MEW06产几丁质酶响应面发酵条件优化研究

以筛选到的一株高效产几丁质酶的粘质沙雷氏菌MEW06为材料,为了提高该菌产几丁质酶的能力,对MEW06产几丁质酶的发酵培养基条件进行了优化。通过Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验和响应面法Box-Behnken设计试验,得到了MEW06产几丁质酶的最优培养基配方。实验表明:在MEW06菌株在产几丁质酶的最适条件(pH 7.0、温度31℃、接种量3%、装液量35%、摇床转速150rpm和培养时间为48h)的基础上,优化出来的培养基配方为:淀粉17.5g/L、胶体几丁质8/1000(wt/vol)、蛋白胨20g/L、K_2HPO_4 0.56g/L、KH_2PO_4 0.375g/L、MgSO_4·7H_2O 0.5g/L、FeSO4·7H_2O 0.01g/L、ZnSO_4 0.01g/L。优化后MEW06发酵产几丁质酶活达197.32 U/mL,相比于初始培养基酶活提高了2.58倍。可为MEW06菌株在农业生防方面的应用以及在降解几丁质方面的应用提供实验依据。     

高产漆酶真菌菌株的筛选及酶学性质研究

从6株野生真菌和5株食用真菌中筛选出高产漆酶菌株,并对筛选出的野生菌株漆酶酶学性质进行初步探究。使用G-PDA确定菌株的产漆酶能力,然后通过液体发酵对产生的粗酶液进行酶活力测定,确定高产漆酶菌株,最后分别在不同pH和温度下进行酶学性质探究。初步筛选结果:第7天时,05号菌丝直径最大89.1mm,08号显色圈直径最大76.8mm,04号的显色圈颜色最深,09号显色反应最不明显。对于漆酶活力:04号活力最高262.7U/mL,其次是08号和05号分别为255.3U/mL、203.9U/mL。01和06号酶活力达到最大所需时间最短。酶学性质方面,08号的最适pH是3.2、最适温度是40℃;在不同pH、温度下分别保温2h,pH=4.0酶活力残余率为94.20%;温度在20~40℃内,酶活力残余率在99.00%以上。结果表明,0.04%G-PDA最适作为产漆酶真菌的初筛培养基;高产漆酶能力的菌株有04、05和08号菌株,且08号菌株漆酶的最适应用条件是pH=4.0、温度为40℃。     

园林废弃物木质素降解真菌的筛选、鉴别及其能力研究

[目的]为获得能够高效降解园林废弃物的真菌并研究其降解能力,从经过堆肥处理的园林废弃物中分离和筛选出1株木质素降解能力较强的真菌。[方法]经过形态分析、ITS分子序列分析,构建系统发育树,鉴定出该株木质素降解真菌种属,并利用该菌株进行固态发酵实验,研究其在固态发酵过程中漆酶、锰过氧化物酶的酶活力变化及其对不同园林废弃物中木质素的降解能力。[结果]从经过堆肥处理的园林废弃物中共挑选出真菌18株,筛选出1株高效的木质素降解真菌,编号为菌株No.11,经鉴定该菌株为构巢曲霉(Aspergillus nidulans(Eidam) G.Winter)。以冬青卫矛叶、冬青卫矛枝、圆柏叶、圆柏枝、连翘枝叶为底物的模拟固态发酵的漆酶酶活力峰值分别为388.7、326.3、461.4、342.7、588.5 U·L~(-1),锰过氧化物酶酶活力峰值分别为138.3、121.1、104.6、128.6、73.3 U·L~(-1)。添加菌株No.11使冬青卫矛叶、冬青卫矛枝、圆柏叶、圆柏枝、连翘枝叶40 d后木质素降解率分别提高了20.40%、22.44%、29.90%、25.28%、15.77%。[结论]筛选出的构巢曲霉对北京地区常见园林废弃物冬青卫矛、圆柏和连翘枝叶中的木质素具有较好的降解能力,在降解园林废弃物方面可能更具有优势。     

