乌鳢和斑鳢EST序列微卫星信息分析

乌鳢(Channa argus,♂)、斑鳢(Channa maculatus,♀)是杂交鳢"杭鳢1号"的亲本。利用高通量测序技术对乌鳢和斑鳢的肝脏进行转录组测序获得大量EST序列后,利用MISA软件进行微卫星信息分析,结果表明,通过转录组测序获得乌鳢EST序列59 959条,长度45 mb,发现15 428个SSR,出现频率为25.73%;获得斑鳢EST序列44 337条,长度27 mb,发现8 439个SSR,出现频率为19.03%。在乌鳢和斑鳢EST-SSR中,重复单元以1~2碱基重复为最多,并以长度小于16 bp的短重复序列为主,间隔SSR和复合SSR的EST序列RPKM均值要低于单纯型SSR的EST序列RPKM均值,且在单纯型SSR中SSR长度越长,其RPKM均值则越低。     

玻璃缺鳍鲶线粒体全基因组序列测定与分析

本文采用参照近缘物种线粒体基因组设计覆盖全基因组引物的方法构建并获得玻璃缺鳍鲶Kryptopterus vitreolus线粒体基因组全序列,分析其全序列特征和结构,为鲇形目鱼类的系统进化研究提供基础数据。结果表明,玻璃缺鳍鲶线粒体基因组全长16 662bp,碱基组成具有高AT含量的偏向性,结构组成和排列顺序和其他硬骨鱼基本一致,包括13个蛋白质编码基因、22个t RNA、2个r RNA和1个D-loop区。全基因组中除COX1以GTG为起始密码子外,其余12个编码蛋白的基因都以ATG开头。7个编码蛋白基因(ND1、Cox1、ATP8、ATP6、ND4L、ND5和ND6)以TAA终止,其余6个编码蛋白的基因没有完整的终止密码子。对玻璃缺鳍鲶线粒体基因组D-loop区的终止序列区、中央保守区和保守序列区的结构分析,识别5个保守序列(CSB-1、CSB-2、CSB-3、CSB-D和CSB-E)和一个潜在的终止序列E-TAS。利用玻璃缺鳍鲶分别与其他4种鱼的线粒体基因组全序列及13个编码蛋白基因的核苷酸序列进行比对分析。结果表明,玻璃缺鳍鲶与南方鲇Silurus meridionalis同源性最高,5种鱼线粒体基因组中COX1基因相对最保守,相似度为78.98%~92.78%。基于5个科12种鱼与2个外群物种的线粒体控制区(D-loop区)的核酸序列构建的系统进化树表明:玻璃缺鳍鲶独自一支且与鲇Silurus asotus和南方鲇亲缘关系最近。     

皮氏蛾螺和水泡蛾螺线粒体基因组及核糖体ITS2的比较研究

利用PCR技术分别扩增皮氏蛾螺和水泡蛾螺的线粒体全基因组以及核糖体第二转录间隔区ITS2,对所得序列进行了分析。结果表明,皮氏蛾螺和水泡蛾螺的线粒体基因组全序列长度分别为15 255bp、15 265bp,具有相似的碱基组成和AT含量,其基因排列顺序完全一致,蛋白质编码基因长度相同,两种螺的ITS2分别为340bp和329bp,一致性达83.6%。经比对发现,皮氏蛾螺和水泡蛾螺的线粒体基因组及ITS2序列与已知的新腹足目动物相似。利用线粒体全基因组和核糖体序列构建系统发育树,两种序列的分析均显示皮氏蛾螺和水泡蛾螺亲缘关系较近。     

猪差异表达EST的组织表达谱分析

表达序列标签是一种快捷、高效的揭示基因组信息的方法。本研究以蓝塘猪与大白猪差异表达的5条EST在各组织中的表达情况为目的,采用大白猪、蓝塘猪为实验材料,从成年种猪的10个组织中提取总RNA,运用RT-PCR方法分析,结果显示5条EST在猪的多数组织中均有表达;同源性比对后发现,在5条差异显示cDNA中,EST1、EST2与已知序列无同源性;电子表达谱分析表明EST1、EST2、EST4及EST5在骨骼肌、肝脏组织中有表达。这为进一步研究该EST的功能奠定基础。     

