自带介质血红密孔菌NFZH-1的鉴定及其木质素降解特性

菌株自带介质可提高其漆酶降解木质素能力,因此自带介质高产漆酶菌株的筛选、鉴定对漆酶的商业应用将起到促进作用。从南京山林地区分离出两株血红密孔菌NFZH-1和NFZH-2,并以杂色云芝为对照,研究了两株血红密孔菌发酵产漆酶和木质素降解特性。首先通过形态学特性鉴定了NFZH-1为自带介质血红密孔菌。其次以愈创木酚为反应底物,平板接种菌株,培养5天,NFZH-1颜色圈较菌丝圈大,且颜色最深;经10天固态发酵,NFZH-1所产漆酶酶活高达23600 U/g,且未检测出木质素过氧化物酶( LiP)和锰过氧化物酶( MnP)。平板显色和固态发酵产酶结果表明自带介质血红密孔菌NFZH-1为漆酶高产菌株。麦草粉经菌株 NFZH-130天降解,木质素降解率、综纤维素降解率分别达56.7%和36.6%,表明血红密孔菌NFZH-1为选择性高木质素降解活性菌株。     

竹材木质素高效降解菌的分离筛选及鉴定

采用愈创木酚变色、苯胺蓝平板退色和酶活性测定筛选出高效降解竹材木质素的菌株。结果表明:通过腐烂的竹材等34份样品分离纯化出139株真菌;通过0.04%愈创木酚和0.1‰苯胺蓝平板初筛,从分离纯化的139株真菌中筛选出具有产木质素降解酶活性的7株降解菌;7株降解菌经液体产酶培养基复筛得到2株高效产降解木质素酶活的菌株:培养7 d,漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶活性分别达72.558、23.769、55.044和34.611、38.781、82.646 U/mL;2株降解菌FG-35和FG-98分别鉴定为革耳菌Panus lecomtei和烟管菌Bjerkandera adustus。     

园林废弃物木质素降解真菌的筛选、鉴别及其能力研究

[目的]为获得能够高效降解园林废弃物的真菌并研究其降解能力,从经过堆肥处理的园林废弃物中分离和筛选出1株木质素降解能力较强的真菌。[方法]经过形态分析、ITS分子序列分析,构建系统发育树,鉴定出该株木质素降解真菌种属,并利用该菌株进行固态发酵实验,研究其在固态发酵过程中漆酶、锰过氧化物酶的酶活力变化及其对不同园林废弃物中木质素的降解能力。[结果]从经过堆肥处理的园林废弃物中共挑选出真菌18株,筛选出1株高效的木质素降解真菌,编号为菌株No.11,经鉴定该菌株为构巢曲霉(Aspergillus nidulans(Eidam) G.Winter)。以冬青卫矛叶、冬青卫矛枝、圆柏叶、圆柏枝、连翘枝叶为底物的模拟固态发酵的漆酶酶活力峰值分别为388.7、326.3、461.4、342.7、588.5 U·L~(-1),锰过氧化物酶酶活力峰值分别为138.3、121.1、104.6、128.6、73.3 U·L~(-1)。添加菌株No.11使冬青卫矛叶、冬青卫矛枝、圆柏叶、圆柏枝、连翘枝叶40 d后木质素降解率分别提高了20.40%、22.44%、29.90%、25.28%、15.77%。[结论]筛选出的构巢曲霉对北京地区常见园林废弃物冬青卫矛、圆柏和连翘枝叶中的木质素具有较好的降解能力,在降解园林废弃物方面可能更具有优势。     

几种真菌产木质素降解酶的比较研究

通过PDA-Bavendamm平板显色反应、PDA-RB亮蓝显色反应、变色圈试验,获得选择性降解稻草木质素的高酶活菌株:糙皮侧耳、彩绒革盖菌和粗毛栓菌。液态产酶活性试验结果表明,粗毛栓菌是供试菌株中Lac、Mnp、Hcel的高产菌株。粗毛栓菌出现2次产Lac酶高峰,分别为第6天和12天,12天产Lac酶达894U/L;产Mnp酶高峰出现在第6天,达185 U/L;在18天时出现产Hcel酶高峰,产酶达62.7U/L。     