竹材木质素降解菌的筛选与鉴定

竹材木质素的降解一直是制约竹材资源利用的重要影响因素。文章通过对49份腐烂的竹材样品进行平板划线分离纯化得到74株真菌,利用PDA-愈创木酚变色及PDA-苯胺蓝退色反应,初步筛选出具有木质素降解酶能力的4株木质素降解菌,通过酶活力测定对初筛得到的4株木质素降解菌进行复筛,发现FG-22菌株具有较好木质素降解能力,对FG-22降解菌株进行形态学和分子生物学鉴定,确定FG-22为杂色云芝(Trametes versicolor)。     

竹材木质素降解菌的筛选与鉴定*

竹材木质素的降解一直是制约竹材资源利用的重要影响因素。文章通过对49 份腐烂的竹材样品进行平板划线分离纯化得到74 株真菌，利用PDA- 愈创木酚变色及PDA- 苯胺蓝退色反应，初步筛选出具有木质素降解酶能力的4 株木质素降解菌，通过酶活力测定对初筛得到的4 株木质素降解菌进行复筛，发现FG-22 菌株具有较好木质素降解能力，对FG-22 降解菌株进行形态学和分子生物学鉴定，确定FG-22 为杂色云芝（Trametes versicolor）。     

处理松材线虫病疫木的木腐真菌筛选

【目的】通过室内和田间试验筛选能在有效降解松材线虫病疫木的同时,还能够抑制松材线虫在疫木内生活移动的木腐真菌,为研发松材线虫病疫木高效环保除治新途径提供依据。【方法】利用选择培养基从腐朽松木样本中初筛出19个木腐真菌。在不同种类木腐真菌平板上接入2 000条松材线虫共培养,从中筛选出能抑制松材线虫生长繁殖的菌株。通过测定受木腐菌侵染的黑松试样的失重率,判定木腐真菌对松木的腐解能力。选择能有效抑制松材线虫繁殖且降解松木能力强的菌株进行田间试验。采用液体摇瓶培养菌丝接种田间疫木,处理4个月后均匀钻孔取样,分析整段疫木内松材线虫数量变化。5—6月,收集天牛蛹室周围木样(0.5～1 cm),分析蛹室周围木样内松材线虫数量,同期在钢丝网罩中定期捕捉羽化的天牛,分析羽化天牛携带线虫的数量。【结果】室内筛选出7株能抑制松材线虫繁殖且降解木材能力强的木腐真菌,其中在菌株J5-2的平板上培养8天后,每皿仅分离出(18±10)条线虫,在硫磺菌和糙皮侧耳的平板上则完全分离不到松材线虫。在供试菌株中,硫磺菌对松木的降解能力最强,侵染黑松木材4个月后,试样失重率达到22.82%,其次是菌株S4,造成木块重质损失了21.68%。田间试验表明,7种木腐真菌接种4个月后,均能使疫木内松材线虫种群数量减少,其中菌株J5-2、硫磺菌、S4可使蛹室线虫数量减少65%以上,天牛携带线虫数量低于每头200条。菌株J5-2除害效果最佳,使疫木蛹室线虫数量减少72%,每只天牛携带松材线虫仅(15±4)条,最高携带量仅为60条。经鉴定菌株J5-2为Ceriporia sp.。【结论】菌株J5-2、硫磺菌和糙皮侧耳等木腐菌对松材线虫的抑制作用明显,硫磺菌和菌株S4降解木材的能力强,菌株J5-2、硫磺菌、S4在田间处理疫木的效果最好,可使疫木中线虫数量减低65%以上。利用木腐真菌就地处理松材线虫病疫木是一种高效环保新方法。     

竹材木质素高效降解菌的分离筛选及鉴定

采用愈创木酚变色、苯胺蓝平板退色和酶活性测定筛选出高效降解竹材木质素的菌株。结果表明:通过腐烂的竹材等34份样品分离纯化出139株真菌;通过0.04%愈创木酚和0.1‰苯胺蓝平板初筛,从分离纯化的139株真菌中筛选出具有产木质素降解酶活性的7株降解菌;7株降解菌经液体产酶培养基复筛得到2株高效产降解木质素酶活的菌株:培养7 d,漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶活性分别达72.558、23.769、55.044和34.611、38.781、82.646 U/mL;2株降解菌FG-35和FG-98分别鉴定为革耳菌Panus lecomtei和烟管菌Bjerkandera adustus。     