斑点叉尾鮰趋化因子SCYA126基因及其可变剪接

通过探针杂交筛选斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）BAC基因组文库，利用引物步移的方法对阳性克隆BAC047_K12进行序列测定，得到2815bp的SCYA126基因组序列。序列分析表明，SCYA126基因由2个外显子和1个内含子组成；外显子拼接的序列与SCYA126 cDNA序列完全一致，编码92个氨基酸，在N端含有2个相邻的半胱氨酸（CC）和2个不相邻的半胱氨酸，为典型的CC趋化因子亚家族成员；其上游调控序列包含TATA框启动子序列和一些与免疫相关的转录因子结合位点。另外，根据与GenBank接收号为BM029630的EST序列的比较分析，发现SCYA126基因组中的内含子没有被剪接，导致翻译后可能产生N端部分缺失的SCYA126蛋白。在胰脏和肝脏中确认了高表达的包含内含子的mRNA的存在，而且其表达量要明显高于正常剪接的SCYA126mRNA。     

草鱼的两种新型免疫球蛋白基因IgZ-2和IgM-IgZ

在草鱼中新发现的两种免疫球蛋白重链的cDNA和基因组序列,其中的一种IgZ命名为IgZ-2,以区别于已报道的IgZ,另一种只有两个恒定区,一个恒定区与IgM相似而另一个与IgZ相似,这一特征与已报道的鲤的IgM-IgZ相似,故同样称为IgM-IgZ。分泌型IgZ-2的cDNA序列包含1889bp,编码539个氨基酸,其3'编码区包含267bp,但缺乏5'非编码区及部分可变区序列。分泌型IgM-IgZ的cDNA全长为1316bp,编码361个氨基酸,其5'非编码区包含3bp,3'非编码区包含227bp。膜结合型IgM-IgZ由两个膜外显子与CH2中的一个剪切位点剪切而成。氨基酸序列比对结果显示IgZ-2和IgM-IgZ的恒定区存在保守的半胱氨酸。系统进化树分析显示,草鱼IgZ-2以较高的支持率与斑马鱼IgZ聚为一枝,再与草鱼IgZ、草鱼IgM-IgZ和鲤IgM-IgZ这一枝聚为一类。用半定量RT-PCR检测IgZ-2和IgM-IgZ在4条草鱼的器官/组织中的表达,发现分泌型IgZ-2、分泌型IgM-IgZ和膜结合型IgM-IgZ在4条鱼中的表达存在个体差异,但主要都在免疫器官中表达。     

斑点叉尾趋化因子SCYA126基因及其可变剪接

通过探针杂交筛选斑点叉尾(Ictalurus punctatus)BAC基因组文库,利用引物步移的方法对阳性克隆BAC047 K12进行序列测定,得到2 815 bp的SCYA126基因组序列。序列分析表明,SCYA126基因由2个外显子和1个内含子组成;外显子拼接的序列与SCYA126cDNA序列完全一致,编码92个氨基酸,在N端含有2个相邻的半胱氨酸(CC)和2个不相邻的半胱氨酸,为典型的CC趋化因子亚家族成员;其上游调控序列包含TATA框启动子序列和一些与免疫相关的转录因子结合位点。另外,根据与GenBank接收号为BM029630的EST序列的比较分析,发现SCYA126基因组中的内含子没有被剪接,导致翻译后可能产生N端部分缺失的SCYA126蛋白。在胰脏和肝脏中确认了高表达的包含内含子的mRNA的存在,而且其表达量要明显高于正常剪接的SCYA126mRNA。[中国水产科学,2007,14(1):1-7]     

