菜豆细菌性萎蔫病菌16S rDNA基因克隆及TaqMan探针实时荧光PCR检测

将菜豆细菌性萎蔫病菌(Curtobacterium flaccumfaciens pv. flaccumfaciens)16S rDNA基因进行克隆测序,并依据此序列设计菜豆细菌性萎蔫病菌的实时荧光PCR引物和特异性探针,对所收集的样品进行了检测. 结果表明,该检测方法具有快速、特异、灵敏、重复性好等优点,只有菜豆细菌性萎蔫病菌产生荧光,其他细菌没有荧光产生. 检测的灵敏度为105 CFU/mL的细菌悬浮液,相对灵敏度为106 CFU/mL.     

萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种的实时荧光定量PCR检测

依据萎蔫短小杆菌糖甜菜致病变种(Curtobacterium flaccumfacienspv.beticola)的16S~23S rRNA间隔区ITS序列,设计引物CfbF/CfbR。PCR扩增3个糖甜菜叶斑菌及29个参比菌株,仅靶标菌扩增出191 bp产物。用SYRB Green I荧光染料进行实时荧光定量PCR检测,制作标准曲线,回归直线决定系数R2为0.99。整个检测过程操作便捷,仅需2 h,可灵敏、特异、定量地对该病原菌进行检测。     

玉米内州萎蔫病菌LAMP快速检测方法的建立

[目的]建立玉米内州萎蔫病菌的快速恒温扩增检测技术.[方法]利用GenBank公布的玉米内州萎蔫病菌(Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis,Cmn)16S-23S序列设计LAMP(loop-mediated isothermal amplification)引物,建立玉米内州萎蔫病菌LAMP检测体系,并对反应条件进行了优化.[结果] LAMP在内引物、环化引物和外引物比为6∶4∶1(30 pmol∶20 pmol∶5 pmol)的25山体系下64℃反应30 min为最佳反应条件,且LAMP引物能从供试的7种菌株中特异性扩增出Cmn梯度性条带.以玉米内州萎蔫病菌基因组和菌悬液梯度稀释液为模板检测LAMP体系的灵敏度,结果显示,LAMP检测体系针对基因组和菌悬液的灵敏度分别达到了50fg和3.6CFU,比普通PCR灵敏度高100倍.[结果]LAMP检测体系简单、快速、灵敏度高、特异性好,在玉米内州萎蔫病菌检测方面潜力巨大.     

番茄溃疡病菌分子检测技术

对中国三类检疫性有害生物番茄溃疡病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)进行PCR检测方法的研究。利用1对特异性引物ClaF1ClaR2,对5个番茄溃疡病菌进行特异性扩增,得到了一段长250bp的PCR产物,参试的其他棒形细菌以及其他属的植物病原细菌均无扩增产物。该检测方法特异性强、灵敏度高,在50pg的模板DNA浓度下还能检测到很强的条带。利用此引物可以检测到1×105个菌体。     

进口生牛皮中细菌的PCR-RFLP图谱建立

旨在建立存在于进口生牛皮中细菌的PCR-RFLP图谱。对从进口生牛皮中分离到的15种细菌,通过VITEK鉴定,分别进行基因组DNA提取,然后以所提取的DNA为模版,用16SrDNA的通用引物27f和1492r进行PCR扩增,扩增产物以17种内切酶,即AvaⅠ、BamHⅠ、BglⅡ、DraⅠ、EcoRⅠ、EcoRⅡ、HindⅢ、Hinf、HpaⅠ、PstⅠ、SmaⅠ、TaqⅠ、XbaⅠ、XmaⅠ、AluⅠ、XhoⅠ、PvuⅠ进行酶切,酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析,建立每种菌16SrDNA RFLP图谱。结果表明,进口生牛皮中分离到的15种细菌分别是侧芽短芽孢杆菌、产色葡萄球菌、黑色消化球菌、环状芽孢杆菌、解鸟氨酸拉乌尔菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、耐热芽孢杆菌、桥石芽孢杆菌、球型芽孢杆菌、溶血不动杆菌、少动桥氨醇单孢菌、苏云金芽孢杆菌、中间葡萄球菌和分支杆菌,除中间葡萄球菌和产色葡萄球菌外,其他13种菌均扩增出目的条带。说明,PCR-RFLP方法可以快速、可靠地分析、鉴定进口皮毛中的细菌,在进出口动物皮毛中细菌的检测方面具有一定的应用潜能。     

GFP标记的短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）转座突变株的构建初探

以水稻叶面附生菌短小芽孢杆菌(B.pumilus)为研究对象,通过构建pMOD-egfp-Tetr转座复合体,采用电击转化法对短小芽孢杆菌DX01菌株进行了Tn5转座插入诱变,获得了大量的转化子。对转化子进行了遗传稳定性分析和分子鉴定,并且在荧光显微镜下观察到了强烈的绿色荧光,研究结果表明外源DNA已经成功整合进细菌的基因组中,gfp基因在短小芽孢杆菌中实现了组成型表达。     

