斑节对虾溶菌酶基因的原核表达与产物活性检测

采用PCR方法对所克隆的斑节对虾溶菌酶基因的cDNA进行改造，并克隆至含温控启动子PRPL的大肠杆菌表达质粒pBV220，构建斑节对虾溶菌酶表达载体pBV220-lyz。该质粒转化大肠杆菌后经42℃诱导表达。SDS-PAGE电泳表明，表达产物中有16kD左右的特异性条带，与预期斑节对虾溶菌酶分子量相符。薄层扫描显示，重组斑节对虾溶菌酶约占全菌总蛋白的32％，纯化后的重组斑节对虾溶菌酶占全菌可溶性蛋白的90％左右。比浊法检测复性后产物的生物活性，结果表明重组斑节对虾溶菌酶的最适pH为6．0，最适温度为40℃。测定了重组斑节对虾溶菌酶对溶壁微球菌和几种鱼病原菌菌株的溶菌活力，结果表明，重组斑节对虾溶菌酶对溶壁微球菌、溶藻弧菌和鳗弧菌有较强的溶菌活力，对爱德华氏菌有一定的溶菌活力，对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和大肠杆菌DHSa溶菌活力较弱。     

6株鱼源嗜水气单胞菌的分子鉴定与毒力基因分析检测

为了分子鉴定6株鱼源嗜水气单胞菌,并从分子层面验证通过检测毒力基因以推测嗜水气单胞菌潜在致病性的可行性。实验采用PCR扩增16 S rDNA和gyrB基因并结合系统发育树的构建和分析进行菌种的分子鉴定,检测气溶素（ aerolysin, aer）、溶血素（ haemoly-sin, hly）、丝氨酸蛋白酶（ serine protease, ahp）、热稳定细胞肠毒素（ heat-stable cytotonic enterotoxin, ast）和热敏感细胞肠毒素（ heat-labile cytotonic enterotoxin, alt）5种毒力基因,且使用Mega 5．2对核苷酸和氨基酸序列进行分析。结果显示6株菌均为嗜水气单胞菌Aero-monas hydrophila,检测出5种毒力基因中的至少4种,其中均检测出溶血素和2种肠毒素,序列分析表明气溶素、溶血素和丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列高度保守。本研究基于16 S rD-NA和gyrB基因可以准确地对嗜水气单胞菌进行分子鉴定,6株菌的毒力基因丰富预示着一定的致病性, aer、 hly和ahp基因相对保守,编码的毒力因子高度同源,在临床分子诊断中建议使用aer、 ahp和hly基因对嗜水气单胞菌的潜在致病性进行检测。     

鳜嗜水气单胞菌GYK1株胞外产物提取、纯化及生物学活性分析

以鳜分离的嗜水气单胞菌GYK1株为代表,采用玻璃纸覆盖技术提取了8株嗜水气单胞菌和1株温和气单胞菌的胞外产物,SDS-PAGE电泳分析显示,8株嗜水气单胞菌的胞外产物均有35kDa的共同蛋白带。酶活性和溶血性分析表明,GYK1株胞外产物具有酪蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、明胶酶活性,但不具备脲酶活性;溶血性较强,蛋白浓度为365μg·mL-1的胞外产物对鳜血细胞的溶血价为213,对加州鲈、银鲫、小白鼠、兔、绵羊、人O型血的红细胞的溶血价在211~214之间。应用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱层析,对GYK1株的胞外产物进行了初步纯化,得到分子量为35kDa的蛋白带,该纯化产物具溶血性,但溶血性比粗胞外产物降低,对鳜和小鼠血细胞的溶血价均为25。     

嗜水气单胞菌UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶基因的克隆表达及酶的性质

通过水生动物源性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）强毒株J-1株与弱毒株MR-1株抑制差减杂交得到gneJ差减片段，该片段与创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和人源嗜水气单胞菌的UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶基因有较高的同源性。扩增完整的gneJ基因，进行分布检测并将其克隆至质粒pET32a（＋），在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中进行异源表达，SDS-PAGE结果显示，重组表达蛋白的分子量约59．7kD，与理论推测值基本相同。酶活性分析表明，该重组蛋白可将UDP-乙酰葡萄糖胺转化为UDP-乙酰半乳糖胺，确证gneJ基因编码蛋白为UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶。Western Blot分析显示，嗜水气单胞菌J-1株胞外产物的兔抗血清可识别该重组蛋白，表明该蛋白与天然蛋白有相同的抗原性。以重组蛋白为免疫原，对小鼠进行动物保护实验，结果显示，该重组蛋白对小鼠有60％的保护率，证明UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶可作为亚单位疫苗的侯选成分。     