松褐天牛幼虫肠道黏质沙雷氏菌培养条件与木质素降解功能

【目的】研究松褐天牛幼虫肠道内黏质沙雷氏菌木质素降解功能,为揭示松褐天牛与肠道细菌协作降解木质素的机制提供依据。【方法】以硫酸盐木质素液体培养基培养黏质沙雷氏菌,采用酶标仪微量测定法研究该菌对木质素的降解能力,考察其产木质素降解酶的种类及其变化,以及体外培养条件对该菌产优势降解酶———木质素过氧化物酶活性的影响。【结果】体外培养10天后黏质沙雷氏菌对硫酸盐木质素的累计降解率达94.12%,其中第4天的单日降解率最高,达15.16%。该菌在木质素培养基中可产木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶3种木质素降解酶,其中木质素过氧化物酶活性最高,然后依次是锰过氧化物酶和漆酶,前2种酶的日变化趋势与培养基中木质素的降解率相近。该菌产木质素过氧化物酶的最适培养基条件:p H5、硫酸木质素质量浓度3 g·L~(-1),有机氮源、酵母膏质量浓度5 g·L~(-1),Mg~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)、K~+离子质量浓度分别为0.20、0.40、0.15、0.04和0 g·L~(-1)。【结论】黏质沙雷氏菌具有较强的木质素降解能力,可通过产生木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶实现其对木质素的降解功能;培养基中木质素浓度、p H值、氮源种类及其浓度、金属离子及其浓度等对其产木质素过氧化物酶的活性均有显著影响。     

产漆酶半知真菌Myrothecium verrucaria NF-08菌株的分离及产酶研究

[目的]采集凉水国家级自然保护区原始森林土壤样品,分离产漆酶真菌并优化产酶条件,旨在开发产漆酶半知真菌种质资源,提高漆酶产量,为微生物漆酶扩大生产提供菌种资源和条件参数.[方法]以木质素磺酸钠为唯一碳源的无机盐培养基为富集培养基,在愈创木酚-PDA选择性平板上分离产漆酶真菌.利用ABTS[2,2 ′-连氮一双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]和SGZ [4-羟基-3,5-二甲氧基一苯甲醛连氮,即丁香醛联氮]显色反应初筛和摇瓶发酵复筛.确定供试菌株后,利用形态观察结合rDNA-ITS序列分析技术,将菌株鉴定至种.以ABTS法测定供试菌发酵液漆酶活性,以Lowry法测定发酵液总蛋白含量.在考察供试菌株生长、产酶及胞外蛋白总量动态变化基础上,通过单因素试验,研究碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、培养基起始pH、装液量、接种量及底物诱导对菌株产漆酶的影响,获得菌株产酶最适培养基组分和培养条件参数.[结果]获得1株发酵周期短、初始酶活高的产酶菌株NF-08.结合形态学特征与rDNA-ITS序列分析结果,鉴定菌株NF-08属于为半知菌亚门疣孢漆斑菌.该菌株在液体发酵培养基中产漆酶活性与菌丝生长和胞外蛋白总量基本同步,发酵第6天达到酶活峰值9.28 U·mL-1.疣孢漆斑菌NF-08产酶最佳碳、氮源分别为4.0％葡萄糖和3.5％蛋白胨,培养基初始pH7.0.最适装液量60 mL·(250 mL)-1,最适接种量4％,最适培养温度和摇床转速分别为30℃和140 r·min-1.没食子酸、阿魏酸和单宁酸显著诱导疣孢漆斑菌NF-08漆酶活性的产生,以没食子酸效果最好.经过培养基组分和培养条件优化以及底物诱导,疣孢漆斑菌NF-08产酶水平达到16.82 U·mL-1,比优化前提高了81.25％.[结论]建立环境样品中产漆酶真菌的分离、纯化及筛选方法,获得了一株发酵周期短、产漆酶活力高的半知真菌疣孢漆斑菌NF-08.该菌株经单因素试验产酶条件优化效果明显,酶活水平提高显著,可为微生物发酵产漆酶提供新的菌株资源,在微生物发酵漆酶工业生产中具有应用潜力.后续对疣孢漆斑菌NF-08漆酶产生、性质及基因表达调控的深入研究,将有助于了解漆酶在半知真菌生活史中的作用及生态学功能,同时拓展半知真菌漆酶的应用领域.     

用于提取可纺性竹原纤维菌株的选育

从自然界腐朽的竹材或木材中,能分离和筛选高效降解木质素并只少量降解或者不降解竹纤维的优良菌株,通过GU-W A平板变色反应试验和菌株对竹材木质素、竹纤维降解试验,共获得了3株具有选择性降解竹木质素的优良菌株(15、18、21号菌株),经初步鉴定这3株菌为真菌菌株;测定了菌株在摇瓶培养时所产孢外酶的酶活.最后采用3株菌联合法进行降解竹材木质素试验.结果表明:3株菌联合降解木质素效果优于单一菌株,其降解率可达72.26%.     