姜萎蔫青枯病和条斑叶枯病病原细菌的研究

从上蔡县采集上姜萎蔫青枯病病姜块和条斑叶枯病病叶分别；分离出２种不同性状的病原细菌通过形态的观察，染色反应，培养观察，生理生化反应及致病性测定，结果表明，引起生姜萎蔫青枯病病原细菌的是青枯假单胞杆菌「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ（Ｓｍｉｔｈ）Ｓｍｉｔｈ」，引起生姜萎蔫青枯病病原细菌的是青枯假单胞杆菌Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ Ｚｉｎｇｉｂｅｒｉｃｏｌａ Ｒｅｎ ａｎｄ Ｆａｎ）。     

禽多杀性巴氏杆菌、副鸡嗜血杆菌和大肠杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

为了建立鉴别禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、副鸡嗜血杆菌(Haemophilus paragallinarum)和大肠杆菌(Escherichia coli)的多重PCR检测方法,参照GenBank中登录的3种细菌基因组序列,合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立快速检测3种细菌的多重PCR方法。特异性试验结果表明,可分别扩增出3种细菌对应的目的片段,对Ⅰ群禽腺病毒4型(FAV-4)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonellaspp)、鸡胚成纤维细胞(DF-1)的DNA和灭菌双蒸水均无扩增;敏感性试验结果表明,最低检测量分别为24.3pg/μL禽多杀性巴氏杆菌、21.4pg/μL副鸡嗜血杆菌和28.6pg/μL鸡大肠杆菌的基因组DNA;应用该方法对83份临床病料进行检测,结果与其他已建立的单重PCR检测一致,说明所建立的方法可用于临床上3种细菌的鉴别诊断。     

猪鼻腔中细菌菌落PCR-DGGE引物条件优化

变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技术是最先用于DNA突变检测的一种电泳技术。为获得最佳的PCR-DGGE上样模板,本实验分别采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和Power Soil DNA Isolation Kit试剂盒抽提细菌基因组DNA,分别以Primer(338F/518R)/Primer(P2/P3)为16Sr DNA V3扩增引物,采用温度梯度PCR对引物扩增条件进行优化。结果显示:在Tm 56℃,通过CTAB法抽提细菌基因组DNA,采用primer(338F/518R)扩增16Sr DNA V3目的产物特异性最佳。     

检测禽多杀性巴氏杆菌PCR方法的建立

为禽多杀性巴氏杆菌感染提供特异、敏感的诊断方法,本研究建立了检测禽多杀性巴氏杆菌PCR方法.该方法能从禽多杀性巴氏杆菌扩增出1条460 bp的特异片段,而无法从大肠杆菌、鸭疫里氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、禽1型副黏病毒、番鸭呼肠孤病毒和鸭基因组DNA扩增出目的片段.敏感性试验显示该PCR方法最低可检测出1 ng·L-1的细菌基因DNA.     

菜豆细菌性萎蔫病菌传入中国的风险分析

从世界分布、主要寄主、经济重要性、传入可能性和风险管理难度5个方面对菜豆细菌性萎蔫病菌传入我国的风险进行评估。结果表明,该病菌是特别危险的有害生物。根据分析结果提出了非疫区输入、输出国应严格检疫、进境口岸加严检查等相应的风险管理措施。     

水稻细菌性条斑病菌的实时荧光PCR检测技术研究

 水稻细菌性条斑病是我国水稻上的检疫性病害之一。设计并筛选出特异性引物对Xoc2071F/Xoc2071R(Xoc2071),其扩增片段大小为329bp,利用SYBR GreenI荧光定量PCR方法进行水稻细菌性条斑菌的实时荧光PCR检测。结果表明,引物对Xoc2071能特异性检测到目标病原菌产生荧光信号而其他菌种不产生荧光信号。检测的灵敏度是2.25fg/μL质粒DNA和1.0×102cfu/mL的菌悬液,相当于1个细菌的基因,比常规PCR电泳检测的灵敏度高约100倍。此实时荧光PCR可以检测到仅需10g的带菌种子上目标菌的存在。     

双重PCR方法检测检疫性细菌洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌

为建立同步检测检疫性细菌洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌的双重PCR方法,根据GenBank上公布的洋葱腐烂病菌ITS序列设计1对特异性引物B3/B6,将设计的引物与已发表的检测菊基腐病菌特异性引物ADE1/ADE2结合,经过条件优化,建立了双重PCR反应体系,并进行特异性和灵敏度验证。应用双重PCR体系能从洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌基因组DNA以及人工带菌样品中扩增到特异性条带。结果表明,建立的双重PCR检测方法能同时检测出洋葱腐烂病菌和菊基腐病菌,可应用于口岸进口郁金香种球2种检疫性细菌的检测。     

应用PCR法检测向日葵茎溃疡病菌的研究

[目的]设计出向日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi M.Muntanola - Cvetkovic)的特异性引物,建立该病菌PCR快速检测方法.[方法]用真菌通用引物ITS4/ITS5对向日葵茎溃疡病菌进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆、酶切分析和测序,用DNAMAN软件设计出检测该病菌的特异性引物PHDF1和PHDF2,优化PCR反应体系.[结果]PCR反应体系为:25 mM MgCl2 2.4 μL,10 mM dNTP 0.3 μL,10 uM引物各1.5 μL,模板7 ng,最佳退火温度61.6C,建立了该病菌PCR检测方法.[结论]应用该方法检测供试的13个菌株,该对引物可以准确的将向日葵茎溃疡病菌与其他拟茎点霉属的真菌区分开来,该病菌的PCR扩增片段为326 bp.     