鲂属鱼类线粒体基因组的比较及其系统发育分析

基于GenBank中团头鲂线粒体基因组全序列和三角鲂、厚颌鲂、广东鲂的部分线粒体基因组序列,设计引物扩增出三角鲂、厚颌鲂和广东鲂3种鱼线粒体基因组全序列,同时对4种鲂属鱼类线粒体基因组全序列进行了比较分析。结果表明,4种鲂属鱼类线粒体基因组基因排列顺序完全相同,排列紧密,均包含13个蛋白质编码基因、22个tRNA、2个rRNA、1个非编码控制区(D-loop区)和1个轻链复制起始区(OL区)。除ND6和8个tRNA在L链上编码外,其余的基因均在H链上编码。4种鲂属线粒体基因组13个蛋白质编码基因中,均呈现出较强的A+T偏向性和C碱基偏好。全序列比对结果显示,共有758个变异位点,其中非简约性信息位点有691个,占总变异位点的91.16%,简约性信息位点有67个,仅占总变异位点的8.84%。22个tRNA基因中只有11个存在种间变异,共23个变异位点,主要发生在tRNA三叶草结构的TΨC和DHU臂环上。13个蛋白质编码基因中共检测出626个变异位点,这些变异主要发生在密码子第三位,占总变异位点的82.59%,其中变异位点数最多的是Cyt b基因,达84个,其次是ND 4基因(83个)。因此,Cyt b和ND4基因可作为备选的分子标记,用于鲂属群体间的遗传学研究。基于4种鲂属鱼类线粒体基因组全序列构建的ML树和BI树均显示,三角鲂与厚颌鲂的亲缘关系最近,团头鲂与它们的亲缘关系相对较近,而广东鲂与前述3种鲂属鱼类的亲缘关系均较远。     

泥蚶34个EST-SSR标记的开发及在格粗饰蚶中的通用性检测

利用泥蚶转录组高通量测序、拼接获得的大量EST序列开发SSR标记,在1123条EST序列里筛查到73条含有SSR位点的EST序列,其中54个位点适合设计引物,在位点两侧设计引物并进行PCR扩增.结果显示,46对引物获得稳定扩增的位点,引物在泥蚶奉化群体的多态性检测中发现,有34对引物表现出多态性,共扩增出122个等位基因,各位点的等位基因数Na为2～7个,平均每个位点产生3.59个等位基因,观测杂合度Ho、期望杂合度He、多态信息含量PIC范围分别为0.000 ～ 0.600、0.078 ～0.771、0.106～0.718;Hardy-Weinberg平衡检测显示,13个位点偏离了平衡状态;用Nr和Swiss-Prot蛋白质数据库对含有多态性SSR的EST进行了基因注释,25个SSR位点来自注释基因序列.将34对泥蚶多态性SSR引物在格粗饰蚶中进行了通用性检测,结果有1 1对成功扩增,8对表现为多态,通用率为23.53％,这些通用引物可用于两种蚶的遗传多样性评价、系统进化分析、比较作图和基因发掘等研究.     

猪差异表达EST的组织表达谱分析

表达序列标签是一种快捷、高效的揭示基因组信息的方法。本研究以蓝塘猪与大白猪差异表达的5条EsT在各组织中的表达情况为目的．采用大白猪、蓝塘猪为实验材料，从成年种猪的10个组织中提取总RNA；运用RT—PCR方法分析，结果显示5条EST在猪的多数组织中均有表达；同源性比对后发现，在5条差异显示cDNA中，EST1、EST2与已知序列无同源性；电子表达谱分析表明EST1、EST2、EST4及ESt5在骨骼肌、肝脏组织中有表达。这为进一步研究该EST的功能奠定基础。     

大叶藻EST-SSR标记开发及其在大叶藻群体遗传多样性研究中的应用

本研究从NCBI的EST数据库中下载大叶藻EST序列共计10 659条,从中得到SSR位点共65个,SSR发生频率为1.7%,平均分布距离为21.7 kb。其中三核苷酸为优势重复类型,占49.2%,二核苷酸数量仅次于三核苷酸,占33.8%。基于65条含有SSR的EST序列,设计并合成了30对引物,其中26对引物的扩增产物单一,片段大小与预测的相近或较大。在由16个大叶藻个体组成的群体中,其中8对引物的扩增条带具有多态性。利用这8对引物对青岛汇泉湾大叶藻自然群体进行了遗传多样性分析,结果表明,8个SSR共检测出33个等位基因,平均每个SSR能检测出4.1个等位基因,多个遗传多样性参数表明,青岛汇泉湾大叶藻群体具有较高的遗传多样性（Ho=0.538 2;He=0.577 6;I=0.560 7）。本研究开发的EST-SSR标记,可进一步丰富大叶藻SSR标记信息,为大叶藻分子生态和群体遗传研究提供更多的标记选择。     