竹材木质素降解菌的筛选与鉴定*

竹材木质素的降解一直是制约竹材资源利用的重要影响因素。文章通过对49 份腐烂的竹材样品进行平板划线分离纯化得到74 株真菌，利用PDA- 愈创木酚变色及PDA- 苯胺蓝退色反应，初步筛选出具有木质素降解酶能力的4 株木质素降解菌，通过酶活力测定对初筛得到的4 株木质素降解菌进行复筛，发现FG-22 菌株具有较好木质素降解能力，对FG-22 降解菌株进行形态学和分子生物学鉴定，确定FG-22 为杂色云芝（Trametes versicolor）。     

竹材木质素降解菌的筛选与鉴定

竹材木质素的降解一直是制约竹材资源利用的重要影响因素。文章通过对49份腐烂的竹材样品进行平板划线分离纯化得到74株真菌,利用PDA-愈创木酚变色及PDA-苯胺蓝退色反应,初步筛选出具有木质素降解酶能力的4株木质素降解菌,通过酶活力测定对初筛得到的4株木质素降解菌进行复筛,发现FG-22菌株具有较好木质素降解能力,对FG-22降解菌株进行形态学和分子生物学鉴定,确定FG-22为杂色云芝(Trametes versicolor)。     

一株用于石油污染修复的产漆酶菌种产酶条件优化及性能评价

选取血红密孔菌Pycnoporus coccineus为产漆酶菌种,通过开展单因素产漆酶条件优化研究,明确最佳液体发酵工艺参数,制备出粗酶制剂并进行原油降解性能评价。结果表明:1)漆酶最佳液体发酵工艺参数为初始pH值5～7、初始温度30℃、摇床转速200r/min,接种量1.5%、碳源为羧甲基纤维素钠20.00g/L、氮源为硝酸钠5.00g/L、磷源磷酸氢二钾为2.00g/L、Cu2+浓度为1.00mmol/L、诱导剂为蔥2.00×10-4 mmol/L;复合制剂(粗酶制剂+菌剂)TPHs降解率高于单一制剂(仅投加菌液),环境耐受性、微生物底物作用能力及原油降解速率均显著提升。     

木质素降解真菌的筛选及其对森林地表可燃物的降解效果

【目的】筛选帽儿山人工林地表可燃物中的木质素降解真菌,探究木质素降解菌对不同森林地表可燃物的分解效果,以期找到能够有效降解森林可燃物的真菌菌种,为应用生物降解方法降低森林地表可燃物载量从而降低森林火灾发生概率与森林火险指数提供理论依据和基础数据。【方法】采集东北林业大学帽儿山实验林场尖砬沟森林培育实验站的落叶松、胡桃楸、水曲柳纯林与胡桃楸-落叶松、水曲柳-落叶松混交林内的凋落叶,采用添加抗生素的麦芽浸粉(MEA)培养基进行真菌的分离培养,之后采用愈创木酚平板显色法进行初筛,根据测定菌株的显色情况及菌落圈与显色圈比值筛选高活性木质素降解酶菌株,复筛利用苯胺蓝平板脱色法对菌株木质素氧化酶系进行定性测定,对2次筛选获得的菌株进行形态学及分子鉴定,然后以胡桃楸、水曲柳、落叶松3种可燃物样品作为分解基质,接入木质素降解菌单一及混合菌液,于28℃恒温培养7 d,分别测定经培养后基质中的木质素含量,分析木质素分解规律。【结果】由MEA培养基筛选出的9株真菌有5株在PDA-愈创木酚培养基上发生了显色反应,且菌株B6和Y3的R/r <1,即该2株菌能优先降解木质素;苯胺蓝平板脱色试验结果显示菌株B6和Y3均可使培养基蓝色褪去,即均具有LiP与MnP酶活性;经形态学及分子鉴定,菌株B6为白囊耙齿菌Irpex lacteus,菌株Y3为桦褶孔菌Lenzites betulinus;地表可燃物样品降解试验结果显示,经单一菌液与两者混合菌液培养后,样品中木质素含量均有下降,且经混合菌液处理后的3种可燃物基质表现出相对较好的降解效果;3种基质降解率从高到低依次为水曲柳>胡桃楸>落叶松;菌种Y3对木质素的降解效果较菌种B6好。【结论】混合菌液对可燃物中木质素的分解能力较单一菌液强;菌株B6和Y3之间无拮抗作用,混合后产生协同效应,使木质素降解酶系活力提高,从而可提高木质素降解率;菌种Y3降解能力强于B6;可燃物样品中木质素降解效果因基质不同而存在差异,阔叶可燃物比针叶可燃物易分解。经筛选出的木质素降解菌能有效降解可燃物中的木质素,可在一定程度上减少森林地表可燃物载量,从而降低森林火灾风险。     