流水式养殖动物中弧菌和嗜水气单胞菌的PCR法监测

为了解流水式养殖场养殖动物中弧菌和气单胞菌的感染状况,分别针对霍乱孤菌肠毒素A亚单位(ctxA)基因、0139和01群群特异基因、毒力协同调节菌毛A亚单位基因(tcpA)、中心调节蛋白基因(toxR)、副溶血弧菌不耐热溶血素基因(tlh)、创伤弧菌Vibrio vulnificus溶细胞素基因(vvhA)和嗜水气单胞菌的气溶素基因(aerA)设计引物,建立了聚合酶链式反应(PCR)检测技术,PCR产物经电泳,根据扩增条带的大小和数目,检测和区分霍乱孤菌、嗜水气单胞菌和副溶血孤菌.对南昌沿岸霍乱流行水域及附近养殖场的养殖动物进行了18个月的连续监测,对1 440份水产品的增菌液进行PCR检测,17份检出副溶血弧菌,25份检出霍乱弧菌,创伤弧菌和嗜水气单胞菌均未检出.扩增结果与传统培养检测法的结果一致.监测结果表明,南昌附近地区霍乱弧菌和副溶血弧菌检出率分别为1.74%和1.18%,总体感染状况处于较低水平,但个别养殖品种弧菌检出率较高.     

嗜水气单胞菌J-1株丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，设计和合成了一对引物，以嗜水气单胞菌AhJ—1的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到质粒载体pGEM—T中进行测序和分析，结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％，扩增片段编码343个氨基酸，推测的分子量为35700，计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为核酸疫苗的侯选基因片段。     

27株嗜水气单胞菌致病性及ERIC—PCR指纹图谱分析

从福建省淡水养殖鱼类体内分离到27株嗜水气单胞菌,根据嗜水气单胞菌16SrDNA基因和气溶素基因（aerolysin）的保守序列,设计2对引物,对所分离到的27株嗜水气单胞菌进行双重PCR扩增,扩增结果表明,其中18株为含有Aer毒力基因的潜在致病性嗜水气单胞菌,占总菌数的66．67％。应用ERIC-PCR分型技术对27株嗜水气单胞菌菌株进行分析,以相似度54．00％为限,所有菌株可分为Ⅰ和Ⅱ两大聚类,以76．00％相似度为界,27株嗜水气单胞菌可分为11个聚类,同一个聚类中菌株分离区域基本相同。分析结果表明,分离的嗜水气单胞菌基因型的多样性和分离地域具有一定的关联,也表明ERIC-PCR可以有效应用于嗜水气单胞茵分子流行病学调查。     

嗜水气单胞菌温敏胞外蛋白酶基因eprJ的克隆与检测

根据已发表的人源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)温敏胞外蛋白酶基因eprA1的核甘酸序列,设计合成一对引物,以嗜水气单胞菌鱼源株Ah J-1基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到1 005 bp的胞外蛋白酶基因eprJ1,将该基因片段连接到pMD18-T载体中,构建克隆载体pMD-eprJ1。序列分析发现,其与发表的Ah AH1的胞外蛋白酶eprA1基因的同源性有91%。根据测序结果在保守区重新设计一对引物以增强特异性,扩增片段大小为387 bp。对1990~2004年15年间从浙江、福建、湖北及江苏等地不同患病水产动物肝肾等脏器分离到的23株Ah检测结果显示,从中国东南地区分离的21株Ah水生动物致病性菌株扩增均为阳性,2株Ah非致病性菌株为阴性,推测该基因普遍存在于致病性Ah中。检测模板DNA的灵敏度可达1.5×10-3ng/μL。     

嗜水气单胞菌血毒素对草鱼血细胞的溶血作用

通过嗜水气单胞菌菌体和菌液上清对草鱼的体外溶血试验，发现菌细胞在培养１２ｈｒ后即具最高溶血活性，而菌液上清在菌培养６０ｈｒ后才达到最高溶血活性；在ｐＨ～８范围内嗜水气单胞菌溶血素可维持高溶血活性，而维持高溶血活性的最适培养温度为３５℃；部分糖和二价金属类可在不同程度上影响菌液上清的溶血活性。     