用于提取可纺性竹原纤维菌株的选育

从自然界腐朽的竹材或木材中,能分离和筛选高效降解木质素并只少量降解或者不降解竹纤维的优良菌株,通过GU-W A平板变色反应试验和菌株对竹材木质素、竹纤维降解试验,共获得了3株具有选择性降解竹木质素的优良菌株(15、18、21号菌株),经初步鉴定这3株菌为真菌菌株;测定了菌株在摇瓶培养时所产孢外酶的酶活.最后采用3株菌联合法进行降解竹材木质素试验.结果表明:3株菌联合降解木质素效果优于单一菌株,其降解率可达72.26%.     

绿粘帚霉F051产几丁质酶条件优化及其对三种病原菌的作用

系统研究了碳源、氮源、温度、起始pH值、培养基装量和接种量等因素对绿粘帚霉(Gliocladium virens)F051产几丁质酶的影响。结果表明,碳、氮源分别为麦芽糖和酵母粉最好,并通过正交试验法优化了发酵条件。优化后的产酶条件为:温度为28℃,pH值7,瓶装量为100 ml,每100 ml接种1 ml孢悬液,且碳源和氮源的量分别为1.5%和0.2%。从时间对菌丝生长和几丁质酶活的影响来看,培养第4天酶活便达到最高。在此基础上探索了几丁质对病原菌细胞壁的作用,结果显示,该几丁质酶粗酶液对3种病原真菌细胞壁有一定的降解效果,使病原真菌出现细胞壁变薄、断裂,质壁分离,原生质空泡等现象。     

新秀丽隐杆线虫的节律性排便的研究进展

指出了秀丽隐杆线虫是一种有节律性运动的生物,其中排便行为就是一种简单的节律性行为。这种简单性活动过程的执行需要基因和细胞的精确表达和调控。对秀丽隐杆线虫排便的活动过程的执行、周期的产生和调制,以及环境因素的影响进行了简单的综合性阐述。主要是从基因突变体上去分析了它们之间的作用及影响。     

木质素降解真菌的筛选及其对森林地表可燃物的降解效果

【目的】筛选帽儿山人工林地表可燃物中的木质素降解真菌,探究木质素降解菌对不同森林地表可燃物的分解效果,以期找到能够有效降解森林可燃物的真菌菌种,为应用生物降解方法降低森林地表可燃物载量从而降低森林火灾发生概率与森林火险指数提供理论依据和基础数据。【方法】采集东北林业大学帽儿山实验林场尖砬沟森林培育实验站的落叶松、胡桃楸、水曲柳纯林与胡桃楸-落叶松、水曲柳-落叶松混交林内的凋落叶,采用添加抗生素的麦芽浸粉(MEA)培养基进行真菌的分离培养,之后采用愈创木酚平板显色法进行初筛,根据测定菌株的显色情况及菌落圈与显色圈比值筛选高活性木质素降解酶菌株,复筛利用苯胺蓝平板脱色法对菌株木质素氧化酶系进行定性测定,对2次筛选获得的菌株进行形态学及分子鉴定,然后以胡桃楸、水曲柳、落叶松3种可燃物样品作为分解基质,接入木质素降解菌单一及混合菌液,于28℃恒温培养7 d,分别测定经培养后基质中的木质素含量,分析木质素分解规律。【结果】由MEA培养基筛选出的9株真菌有5株在PDA-愈创木酚培养基上发生了显色反应,且菌株B6和Y3的R/r <1,即该2株菌能优先降解木质素;苯胺蓝平板脱色试验结果显示菌株B6和Y3均可使培养基蓝色褪去,即均具有LiP与MnP酶活性;经形态学及分子鉴定,菌株B6为白囊耙齿菌Irpex lacteus,菌株Y3为桦褶孔菌Lenzites betulinus;地表可燃物样品降解试验结果显示,经单一菌液与两者混合菌液培养后,样品中木质素含量均有下降,且经混合菌液处理后的3种可燃物基质表现出相对较好的降解效果;3种基质降解率从高到低依次为水曲柳>胡桃楸>落叶松;菌种Y3对木质素的降解效果较菌种B6好。【结论】混合菌液对可燃物中木质素的分解能力较单一菌液强;菌株B6和Y3之间无拮抗作用,混合后产生协同效应,使木质素降解酶系活力提高,从而可提高木质素降解率;菌种Y3降解能力强于B6;可燃物样品中木质素降解效果因基质不同而存在差异,阔叶可燃物比针叶可燃物易分解。经筛选出的木质素降解菌能有效降解可燃物中的木质素,可在一定程度上减少森林地表可燃物载量,从而降低森林火灾风险。     