瘤胃甲烷生成菌PCR反应条件的优化

[目的]优化适合于瘤胃甲烷生成菌的PCR反应体系。[方法]以1．5周岁健康的藏系绵羯羊瘤胃内容物总DNA为模板,用特异性引物对甲烷生成菌16SrDNA保守序列进行PCR扩增,并通过改变PCR反应体系中的各参数,优化其PCR反应体系中的相关参数。[结果]PCR最优程序为：94℃预变性3min;94℃变性45s,51℃退火458,72℃延伸90s,35个循环;72℃后延伸7min。优化后的PCR反应体系为：5．00山缓冲液,4．00μl d-NTP,2．00μl引物（前引物和后引物各1．00μl）,4．00μl MgCl2,0．25μl TaqDNA聚合酶和1．00μl 1：100倍稀释的DNA模板,然后加水补足25．00μl。[结论]该研究为瘤胃甲烷生成菌功能的研究奠定了基础。     

2种PCR方法扩增大豆rbcS启动子5'侧翼序列比较

比较了扩增已知序列5’侧翼序列的2种PCR方法.方法一是反向PCR (IPCR),以大豆基因组酶切后的DNA片段自身环化产物做模板,用2对特异引物反向扩增大豆rbcS启动子5'侧翼序列.方法二是热不对称交错PCR(rAIL- PCR),以大豆基因组DNA为模板,用3个巢武特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环...     

应用聚合酶链反应快速检测沙门氏菌

根据沙门氏菌组氨酸转运操纵子基因序列设计引物，对沙门氏菌属A－F各群中共15株沙门氏菌标准菌株、27株沙门氏菌现场分离菌株和其他10株非沙门氏菌菌株进行聚合酶链反应（PCR）扩增，结果沙门氏菌均出现495bp特异性DNA扩增条带，所有对照均未出现特异条带，提示这对引物具有很强的沙门氏菌属特异性。PCR敏感性试验显示，该体系能检出14pg以上的沙门氏菌DNA。通过对5种不同的DNA模板提取方法的比较，选择操作简便、快速、成本低廉的热裂解法。采用该方法。采用该方法，对生鲜奶样进行检测，经与国家标准卫生检验方法相比较，两者符合率达100％。     

8种猪呼吸道和繁殖障碍病病原体GeXP检测方法的建立

【目的】建立了一种同时鉴别H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎、猪圆环病毒病、猪细小病毒病和猪伪狂犬病8种病毒性呼吸道和繁殖障碍病病原体的GeXP 高通量检测方法。【方法】根据这8种病原体的基因保守序列,设计并合成了9对特异性引物, 在每对特异性引物的5′端均加上一段通用引物,形成特异性嵌合引物。运用GeXP单重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA为模板验证引物的可行性;建立GeXP多重PCR方法,以单一病毒cDNA/DNA模板、阳性cDNA/DNA混合模板验证GeXP多重检测体系的特异性和准确性;将含猪圆环病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒靶基因的克隆质粒及体外转录的RNA（H1、H3亚型猪流感、猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟、猪日本乙型脑炎）分别梯度稀释为10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法进行单一病原体灵敏度分析;根据单一病原体的灵敏度分析结果,优化各对特异性嵌合引物的工作浓度,将含有体外转录好的6种RNA模板和3种克隆质粒等量混合,将混合物梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹拷贝/µL,运用GeXP多重PCR方法分析同时检测8种病原体的灵敏度。运用建立好的GeXP多重检测体系对23份临床样品进行检测,并与常规单重PCR进行比较,对该GeXP多重检测体系的临床应用进行评价。【结果】基于GeXP系统的单重PCR检测体系和GeXP多重PCR检测体系均能扩增出特异性片段,验证了引物的可行性、GeXP多重检测体系的特异性和准确性;GeXP多重检测体系的单一病原模板灵敏度分析结果显示,多重检测体系对单一病原体检测的下限均为10¹拷贝/µL;GeXP多重检测体系在8种病原体同时检测的灵敏度分析结果显示,多重检测体系可在10³拷贝/µL水平可同时检测到8种病原体;比较GeXP多重PCR检测方法和常规PCR方法对临床样品的检测结果,两种检测方法的检测结果相符。【结论】成功建立了基于GeXP系统的多重PCR检测体系,可以同时检测8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体;本研究建立的同时鉴别8种猪呼吸道和繁殖障碍性疾病病原体的GeXP检测方法具有高通量、特异性强和灵敏度高的特点,为猪病毒性呼吸道和繁殖障碍性疾病的分子诊断提供了新型的检测方法。     

双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立

 【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg•μL-1,在细菌数上达105 CFU•mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg•μL-1,在细菌数上达5×105 CFU•mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。