军曹鱼全基因组微卫星特征分析与多态性标记的筛选及应用

为更好地开发军曹鱼(Rachycentron canadum)高多态性微卫星分子标记,本研究基于军曹鱼全基因组测序结果,利用MISA1.0软件对其简单重复序列(simple sequence repeat, SSR)的位点信息进行检索及分析。结果显示,基因组中共筛选出1~6个核苷酸为重复单元的SSR位点344 820个,其中,以单核苷酸重复序列最多(174 146个),占SSR总数的50.50%;其次为二核苷酸重复和三核苷酸重复序列,分别占SSR总数的30.23%和14.02%。在SSR包含的重复单元中,单核苷酸重复以A/T类型为主,AC/GT是二核苷酸的优势重复单元类型。军曹鱼基因组SSR核心序列重复次数在4~275次范围内波动,单核苷酸SSR重复数为10的最多,二核苷酸SSR重复次数为6的最多。本研究设置长度≥12 bp为筛选高多态性SSR位点的标准,共获得361 684个位点。在上述位点中随机选取100个候选位点进行基因分型检测,利用从中筛选到多态性较高的10个SSR标记分别对北海、陵水、硇洲、徐闻和三亚5个养殖群体进行遗传多样性分析,145尾个体中共检测到69个等位基因,观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)平均值分别为0.628、0.706和0.653。相关研究表明,军曹鱼基因组中SSR位点类型较为丰富、多态性潜能较高,从中筛选获得的多态性SSR标记可为军曹鱼分子标记辅助育种、群体遗传多样性评价等研究提供有力支持。     

凡纳滨对虾EST微卫星标记初步筛选

对161 075条凡纳滨对虾dbEST(database of “Expressed Sequence Tags”)的数据进行SSR序列筛选,搜索参数为二~六核苷酸重复6次以上(包括6次),共获得含SSR的EST序列12 600条,占整个凡纳滨对虾dbEST数据库的7.8%,其中二核苷酸重复10 104条,占总ESTSSR序列的80.2%; 三核苷酸重复2 036条(16.1%),四核苷酸重复336条(2.7%),五核苷酸重复35条(0.3%),六核苷酸重复89条（0.7%）。大部分发现的微卫星序列为完美型(perfect)的重复序列。在二核苷酸所获得的SSR重复单元中,AG/CT是优势重复单元,共分布4 820条,占二核苷酸各重复单元的47.8%;其次是AC/GT重复,共分布3 584条,占二核苷酸各重复单元的35.4%;最后是AT/TA 和CG/GC,分别占二核苷酸各重复单元的16.6%和0.2%。通过对凡纳滨对虾EST序列中SSR位点信息的发掘分析,共设计77对微卫星引物,在10个个体中成功扩增的引物有54对,成功扩增率为70.1%。其中多态性丰富的引物28对,多态率为51.9%。等位基因数为2～5,PCR产物大小为140～600 bp。本研究筛选的ESTSSR标记将为凡纳滨对虾的分子遗传学研究、种质鉴定等提供可靠的工具。     

单核苷酸多态性及其在水产动物遗传育种中的应用

单核苷酸多态性（SNPs）是广泛存在于基因组中的一类由单个碱基转换或颠换引起的DNA序列多态性。它是继限制性片段长度多态性（RFLP）、微卫星标记（SSR）之后的新一代分子标记,已广泛应用于构建遗传连锁图谱、QTL定位、关联分析及研究群体遗传结构与亲缘关系等方面。本文主要介绍了SNPs的概念、特点及检测SNPs的主要方法,综述了SNPs在水产动物遗传育种中的研究进展,以期将SNPs更广泛地应用于水产动物群体遗传、分子标记辅助育种和生物进化等研究领域。     