松材线虫纤维素酶的分离纯化及性质研究

以浙江省松材线虫病疫区马尾松样品中分离得到的松材线虫为研究对象,对其分泌物中纤维素酶的活力和酶学性质进行分析,并与试验筛选出的伴生真菌所分泌的纤维素酶进行对比。试验结果证明,两者在酶促反应最适温度、酶促反应最适pH值、金属离子对酶活力影响方面均有明显差异。     

绿僵菌Mf2菌株对松材线虫的毒力测定

为探索绿僵菌Metarhigium anisopliae Mf2菌株对松材线虫的毒杀效果,从4种常见培养基PDA,PPDA,SDAY,SMAY中选择一种最适于绿僵菌Mf2菌株营养生长及产孢的培养基,测定该菌株对松材线虫的毒杀活性。结果表明,Mf2菌株在PPDA培养基中生长速度最快,14 d后菌落直径大于其他3种培养基,为76.00 mm;培养14 d后PPDA培养基中菌株产孢量最高,为5.667×1010个孢子,显著高于其他培养基上的产孢量,约为处于第2位的PDA培养基上产孢量的2.5倍;绿僵菌Mf2菌株具有较高杀线虫活性,处理36 h后校正死亡率为98.52%。绿僵菌Mf2菌株对松材线虫毒力测定表明具有很高的毒性,有良好的应用前景。     

内寄生真菌Esteya vermicola对松材线虫侵染活力的测定

从不同培养基、不同测定方法、不同菌株、不同孢子浓度4个方面测定内寄生真菌Esteya vermicola孢子对松材线虫的侵染活力,结果表明:该真菌离体分生孢子对松材线虫有侵染活力;PDA固体培养比PDB液体培养所得孢子能更有效的粘附和杀死松材线虫;在WA平板上,采用浸渍法测定孢子对线虫的侵染活力比其他处理效果好;在供试的3个菌株(CUN 120806、CBS 10082和CBS 115803)中,CBS 115803菌株对松材线虫具有较高侵染活性;4个不同浓度(1×109、1×108、1×107、1×106个·mL-1)孢子对线虫的作用中,随着孢子浓度降低,孢子对线虫侵染能力也随之降低。     

