产低温碱性蛋白酶黄海黄杆菌YS-9412-130高产菌株的选育

以黄海黄杆菌YS－9412－130菌株为出发株，经亚硝基胍、硫酸二乙酯、紫外线（UV）与微波（MI）复合诱变和自然选育，获得1株产低温碱性蛋白酶高产稳定的突变株YS－9412－130－SW1－104，其产低温碱性蛋白酶为出发株的16倍。在摇瓶发酵培养条件下，酶活力达2320U／ml(20℃测定），该诱变株具有Ref^r、Str^r、Amp^r和Met^-、Lys^-标记。突变株与出发菌株在细胞形态上比较，结果表明二者没有显著差异。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶发酵过程动力学研究

应用自动控制发酵设备，对黄海黄杆菌YS－9412－130碱性蛋白酶发酵动力学和工艺条件进行了研究。从基本的动力学概念和方程出发，通过分批发酵试验摸索了黄海黄杆菌YS－9412－130生长与代谢的基本规律，证明了发酵过程中低温碱性蛋白酶的形成为生长部分关联型。采用补料分批培养方法限制生长基质浓度，确定其一系列数值，从而推导出细胞生长与产物合成的动力学数学模型。     

黄海黄杆菌YS-9412-130产酶发酵条件的优化

以产低温碱性蛋白酶的黄海黄杆菌YS－9412－130突变株SW2－104为培养菌株，进行碳源、氮源、无机盐、起始pH值、培养时间、接种量和接种龄等发酵条件的优化实验。实验结果证明，在以1％葡萄糖为碳源，以3.5％豆饼粉为氮源，无机盐：0.4%Na2HPO4、0.03%KH2PO4、0.02%MgSO4、0.1%Na2CO3、0.2?Cl2，起始pH值7.0，接种12h种龄的种子4％，20℃、250r/min的条件下在旋转摇床中培养36h，菌株产酶活性最高。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的基因克隆和序列测定

黄海黄杆菌YS－9412－130具有稳定的分泌低温碱性蛋白酶的能力。将其染色体DNA用Sau3AⅠ部分酶切后，低熔点琼脂糖回收2－10Kb的DNA片段，用Klenow大片段酶半补齐，与用SalⅠ酶切且半补齐的质粒pUC19连续后，转化E.Coli.JM109，构建基因文库。且酪蛋白平板法和酶联免疫吸附（ELISA）的活性筛选方法从基因文库中筛选到一株产海洋低温碱性酶的阳性克隆（命名为pHH1）。序列测定分析表明，此重组质粒包含有长度为768bp低温碱性蛋白酶基因的完整的开放读码框架（ORF）和上游基因调控序列。此片段编码由256个氨基酸组成的酶，计算分子量为83000Dal。通过Southern杂交证实了此片段来自于黄海黄杆菌YS－9412－130基因组DNA。     

一株产低温碱性蛋白酶嗜冷海洋细菌YS-9412-130的分离和培养条件研究

自海水贝类中取样，经分离培养基和酪蛋白培养基复合培养，用检测蛋白酶产生水解圈和Folin-酚碱性蛋白酶活性测定相结合的方法从1000多份样品中初步筛到了产碱性蛋白酶活力高、性能优良的菌株YS－9412－130。对其初步研究结果表明，该菌只能利用有机氮源生长；在接近自然海水盐度、温度20℃、pH在7.0-9.0条件下，菌体生长和产酶较好。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶活性必需基团分析

用化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱变化研究黄海黄杆菌YS－9412－130分泌的海洋低温蛋白酶的功能基团性质，结果表明，羟基、咪唑基、ε－氨基及胍基均与酶活性有关，而羟基、巯基与酶活性无关。酶的性质与丝氨酸蛋白酶有很大的相似性。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶性质鉴定