嗜水气单胞菌溶血毒素对草鱼血细胞的溶血作用

通过嗜水气单胞菌菌体和菌液上清对草鱼的体外溶血试验，发现菌细胞在培养 12hr后即具最高溶血活性，而菌液上清在菌培养 60hr后才达到最高溶血活性；在 pH6～ 8范围内嗜水气单胞菌溶血素可维持高溶血活性，而维持高溶血活性的最适培养温度为 35℃；部分糖和二价金属盐类可在不同程度上影响菌液上清的溶血活性。     

气单胞菌基因研究

气单胞菌在一定条件下能引进养殖鱼类的大批死亡，从基因水平认识该菌对研究该菌的致病条件及防治该菌引起的各种病症等都大有帮助。自８０年代中期开始，人们陆续对嗜水气单胞菌及其它气单胞菌的气溶素基因、溶血毒素基因和蛋白酶等基因进行了研究。本文从气单胞菌溶血毒素基因及分布、毒素的调控与分泌和蛋白酶基因等方面简要综述了近年来对气单胞菌基因的研究。     

林蛙红腿病病原菌基因的克隆及序列分析

在长白山地区某林蛙养殖场送检的红腿病病例中分离病原体,鉴定为嗜水气单胞菌,根据已发表的嗜水气单胞菌(溶血素基因AF443388)序列设计了一对特异性引物,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出一条约952 bp的基因片段,将该基因克隆到pMD-18T载体上,通过核苷酸序列测定,结果表明此序列与已发表的其他AH溶血素基因序列具有很高的同源性.为进一步对该病的分子流行病学调查,以及准确诊断和治疗提供依据.     

黄芩对7种水产动物病原菌的体外抑菌活性研究

采用纸片扩散法和二倍稀释法,利用黄芩水提液对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、温和气单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌进行最低抑菌质量浓度和最低杀菌浓度的测定。试验结果表明,黄芩对鳗弧菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑菌效果,最低抑菌质量浓度均为15.63 mg/ml,最低杀菌质量浓度分别为31.25、15.63、31.25、31.25 mg/ml;黄芩对大肠杆菌、温和气单胞菌和哈维氏弧菌的抑菌效果弱于副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌,最低抑菌质量浓度分别为31.25、62.51、31.25 mg/ml,最低杀菌质量浓度分别为62.5、62.5、125 mg/ml。     

异育银鲫源嗜水气单胞菌对磺胺类耐药性分析

为了解异育银鲫源嗜水气单胞菌对磺胺类药物的敏感性和磺胺类耐药基因的携带情况。采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法测定了36株受试菌株对常见4种磺胺类药物的敏感性;应用PCR法检测菌株染色体DNA和质粒DNA磺胺类Sul1、Sul2和Sul3耐药基因。试验结果表明,试验菌株对磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺异噁唑、磺胺甲噁唑的耐药率分别为83.34%、72.22%、66.66%、69.45%;36株嗜水气单胞菌的染色体和质粒中均检测到Sul1和Sul2基因,Sul1基因在染色体和质粒中的检出率分别为30.56%和25.64%,Sul2基因在染色体和质粒中的检出率分别为83.33%和91.67%,Sul3基因在染色体和质粒中均未检出。异育银鲫源嗜水气单胞菌对磺胺类药物的耐药性不容乐观,其耐药性与Sul2和Sul1基因有较大相关性。     

苏州市患病水生动物体内细菌的分离鉴定及药敏试验

为了解苏州市不同地区患病水生动物组织中感染细菌的种类及其耐药性,于2014年6～10月从不同地区采集的患病鱼、虾、蟹和中华鳖组织中共分离到14株细菌,通过16S rRNA基因分析对细菌进行了鉴定,并调查了他们对链霉素、恩诺沙星、强力霉素、庆大霉素硫酸盐和甲砜霉素等5种抗生素的抗性及最低抑菌浓度。结果显示:从不同地区水生动物分离到的同种细菌对同种抗生素的抗性有明显差异,其中,分离到的嗜水气单胞菌及摩根氏菌有多重耐药性;对14株细菌进行质粒抽提和琼脂糖凝胶电泳分析,发现8株细菌中存在分子量不同的质粒,且不同地区来源的同种细菌所含有的质粒的分子量不同,耐药性较强的嗜水气单胞菌和摩根氏菌均含有质粒;嗜水气单胞菌质粒的序列测定结果显示,该质粒与其抗药性无关;转化实验结果显示,从摩根氏菌分离的1.8 kb质粒与氨苄青霉素抗药性有关。     