高产漆酶真菌菌株的筛选及酶学性质研究

从6株野生真菌和5株食用真菌中筛选出高产漆酶菌株,并对筛选出的野生菌株漆酶酶学性质进行初步探究。使用G-PDA确定菌株的产漆酶能力,然后通过液体发酵对产生的粗酶液进行酶活力测定,确定高产漆酶菌株,最后分别在不同pH和温度下进行酶学性质探究。初步筛选结果:第7天时,05号菌丝直径最大89.1mm,08号显色圈直径最大76.8mm,04号的显色圈颜色最深,09号显色反应最不明显。对于漆酶活力:04号活力最高262.7U/mL,其次是08号和05号分别为255.3U/mL、203.9U/mL。01和06号酶活力达到最大所需时间最短。酶学性质方面,08号的最适pH是3.2、最适温度是40℃;在不同pH、温度下分别保温2h,pH=4.0酶活力残余率为94.20%;温度在20~40℃内,酶活力残余率在99.00%以上。结果表明,0.04%G-PDA最适作为产漆酶真菌的初筛培养基;高产漆酶能力的菌株有04、05和08号菌株,且08号菌株漆酶的最适应用条件是pH=4.0、温度为40℃。     

纤维素降解菌株的分离与筛选

从实验室已有的木腐菌与土壤中分离获得的菌株中筛选出具有较高纤维素降解能力的菌株。利用羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养,利用刚果红染色进行初筛,选择透明圈与菌落直径比值较大的菌落进行酶活测定再次进行复筛。同时,利用分子学手段对高效产胞外纤维素酶的菌株进行鉴定。最终,筛选出4株高效产胞外纤维素酶的菌株,其中菌株HF-3在28 ℃、180 r/min条件下发酵培养5 d后,胞外纤维素酶活性最高,高达67.772 U/mL,经鉴定为密褐褶孔菌Gloeophyllum trabeum;另外Y5、Y6、Y2共3株菌株酶活较高,分别为37.714 U/mL、30.694 U/mL、25.336 U/mL,属于链霉菌,依次鉴定为浅灰白链霉菌Streptomyces griseoloalbus、丝状链霉菌Streptomyces filamentosuss和威德摩尔链霉菌Streptomyces wedmorensis。试验筛选得到HF-3、Y5、Y6以及Y2菌株具有较高纤维素降解能力,可为复合菌系的研制提供材料。     

3种白腐菌木质素降解酶的比较

对3种白腐菌——黄孢原毛平革菌、变色栓菌和木质层孔菌在恒温振荡培养条件下产漆酶、锰过氧化物酶的情况进行比较研究,同时还对此3种菌在培养过程中还原糖的变化作了研究.结果表明:3种白腐菌中变色栓菌产漆酶相对最高,其漆酶酶活最高达到136.5 U/L,产酶最高时间为第8天;而木质层孔菌产锰过氧化物酶相对最高,其最高酶活达到880.2 U/L,产酶最高时间为第8天;同时在培养过程中还原糖含量随培养时间的延长而逐渐降低.     

没食子单宁降解菌株的筛选及发酵条件优化

通过平板涂布、划线分离、菌落观察等方法,从土耳其倍子提取液自然生长的菌落中分离纯化出11株菌,从中初筛出1#、2#、4#这3株降解没食子单宁的菌株,复筛出1株没食子单宁优良降解菌株1#菌,其没食子单宁降解率达65%以上,发酵液中没食子酸质量浓度为0.052 3 g/L,单宁酶活为0.920 U/mL;对1#菌株的发酵条件进行了响应面法优化,结果表明:1#菌最佳产酶条件为培养温度31℃,初始培养基pH值5.0,最适培养时间50 h,在该条件下1#菌单宁酶酶活可达1.170 U/mL,与优化前的最大酶活0.920 U/mL相比,提高了27.2%。     

木聚糖酶产生菌的筛选及其酶学性质初步研究

采用富集培养、平板划线分离、透明圈平板筛选的方法,从长期堆放玉米芯的土壤中分离到9株木聚糖酶产生菌,然后采用自然选育的方法从这些菌株中筛选出一株优良木聚糖酶菌株,用该菌株发酵产酶并对其酶学性质进行了初步研究.结果表明:在温度28~30℃、pH初始值5.0左右、摇床转速150 r/min、发酵48 h所产的木聚糖酶酶活较高,木聚糖酶活达到13.68 U/mL;酶促反应的较适温度为53℃,pH值为5.3左右;该酶较耐热,温度在60℃下,120 min后酶活仍残留60.82%.     

