨基酸(前19个氨基酸残基为信号肽序列),5′非编码区为49 bp,3′非编码区为94 bp。CsGzmBl的基因组结构比较保守,由5个外显子和4个内含子组成。CsGzmBl蛋白包含2个N端糖基化位点、1个催化三联体“His63Asp112Ser207”、1个“PHSRPYMA”结构域及6个保守的半胱氨酸。荧光定量PCR结果显示,CsGzmBl在半滑舌鳎健康成鱼不同组织中均有表达,其中,在脾脏中表达量最高,头肾、中肾、肝脏和鳃中表达量次之,在肌肉中表达量最低。与对照组0 h相比,CsGzmBl在哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)感染后的不同时间点的脾脏、肠、肝脏、皮肤、鳃和肾脏中的表达水平均有不同程度的上调。研究表明,CsGzmBl基因在半滑舌鳎抵御哈维氏弧菌感染过程中发挥重要作用。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) c-Jun基因的克隆及免疫应答分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AP-1家族转录因子c-Jun基因(Jun proto-oncogene)及其在免疫应答中的作用尚无报道.本研究根据半滑舌鳎转录组数据库中预测的c-Jun序列,通过RACE技术和PCR扩增方法获得了半滑舌鳎c-Jun基因cDNA全长2093 bp,CDS区域共981 bp,编码326个氨基酸,5'UTR区域377 bp,3'UTR区域735 bp.SMART分析显示,C-JUN蛋白具有2个结构域:AP-1家族典型结构域Jun,以及高度保守的亮氨酸拉链结构域(BRLZ).经蛋白多序列同源比对、系统进化树分析,发现半滑舌鳎c-Jun与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)c-Jun亲缘关系最近.实时荧光定量PCR分析显示,c-Jun基因在半滑舌鳎不同组织中普遍表达,在卵巢中表达量最高.鳗弧菌(Vibrio anguillarum)人工感染半滑舌鳎后,c-Jun基因在肝脏、脾脏、头肾、小肠、鳃、血液中表达量都出现不同程度上调,其中,鳃中变化最明显:感染12h后表达量达到0h时的13.20倍.使用LPS、PGN、PolyI:C和WGP病原模拟物刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞,结果显示,WGP诱导c-Jun基因上调表达,而LPS与PolyI:C均下调基因表达.以上实验结果表明,c-Jun基因在半滑舌鳎的免疫防御中发挥重要作用.     

草鱼C1qC基因的克隆及表达分析

为了研究C1qC基因在草鱼(Ctenopharyngodon idella)免疫过程中所起的作用,利用RT-PCR和RACE方法克隆获得了C1qC基因cDNA全长序列,经序列分析表明,所克隆的C1qC cDNA全长为916 bp,包括开放阅读框(open reading frame,ORF)735 bp,5′端非编码区(untranslated region,UTR)89 bp和3′端非编码区(UTR)92 bp。735 bp的ORF共编码244个氨基酸,相对分子量为26 162.5 U。同源性分析表明,草鱼与斑马鱼(Danio rerio)的相似度最高,达到71%。经草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)诱导后,草鱼C1qC基因在鳃、皮肤、肌肉、肝、中肾、心脏、头肾等组织中的mRNA表达水平均显著上调。在草鱼胚胎发育的各个阶段都能检测到C1qC mRNA的表达,说明该基因可能在草鱼胚胎和鱼苗的免疫反应和早期发育中起重要作用。本研究将为今后在草鱼免疫功能方面深入研究C1qC基因提供基础资料。     

草鱼ghrelin基因的分子克隆与组织分布及其摄食调控作用分析

ghrelin是一种在脊椎动物摄食调节过程中起重要作用的脑肠肽,具有明显的摄食促进作用。实验利用同源克隆技术获得了草鱼ghrelin基因的cDNA序列和DNA序列,其中cDNA序列全长506 bp,包括90 bp的5′端非编码区(5′-untranslated region,5′UTR),312 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),以及104 bp的3′端非编码区(3′-untranslated region,3′UTR)。开放阅读框编码的103个氨基酸的ghrelin前体肽,经剪切加工后形成含有19个氨基酸的成熟肽。氨基酸序列分析结果显示,草鱼ghrelin与硬骨鱼类ghrelin相似度最高,而与其他脊椎动物相似度较低,同时草鱼ghrelin成熟肽N端的"活性中心"(active core)为鲤科鱼类中常见的GTSF形式。与大多数硬骨鱼类的ghrelin基因结构相同,草鱼ghrelin基因也包括4个外显子和3个内含子。荧光定量PCR检测到ghrelin mRNA大量分布于草鱼的前肠和脾,脑、肾、肝、肌肉、皮和鳔等组织也有ghrelin mRNA分布。草鱼脑和肠中的ghrelin表达水平在摄食后下降,随着饥饿时间的延长表达水平逐步升高,最后维持在较高水平,表明ghrelin作为摄食启动信号对草鱼的摄食活动起到了促进作用。     

星斑川鲽MHCⅡ恒定链Ii基因的克隆和表达特性

为了研究星斑川鲽MHCⅡ类分子的作用及调控机制,实验通过SMART-RACE技术克隆得到了星斑川鲽MHCⅡ恒定链(MHCⅡIi)的全长cDNA序列,其长度为1766 bp,包含135 bp的5′非编码区、837 bp的开放阅读框和794 bp的3′非编码区。该基因共编码279个氨基酸。理论分子量为30.848 ku,等电点为6.89。与已知物种MHCⅡIi进行同源性比对,结果与狼鲈、紫红笛鲷和鳜关系较近,同源性均为79%。利用quantitative realtime PCR(qRT-PCR)技术检测了MHCⅡIi在星斑川鲽不同组织中的表达,以及爱德华氏菌感染前后对该基因在不同组织中表达水平的影响,结果显示:在脾脏、头肾、肝脏、后肠、性腺、心脏、血液、鳃和肌肉组织中,MHCⅡIi mRNA均有表达,但在表达量上有明显差异,脾脏和头肾组织相对表达水平较高,鳃、血液、肌肉、心脏和性腺中的表达水平较低。病原感染后,免疫相关组织脾脏和头肾的表达水平升高最明显,肝脏和后肠的表达水平也略有升高,但变化不明显。本研究可为星斑川鲽MHCⅡ类分子的作用机理提供理论依据,同时为海水养殖鱼类的抗病遗传育种工作提供研究基础。