对黄海黄杆菌YS-9412-130菌株产低温碱性蛋白酶的理化性质研究表明，该酶由256个氨基酸组成，分子量为33000Dar，等电点pI为9.45，米氏常数Km为5×10-3mmol/L；酶的最适作用pH范围为9.5～10.5，最适作用温度30℃，具有一定的抗氧化稳定性。Ca2+、Mn2对酶有激活作用，而Hg2+、Ag+对酶有抑制作用。DFP、NBS严重抑制酶的活性,而同时该酶也能被EDTA抑制。结果表明该低温碱性蛋白酶为一新型的丝氨酸蛋白酶。     

海洋低温蛋白酶生产菌YS-9412-130原生质体的制备与再生

以海洋低温蛋白酶生产菌株YS-9412-130为研究对象，从传代、菌龄、溶菌酶浓度与酶解时间、甘氨酸与EDTA预处理以及稳定剂对该菌原生质体形成与再生的影响进行研究。结果表明，在相同条件下，第一代菌至第五代菌原生质体的形成率分别为86．9％、70．3％、66．8％、63．4％、60．2％，再生率分别为10．5％、18．6％、17．9％、18．2％、17．8％；取该菌对数生长前期、对数生长中后期、稳定期部分菌液制备原生质体，原生质体的形成率分别为72．1％、70．4％、60．5％，再生率为13．4％、18．9％、10．4％；溶菌酶浓度为2．5mg／mL、5mg／mL、10mg／mL、20mg／mL，酶解60min，原生质体的形成率分别为40．6％、70．8％、81．8％、95．6％，原生质体的再生率为19．0％、19．2％、19．0％、10．6％；使用10mg／mL溶菌酶酶解YS-9412-130菌30min、60min、90min、120min，原生质体的形成率分别为30．8％、81．3％、81．7％、82．9％，原生质体的再生率分别为19．2％、19．3％、16．9％、11．2％；在细菌培养液中添加终质量浓度为5mg／mL、10mg／mL、20mg／mL和40mg／mL的甘氨酸，培养该菌16h后制备原生质体，原生质体的形成率分别为81．0％、81．1％、90．3％、90．8％、90．6％，再生率为19．1％、19．0％、19．3％、12．0％、9．0％；EDTA对原生质体的形成稍有促进作用，但作用超过30min会影响原生质体的再生；分别以0．6mol／L Kcl、0．3mol／L KCl＋0．3mol／L蔗糖、0．6mol／L蔗糖作为稳定剂，原生质体的再生率分别为10．9％、19．6％、25．9％。结论认为，YS-9412-130原生质体制备的最佳条件为选用第2代YS-9412-130菌，在培养基中添加终质度浓度为10mg／mL的甘氨酸培养16h后，再将菌体置于含有0．05mol／LEDTA的高渗溶液中30℃预处理30min，用10mg／mL溶菌酶，30℃酶解60min，再用0．6mol／L蔗糖作为原生质体再生培养稳定剂，比较适合于YS-9412-130原生质体的制备与再生。这一试验结果将为通过原生质体技术对YS-9412-130菌进行遗传改良提供重要参数。     

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的制备工艺研究

对黄海黄杆菌所产低温碱性蛋白酶的工业生产技术和电泳纯级试剂酶的分离纯化工艺进行了实验。按照设计的中试生产技术，每吨发酵液可得酶粉20kg，粗酶比活大于20×10     

产虾青素海洋酵母菌YS-185原生质体制备与紫外诱变

对海洋酵母菌YS-185原生质体制备、再生条件及紫外诱变育种进行了研究。结果显示,对数生长中后期菌龄较易形成原生质体,用EDTA和β-巯基乙醇混合溶液预处理15min有更高的原生质形成率,原生质体形成及再生率最佳条件为:0.5%蜗牛酶,35℃、酶解60min,对原生质体紫外线辐射60s诱变出YS-185-19突变株,其色素产量较出发菌株提高了93.4%。     