一株高产几丁质酶的粘质沙雷氏菌筛选、鉴定及应用

从自然环境中,筛选出了高效降解几丁质的菌株,同时也具有广谱的杀虫潜能的菌株,为植物病虫害的防治提供一个新思路。以武汉沙湖边的水样为材料,经过富集培养、初筛和复筛后,筛选到一株高效降解几丁质的菌株,并对菌株进行生理生化和16srDNA鉴定,同时测定了产生的几丁质酶的活力,探讨了菌的发酵液对真菌的拮抗作用和毒杀秀丽隐杆线虫作用。从水样中筛选到一株能够在pH7和pH11的1%胶体几丁质平板上有明显水解圈的菌株,经生理生化和16srDNA鉴定,该菌为粘质沙雷氏菌,命名为MEW06。经摇瓶培养后,测得该菌株发酵上清液的几丁质酶活力可达75U/mL。该菌能抑制苹果轮纹菌和草莓灰霉真菌的生长,并能毒杀秀丽隐杆线虫。MEW06菌株能分泌高活性的几丁质酶,该酶具有广谱的pH值作用范围,同时具有杀菌杀虫作用,因此在植物生物防治方面有很好的应用前景。     

红平菇木质素降解酶系统漆酶、锰过氧化物酶及木质素过氧化物酶的检测

木材白腐菌在分解木质素的过程中会产生非特异性的分解木质素结构的酶系统,这些酶系统主要包括细胞外过氧化物酶[锰过氧化物酶(manganese peroxidase,MnP)、木质素过氧化物酶(lignin peroxidase,LiP)]和细胞外酚氧化酶[漆酶(laccase)].因此,在生物修复方面,白腐菌能够有效地降解废水和土壤中难被降解的多氯联苯、多环芳烃、DDT、染料、炸药和其他氯化物、叠氮化合物等.     

侧耳菌GH196木质纤维素降解酶系的研究

以一株从腐朽竹子上分离得到的侧耳菌(Pleurotus sp.)GH196为产酶菌,研究了其在静置和振荡两种液体培养方式下的木质纤维素降解酶系的产生.结果表明在含有稻草和麦麸的液体培养基中生长,可以产生木聚糖酶、纤维素酶和依赖锰过氧化物酶-漆酶型(MnPLaccas型)木质素降解酶.振荡条件可以促进菌丝生长,有利于多糖水解酶的产生,其中以木聚糖酶的合成为主;150r/min振荡培养5 d,木聚糖酶酶活达到44.7 U/mL.     

几株半知菌对马尾松落叶的分解——木质纤维素酶的活性动力学

应用固体发酵方法,研究Alternaria sp., Penicillium sp., Cephalosporium sp., Tricherderma sp., Pestalotiopsis sp.和Aspergillus fumigatus 6种土壤半知菌降解马尾松凋落叶片过程中产生的漆酶(Laccase)、木质素过氧化物酶 (LiP)、锰过氧化物酶 (MnP)、羧甲基纤维素酶 (CMCase) 和滤纸糖酶 (FPA)的动力学曲线,以及各种酶活性与底物降解的关系.结果表明:Pestalotiopsis sp. 能够产生相对较高的漆酶活性和引起底物的总有机物质(TOM)质量损失最大;Alternaria sp. 产生的MnP酶活性最高;Pestalotiopsis sp. 产生的CMCase和FPA酶活性也为最高.试验中6种菌前期的降解速率依赖于CMCase 和 FPA酶活性的高低,后期则由木质素酶和纤维素酶协同作用来决定.依据6种菌的酶生产动力学曲线、TOM 质量损失和降解速率,可将其划分为2种功能类型:功能群Ⅰ为纤维素分解菌,包括Alternaria sp., Penicillium sp., Cephalosporium sp.和Tricherderma sp. 4种;功能群Ⅱ为木质纤维素分解菌,包括 Pestalotiopsis sp.和Aspergillus fumigatus 2种.试验中也发现:Pestalotiopsis sp.产生漆酶的活性较高,同时是一株比较有效降解木质纤维素底物的菌种.