鱼源嗜水气单胞菌质粒的指纹图谱及其与耐药性的关系

为了解国内各地嗜水气单胞菌的耐药性、质粒指纹图谱及质粒大小与其耐药性之间的关系,分离、收集了40株不同时期来源于国内各地的鱼源嗜水气单胞菌,通过KB纸片法检测对29种抗生素的耐药性,碱裂解法小量提取质粒后,采用限制性内切酶EcoRⅠ及HindⅢ对质粒DNA进行酶切并对质粒菌株采用溴化乙锭消除处理,通过琼脂糖凝胶电泳获得质粒指纹图谱,研究质粒与耐药性的关系。试验结果显示,嗜水气单胞菌耐药情况严重,且多重耐药普遍;40株嗜水气单胞菌的质粒检出率为37.5%;质粒指纹图谱与耐药相关性分析表明,嗜水气单胞菌的耐药性与所携带质粒的数量和大小无直接关系,来源相同、耐药类型相似的菌株质粒图谱及酶切质粒图谱相似;质粒消除试验发现质粒消除率为100%,但都只能消除部分质粒;其中12株菌部分耐药表型消失,提示质粒和染色体分别编码耐药基因,2.01 kb的质粒与该菌对萘啶酸、万古霉素的耐药性有关。     

致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。     

LC-MS/MS检测水产品源致病菌和腐败菌群体感应AHLs信号分子

为分析水产品源致病菌和腐败菌中群体感应信号分子AHLs的含量和种类,实验建立液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)同时检测细菌群体感应11种AHLs类信号分子的技术,并与生物报告菌法比较。结果显示,报告菌紫色杆菌CV026和根癌农杆菌A136检测发现嗜水气单胞菌和2株铜绿假单胞菌是AHLs产生菌。建立的LC-MS/MS能完全分离和检测11种AHLs,并发现假单胞菌和嗜水气单胞菌产生的AHLs信号分子含量较高,其中ATCC 9027和ATCC 15692产生3-oxo-C12-HSL,嗜水气单胞菌A2产生C4-HSL,而腐败希瓦氏菌XH4分泌的C4-HSL信号分子含量较低,沙门氏菌ATCC 14028-3、大肠杆菌O157:H7和3种弧菌的AHLs很低。随着细菌浓度的增加,铜绿假单胞菌ATCC 9027产生的AHLs含量逐步增加,在12 h达到最高。研究表明,LC-MS/MS可用于多种AHLs信号分子的定性和定量检测,具有灵敏性与准确性更高的优点。在11株水产品源致病菌和腐败菌中,假单胞菌和气单胞菌分泌的AHLs含量最高。     

肉桂醛纳米乳的制备及其抑菌效果研究

为评价肉桂醛纳米乳对水产动物致病菌的抑菌效果,以吐温-80为表面活性剂、乙醇为助表面活性剂、乙酸乙酯为油相,加蒸馏水按比例配制成空白纳米乳,加入肉桂醛制备得肉桂醛纳米乳,并评价了肉桂醛纳米乳的部分特性;探究肉桂醛纳米乳对迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、鳗败血假单胞菌(Pseudomonas anguilliseptica)4种常见水产动物致病菌的抑菌效果。结果显示,肉桂醛纳米乳中吐温-80、乙醇、乙酸乙酯、蒸馏水和肉桂醛质量比为10∶5∶11∶73∶1,空白纳米乳对肉桂醛的最大载药量为20.11 mg/m L,肉桂醛纳米乳为水包油型淡黄色澄清透明液体,粒径5~20 nm,平均粒径10.74 nm;与同浓度肉桂醛溶液相比,肉桂醛纳米乳具有更强的抑菌活性,在最大载药量时,对嗜水气单胞菌、鳗败血假单胞菌、迟缓爱德华氏菌、温和气单胞菌的抑菌强度分别提高了65.56%、46.99%、41.94%、26.91%。肉桂醛纳米乳对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、鳗败血假单胞菌、迟缓爱德华氏菌的最小抑菌浓度(MIC)分别0.31、0.51、0.72、1.00 mg/m L。研究表明,肉桂醛纳米乳在水产养殖中具有潜在的应用价值。