16种环节动物线粒体基因排列、特征比较及系统发育分析

为深入开展环节动物的分类及遗传进化等研究,比较分析了已登录到GenBank中16种环节动物全基因组的结构特征。结果发现,16种环节动物线粒体全基因组序列中A+T的含量均超54.3%,碱基G存在低含量的偏向,第三位密码子G含量2.6%~12.7%。基因组的基因组成及排列模式具有一定的保守型,存在5个保守基因联块蔟,线粒体基因组排列顺序在研究环节动物系统发育关系方面起着重要的作用。计算13个编码基因和2个rRNA的基因平均遗传距离,cox1(0.34)相对最保守,atp8(0.8)相对最不保守。大多数环节动物线粒体控制区存在茎环结构。基于13个编码基因氨基酸序列通过3种方法可构建稳健的系统发育树,蛭纲和寡毛纲聚为一进化分枝,构成有环类单系群,螠虫纲、星虫纲和多毛纲聚为一进化分枝,形成单系群。5个纲间的聚类结果与之前的基于线粒体基因和其他分子标记研究研究结果有所不同。多毛纲呈单系发生,被分为两个主要类群,头节动物中的锥头虫科和缩头虫科没有聚为单独的一进化分枝,而是分别聚类到触角动物下面的足刺动物和沟触角动物,多毛纲内部分类不同于现有的形态学分类结果。     

仿刺参线粒体全基因组序列结构及比较研究

利用已构建的仿刺参cDNA文库得到的线粒体DNA(mtDNA)相关基因序列设计扩增引物,测定了大连仿刺参线粒体基因组全序列,并对其进行了基因构成和进化分析。仿刺参线粒体基因组序列长16 109bp,其基因构成与其他后口动物基本一致,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和3个主要的非编码区。在其37个基因中,ND6、tRNASer(AGN)、tRNAGln、tRNAAla、tRNAVal、TrnaAsp位于L链上,其余均位于H链上。在13个蛋白质编码基因中,除ND1的起始密码子为GTG外,其余均以ATG作为起始密码子;除Cytb以"T"作为终止密码子外,其他蛋白质基因均具有完全的终止密码子,且在已知的棘皮动物线粒体蛋白质基因中,部分基因的起始和终止密码子表现出一定的纲内特异性。比较分析了大连、青岛、威海仿刺参线粒体基因组,三者的基因组成和排列相同,碱基组成相近,蛋白质编码基因的起始和终止密码子完全一致,但存在核苷酸和氨基酸序列的差异。三者的控制区序列存在多个插入/缺失和SNP位点。根据COI、Cytb和ND4计算了三者之间的遗传距离为0.006～0.018,遗传距离分析和系统进化关系分析都显示青岛仿刺参和威海仿刺参的关系较大连仿刺参更近。     

斑海豹线粒体基因组序列分析及比较研究

本研究采用LA-PCR扩增和引物步移相结合的方法对我国辽东湾斑海豹的线粒体基因组全序列进行了测定,并完成了基因组成和系统发生学分析。辽东湾斑海豹线粒体基因组长为16 754bp,其基因构成与其他海洋哺乳动物基本一致,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和1个控制区。在其37个基因中,ND6、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(UCN)、tRNAGlu、tRNAPro位于L链上,其余均位于H链上。对我国辽东湾、韩国和美国阿拉斯加斑海豹线粒体基因组进行了比较分析,结果显示,三者线粒体基因组长度略有不同,差异主要体现在以重复片段形式存在的控制区序列中。值得注意的是,在编码区中,3个目标群体的线粒体ND5基因核苷酸差异最为显著,共检测到了18个突变位点,造成4处氨基酸序列变异。斑海豹线粒体基因组蛋白编码基因的变异分析及海豹科系统进化分析结果显示,我国辽东湾和韩国斑海豹的序列同源性显著高于美国阿拉斯加斑海豹,说明辽东湾和韩国斑海豹很可能来自同一个种群。     