黄杆菌属中的一个新种

由海产贝类中分离到一菌株YS-9412-130，为革兰氏阴性短杆菌、末端圆、有鞭毛、不能滑行运动、大小为0.4～0.7μm×1.0～1.5μm，裂殖生殖，不生成芽孢，胞内无多-β-羟基丁酸颗粒。菌落光滑，黄色、半透明，边缘完整。其色素无荧光，含类胡萝卜素，其正己烷提取液经光谱测定最大吸收峰为450nm。该菌生长的温度范围为0～25℃，最适为18～22℃，最高25℃(在25℃生长极弱或几乎不生长)。此菌株于pH7.0～9.0能生长，最适pH为7.5，耐6％NaCl，80μg／m1的链霉素或80μg/ml的氨卞青霉素。YS-9412-130菌株为好气菌，严格的有氧呼吸代谢,过氧化氢酶、氧化酶阳性和磷酸酶阳性,利用多种糖、水解淀粉但不分解纤维素、琼脂和几丁质。水解干酪素、胨化石蕊牛奶最后变碱。液化明胶试验阴性，还原硝酸盐；不产H2S和吲哚；MR和V．P．试验阴性；YS-9412-130菌株DNA中G+C含量为32.2mol％。该菌株的特征符合黄杆菌属的特征，但与此属中的其他种比较又有显著的差别，因此将其定为黄杆菌属一新种，命名为黄海黄杆菌（Flavobacteriumyellowseasp.nov）。     

黄海黄杆菌YS-9412-130固定化细胞产酶技术

3种不同的包埋材料固定化YS－9412－130菌体细胞，进行半连续发酵。结果表明，用2.5%卡拉胶固定化细胞，产酶效率最高；添加明胶对产酶不利而添加豆饼粉与玉米粉后，酶活力有显著提高；卡拉胶固定化细胞发酵液中游离菌体浓度随发酵时间变化略有上升，总体水平较低。发酵液酶活随菌体浓度的增大而呈上升趋势；固定化细胞半连续发酵效率远高于游离细胞分批发酵的效率。     

紫外诱变原生质体选育溶菌酶高产菌株的研究

以1株产海洋溶菌酶活性较高的菌株（S_12-86）为原始菌株，对其原生质体的制备、再生及紫外诱变育种进行了研究。实验所确定的原生质体的最佳制备条件为：菌株S-12—86培养18h，溶菌酶浓度为1．0mg／ml，在35℃下，酶解30min，原生质体形成率为97．6％，再生率为23．6％。同时实验所确定的原生质体诱变的适宜条件为：30w紫外灯下80cm照射120S。对大量再生突变株进行筛选，最终获得了1株遗传性能稳定的菌株R—J—i01，其产酶活力达到1808U／mg，比原始菌株（1290U／mg）提高了40％。     

Transmission of protease genes into a protease-deficient mutant of Aeromonas salmonicida in river sediments

Abstract. The transformation of Aeromonas salmonicida with DNA fragments from bacterial cell-free sonicates was investigated with intraspecific, interspecific band intergeneric fish pathogenic bacteria including Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Pseiidomonas fluorescens and Vibrio anguillarum strains as donor bacteria. A phenotypic marker for transformation was extracellular protease production since a protease-deficient mutant NTG-1 induced from pathogenic A. salmonicida strain A-7301 by mutagenesis was used as a recipient. This mutant was non-pathogenic to rainbow trout. The mutant was incubated with each sonicate at 20°C for 20 days with a nutrient-poor medium containing a trace (5 μg/ml each) of both humic acid and tryptone in the presence of clean river sand (100 g/100 ml medium) corresponding with an environment of rivers. During the incubation, the survival of mutant NTG-1 cells was observed and protease positive NTG-1 cells were isolated from each culture. The protease production of the isolates was due to the transmission of protease genes of the donor strains. The activity of proteases produced by the transformants extra-cellularly was determined. These transformants induced with the sonicates of the parent strain, intraspecific strain and with the sonicates of the interspecific A. hydrophila strain were pathogenic to rainbow trout, whereas the transformants derived with the sonicates of the intergeneric strains P. fluorescens and V. anguiUarum showed non-pathogenicity, although all the donor strains, with the exception of the P. fluorescens strain, were pathogenic. These findings are interesting since they demonstrate that trausformation in A. salmonicida occurs with considerable ease even intergenencally and interspecifically, as well as intraspecifically in river environments, and that there is a large difference in the lethal toxicity of extracellular protease produced by these bacteria.