产漆酶半知真菌Myrothecium verrucaria NF-08菌株的分离及产酶研究

[目的]采集凉水国家级自然保护区原始森林土壤样品,分离产漆酶真菌并优化产酶条件,旨在开发产漆酶半知真菌种质资源,提高漆酶产量,为微生物漆酶扩大生产提供菌种资源和条件参数.[方法]以木质素磺酸钠为唯一碳源的无机盐培养基为富集培养基,在愈创木酚-PDA选择性平板上分离产漆酶真菌.利用ABTS[2,2 ′-连氮一双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]和SGZ [4-羟基-3,5-二甲氧基一苯甲醛连氮,即丁香醛联氮]显色反应初筛和摇瓶发酵复筛.确定供试菌株后,利用形态观察结合rDNA-ITS序列分析技术,将菌株鉴定至种.以ABTS法测定供试菌发酵液漆酶活性,以Lowry法测定发酵液总蛋白含量.在考察供试菌株生长、产酶及胞外蛋白总量动态变化基础上,通过单因素试验,研究碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、培养基起始pH、装液量、接种量及底物诱导对菌株产漆酶的影响,获得菌株产酶最适培养基组分和培养条件参数.[结果]获得1株发酵周期短、初始酶活高的产酶菌株NF-08.结合形态学特征与rDNA-ITS序列分析结果,鉴定菌株NF-08属于为半知菌亚门疣孢漆斑菌.该菌株在液体发酵培养基中产漆酶活性与菌丝生长和胞外蛋白总量基本同步,发酵第6天达到酶活峰值9.28 U·mL-1.疣孢漆斑菌NF-08产酶最佳碳、氮源分别为4.0％葡萄糖和3.5％蛋白胨,培养基初始pH7.0.最适装液量60 mL·(250 mL)-1,最适接种量4％,最适培养温度和摇床转速分别为30℃和140 r·min-1.没食子酸、阿魏酸和单宁酸显著诱导疣孢漆斑菌NF-08漆酶活性的产生,以没食子酸效果最好.经过培养基组分和培养条件优化以及底物诱导,疣孢漆斑菌NF-08产酶水平达到16.82 U·mL-1,比优化前提高了81.25％.[结论]建立环境样品中产漆酶真菌的分离、纯化及筛选方法,获得了一株发酵周期短、产漆酶活力高的半知真菌疣孢漆斑菌NF-08.该菌株经单因素试验产酶条件优化效果明显,酶活水平提高显著,可为微生物发酵产漆酶提供新的菌株资源,在微生物发酵漆酶工业生产中具有应用潜力.后续对疣孢漆斑菌NF-08漆酶产生、性质及基因表达调控的深入研究,将有助于了解漆酶在半知真菌生活史中的作用及生态学功能,同时拓展半知真菌漆酶的应用领域.     

松材线虫携带细菌产生抑制真菌的物质

研究发现松材线虫携带的两株荧光假单胞菌GcM5-1A、ZM4A和恶臭假单胞菌ZpB1-2A具有抑制真菌菌丝生长的作用.首先对供试的8个细菌菌株进行抑菌活性生物测定,从中筛选出3个具有抑菌活性的细菌菌株;接着对细菌培养液及滤液、死细菌及活细菌进行生物测定;最后对细菌代谢物的性质进行生物测定.实验证明抑制真菌菌丝生长的活性成分为松材线虫携带细菌的挥发性代谢产物.     

拮抗细菌Bs-03菌株鉴定及抑菌活性测定

在土壤有益微生物的分离、筛选中获得一株拮抗细菌Bs-03,抑菌谱测定结果表明该菌对供试的多种植物病原真菌具有较强的抑菌活性,表现较为广谱的抑菌活性。通过对菌株的培养性状、形态特征、生理生化特性等试验项目,初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。采用平板对峙培养法测定Bs-03菌株抑菌活性,结果表明Bs-03对供试的14种植物病原真菌,除花生白绢病菌外,都具有抑菌活性。其中对核桃炭疽病菌、苹果轮纹病菌、黄瓜灰霉病菌、冬枣黑斑病菌效果最好,与其他处理在P0.05水平上具有显著性差异。该菌具有较好的开发应用前景。     