星虫动物线粒体基因组全序列的基因排列和特征比较

综合利用通用引物PCR和长PCR扩增,获得可口革囊星虫的线粒体DNA,结合鸟枪法和引物步移法获得可口革囊星虫的线粒体基因组。比较可口革囊星虫与方格星虫线粒体基因组,所有的37个基因均在同一条链上编码。2个星虫动物线粒体基因组蛋白质编码基因的起始、终止密码子及氨基酸长度存在差异。2个星虫动物的线粒体基因组,存在6个保守的基因区块:(1)nad6-cob-P-S2-C-M,(2)I-K-nad3-F,(3)nad4L-nad4-L2,(4)nad1-W-atp6,(5)nad5-S1及(6)nad2-cox1。去除转运RNA而仅比较蛋白质编码基因和核糖体RNA,则2个星虫动物线粒体基因组主编码基因的基因排列完全一致,均为:cox1-cox2-atp8-cox3-nad6-cob-srRNA-lrRNA-nad3-nad4L-nad4-nad1-atp6-nad5-nad2。星虫动物、环节动物和螠虫动物线粒体基因组共有5个保守区块:(1)cox1-cox2-atp8,(2)nad4L-nad4,(3)srRNA-lrRNA,(4)cox3-nad6-cob,(5)atp6-nad5。在15个主编码基因中,nad5基因和nad4基因变异位点数最多,因此可作为备选的分子标记,用于分析星虫动物不同物种和群体之间的生物多样性。     

圆斑星鲽线粒体基因组全序列结构及其进化

利用圆斑星鲽(Verasper variegatus Temminck et Schlegel)和相关鱼类的部分线粒体基因序列,设计出6对扩增引物,通过PCR扩增产物直接测序和引物行走(Primer walking)法测定圆斑星鲽线粒体基因组全序列,并对其进行结构与进化分析。圆斑星鲽线粒体基因组序列长17273 bp,其基因序列及构成都与其他硬骨鱼基本相同,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和2个非编码区(控制区和WANCY区)。在22个tRNA基因中,tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(第2个)、tRNAGlu和tRNAPro的编码基因位于L链上,其余则位于H链上。在13个蛋白质编码基因中,除了COⅠ基因的起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子。蛋白质编码基因包括具有完整TAA终止密码子的ND1,COⅠ,ATP8,ND4L,ND5,而其他蛋白编码基因则具有不完全终止密码子。在L链上,ND6是仅有的一个蛋白质编码基因。圆斑星蝶的控制区包含1个终止相关序列区(ETAS)、6个中央保守序列区(CSB-A、B、C、D、E、F)和3个保守序列区(CSB-1、2、3)以及长串联重复区(Tandemly repeat sequence)。用NJ法和MP法对5个目22种鱼mtDNA的13个蛋白质编码基因的氨基酸序列进行系统分析,结果显示,圆斑星蝶与石鲽关系最近,鲽形目的鲆、鲽类与鲈形目的科(Carangidae)、鲷科(Sparidae)鱼类亲缘关系较近,而同属于鲽形目的塞内加尔鳎(Solea senegalensis)没有和任何目聚在一起,成为一个独立的分支。圆斑星蝶的基因组全序列序列已提交到GenBank,登录号为DQ403797,控制区单元型序列的GenBank登录号为DQ834444~7。     

兰州鲇生长激素(GH)基因的克隆及序列分析

利用长片段PCR及T-A克隆技术,从兰州鲇(Silurus lanzhouensis)基因组DNA中首次克隆兰州鲇GH基因全序列并提交至Genbank获得登录号KM215221,同时,使用DNAstar等生物信息学软件进行序列分析研究。兰州鲇GH基因全长2 067 bp,由5个外显子和4个内含子组成,完整编码序列(Complete coding sequence,CDS)为603 bp。5个外显子大小分别为10、140、117、132和204 bp;4个内含子大小分别为229、103、565和103 bp;内含子与外显子的连接区序列遵循基因组成规则。编码区编码1条由200个氨基酸残基组成的蛋白质多肽。5个科8种鲶形目鱼类生长激素基因编码区序列同源性比较表明,它们之间GH基因编码区序列有较高的同源性,平均达到了92.4%,其中,兰州鲇和南方大口鲇之间的同源性最高,为99.5%,兰州鲇和革胡子鲇之间的同源性最低,为90.0%,并构建了系统发育进化树。同时也表明,GH基因编码区序列具有较高的保守性,系统发育研究中具有较高的参考价值。