纤维素高效降解真菌的筛选及其降解森林地表可燃物的效果

【目的】筛选纤维素的降解真菌,探究其对森林地表可燃物的分解效果,以期利用纤维素高效降解真菌促进降解森林地表可燃物,从而降低森林火灾风险。【方法】采集东北林业大学帽儿山实验林场的兴安落叶松、胡桃楸、水曲柳和云杉人工林内的可燃物,采用孟加拉红培养基进行真菌的分离培养,采用刚果红染色法,根据测定菌株的纤维素分解指数筛选高活性纤维素酶菌株,对其进行形态学及分子鉴定;以阔叶、针叶与针阔混交可燃物碎块为分解基质,接入高活性纤维素酶菌株菌液,恒温培养80天,定期取样测定综纤维素含量,分析纤维素分解过程并筛选出对森林地表可燃物中纤维素降解效果最好的菌株;结合扫描电镜超微结构观察结果进行验证。选取筛选出的纤维素高效降解真菌菌株,制取菌饼并接入麦芽浸粉培养基中,恒温振荡培养5天,得到的菌悬液作为单一菌剂,2菌种菌悬液等体积混合为混合菌剂,分低、中、高剂量喷洒到不同样地中装有胡桃楸、兴安落叶松以及胡桃楸-兴安落叶松混交可燃物的凋落物袋内,每月采集凋落物袋测定综纤维素质量分数,分析不同菌剂对可燃物中综纤维素降解效果。【结果】根据孟加拉红氯霉素培养基筛选出的15株真菌在CMC-Na培养基上产生的水解圈大小,筛选出8株高活性纤维素酶菌株,菌株B2(枝细枝孢)的纤维素分解指数最大;根据地表可燃物样品中的纤维素降解结果,菌株A4(紧密帚枝霉)对3种可燃物基质中综纤维素的降解能力最强,其次是菌株A2(肉色隔孢伏革菌);根据扫描电镜观察结果,菌株A4的菌丝可以黏附在叶片表面并侵入叶片组织,通过分泌纤维素酶降解叶片中的综纤维素;不同剂量使可燃物基质综纤维素降解率由大到小呈现大剂量、中剂量、小剂量的规律,且施加菌剂的3种基质综纤维素降解率均高于对照;施加菌剂的3种可燃物基质综纤维素降解率由大到小均表现为:菌剂C(混合菌剂)菌剂B(菌株A4)菌剂A(菌株A2)。【结论】菌株A4为室内降解试验筛选出的高效纤维素降解真菌,在野外对地表可燃物中综纤维素也表现出较强降解能力,且与菌株A2构建的混合菌剂对可燃物中综纤维素降解效果更佳,可在后续研究中摸索其最佳产酶条件,以实现林区地表可燃物更大程度上的降解。     

竹林环境中木质素降解菌株的分离鉴定

为筛选竹林环境中较为高效的木质素降解菌,采用分析苯胺蓝和愈创木酚培养基变色情况和相关酶活大小,从浙江临安市竹林地中分离筛选出一株高效木质素降解菌27-1,根据形态学观察和ITS序列分析,确定该菌株为多孔菌科栓菌属毛栓菌(Trametes hirsuta)。     

松材线虫生防真菌伊氏线虫菌研究进展

松材线虫病对森林生态健康有显著影响,可以导致松林大面积死亡,有效预防松材线虫病是维护森林生态系统的重要措施。伊氏线虫菌是一种松材线虫的内寄生真菌,具有作为松材线虫病生物防治的天敌的潜力。近几年,对于这种鲜为人知的真菌的研究增多。本文从该菌的发现、形态学、培养、侵染机制、分子层面研究和生物防治应用等方面较系统全面地介绍该菌。伊氏线虫菌共有6个菌株,能产生月形孢子和杆状孢子2种类型的孢子,月形孢子能黏附到松材线虫体表并寄生于体内将其杀死。伊氏线虫菌能在松树和松树分泌的树脂中存活,通过产生宿主松树的香味而引诱松材线虫。培养条件对伊氏线虫菌生长、产孢、孢子侵染活力的影响较大,可以在培养基中添加甘氨酸等增强其对环境的抗性。伊氏线虫菌基因组已被完整测序,还克隆出1个对松材线虫具有强毒力的丝氨酸蛋白酶基因,同时在菌株细胞内发现内生细菌的存在,可以通过分子方法检测该菌。在温室和野外采用树干注射、树冠喷洒和伤口接种等不同方法施用含有该真菌的生防菌,均显示其能降低松材线虫对松树的侵染。目前对于该菌的研究主要集中在实验室,对于林间防治应用也有研究,但还是较少。关于该菌未来的研究可以从几方面开展:1)分子层面弄清其侵染机制;2)商品化生物制剂; 3)野外防治方案; 4)松褐天牛与伊氏线虫菌之间的关系。