青杄分子伴侣PwTCP-1基因的克隆及表达分析

分子伴侣TCP-1在调节植物生长发育过程中具有重要作用,但在林木生长发育及对非生物逆境胁迫响应机制方面的研究较少。从青杄c DNA文库中筛选出1个分子伴侣PwTCP-1(T-complex polypeptide 1)片段,通过RACE-PCR技术获得PwTCP-1的末端序列,经过与EST序列拼接,获得PwTCP-1c DNA全长序列。使用clustalx、Mega5.0、DNAMAN和Expasy等工具对PwTCP-1的理化性质、二级结构和三级结构进行生物信息学分析。结果显示,PwTCP-1c DNA全长为2024 bp,开放阅读框1 605 bp,编码534个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子质量为59.2k Da,理论等电点为6.12,富含α-螺旋。通过RT-q PCR技术检测了PwTCP-1组织特异性表达、激素响应模式及在种子萌发过程中表达量变化。结果表明:PwTCP-1在青杄各个组织中均有表达,在花粉中表达量最高,在茎中表达量最低;PwTCP-1表达量随着种子萌发先上升,在第4天达到最高,之后缓慢下降。PwTCP-1能响应多种激素处理。油菜素内酯(brassinolide,BR)和赤霉素(gibberellin,GA)分别处理后,PwTCP-1的表达量均显著降低,而茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)处理后该基因表达量极显著升高。这些结果显示,PwTCP-1可能参与植物种子萌发过程并响应了多种激素反应过程。     

青杆分子伴侣PwTCP-1基因的克隆及表达分析

分子伴侣TCP-1在调节植物生长发育过程中具有重要作用,但在林木生长发育及对非生物逆境胁迫响应机制方面的研究较少.从青杆cDNA文库中筛选出1个分子伴侣PwTCP-1(T-complex polypeptide 1)片段,通过RACE-PCR技术获得Pw TCP-1的末端序列,经过与EST序列拼接,获得PwTCP-1 cDNA全长序列.使用clustalx、Mega5.0、DNAMAN和Expasy等工具对Pw TCP-1的理化性质、二级结构和三级结构进行生物信息学分析.结果显示,PwTCP-1 cDNA全长为2 024 bp,开放阅读框1 605 bp,编码534个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子质量为59.2kDa,理论等电点为6.12,富含α-螺旋.通过RT-qPCR技术检测了PwTCP-1组织特异性表达、激素响应模式及在种子萌发过程中表达量变化.结果表明:Pw TCP-1在青杆各个组织中均有表达,在花粉中表达量最高,在茎中表达量最低;Pw TCP-1表达量随着种子萌发先上升,在第4天达到最高,之后缓慢下降.PwTCP-1能响应多种激素处理.油菜素内酯(brassinolide,BR)和赤霉素(gibberellin,GA)分别处理后,Pw TCP-1的表达量均显著降低,而茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理后该基因表达量极显著升高.这些结果显示,PwTCP-1可能参与植物种子萌发过程并响应了多种激素反应过程.     

青杄CYP1基因的克隆与表达

以青杄(Picea wilsonii)的c DNA文库为模板,根据青杄基因Pw CYP1的EST序列设计引物,通过RACE-PCR方法获取Pw CYP1的全长c DNA序列。生物信息学分析表明:Pw CYP1全长c DNA为962 bp,编码框为516 bp组成,编码一个171氨基酸的多肽,Protparam工具预测蛋白的分子量约为17.98 k Da,理论等点为8.34。组织特异性试验表明,Pw CYP1在青杄花粉中的表达量最高,种子中最少。花粉萌发试验显示,Pw CYP1在青杄花粉萌发中表达量先下降,在后期表达量重新上调。在青杄种子萌发试验中,Pw CYP1表达量先下降,在第4天达到最低值后表达量被上调。同时,Pw CYP1受脱落酸(abscisic acid,ABA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)、赤霉素(Gibberellin,GA)、干旱和盐胁迫的诱导且表达量上调,这些结果显示Pw CYP1参与了发育及多种逆境胁迫和对激素的响应过程。     

青杄类伸展蛋白基因PwELP1的克隆及表达分析

【目的】克隆青杄类伸展蛋白(extensin-like proteins,ELPs)基因PwELP1并分析该基因的表达特性,为研究ELP基因家族的功能奠定基础。【方法】以青杄cDNA文库为模板,用RACE-PCR方法克隆青杄类伸展蛋白编码基因PwELP1的cDNA全长,利用DNAMAN确定PwELP1的编码框及蛋白氨基酸的翻译,运用clustalx软件与Espript工具进行多序列比对,利用MEGA 5软件的邻位相连法构建系统树,并对编码蛋白进行生物信息学分析;利用RT-qPCR检测PwELP1基因在青杄不同组织中表达的特异性、花粉和种子不同萌发时期及幼苗受到不同逆境处理时的表达差异,分析该基因的组织发育及逆境响应表达特点。【结果】PwELP1基因全长832bp,其编码一个由159个氨基酸组成的蛋白,该蛋白的N端与C端均有比较保守的结构域;此蛋白二级结构由1个α-螺旋、5个β-折叠与3个β-转角结构构成,对其三级结构的预测印证了这一结果,同时发现该蛋白中还存在部分无规则卷曲。其分子质量为17.03ku,理论等电点为5.81。PwELP1在青杄花粉中的表达量较高,且在花粉萌发后期(30~36h)以及种子萌发初期(第2天)表达量高;PwELP1的表达不同程度地受低温、高温、茉莉酸甲酯(MeJA)、H_2O_2、脱水以及脱落酸(ABA)等非生物逆境胁迫处理的诱导,尤其是H_2O_2、高温和ABA,处理初期表达量就显著升高。【结论】PwELP1在青杄花粉和种子萌发过程中可能发挥重要功能,并可参与青杄对非生物逆境胁迫的响应过程。     

青杄PwPEBP基因及其启动子序列的克隆与表达分析

目的通过研究青杄中的PwPEBP基因及其启动子的表达特性及生物学功能,探究PEBP基因在植物生长发育过程中响应逆境胁迫的功能及作用机制。方法本研究从青杄转录组测序中获得PwPEBP的cDNA序列,利用TMHMM、GOR4等在线软件对PwPEBP蛋白进行生物信息学分析,以此为基础通过PCR技术克隆得到PwPEBP开放阅读框（ORF）序列;同时对其在不同组织与不同逆境及激素处理中的表达水平进行了RT-qPCR技术分析;采用染色体步移法克隆PwPEBP的启动子序列,并利用在线软件BDGP和PlantCARE对PwPEBP启动子序列进行基础启动子区域、转录起始位点和顺式作用元件的预测;最后通过农杆菌瞬时转化烟草法验证PwPEBP启动子的功能。结果PwPEBP cDNA长度为1 408 bp,开放阅读框共585 bp,编码194个氨基酸。PwPEBP蛋白分子式为C₉₆₆H_{1 484}N₂₅₀O₂₉₉S₆,无信号肽和跨膜结构域,为亲水蛋白,含有25个磷酸化位点;进化树分析显示,PwPEBP蛋白与北美云杉的PEBP单独聚成一簇,属于新的PEBP蛋白。组织特异性分析显示,PwPEBP在成熟叶中表达量最高,嫩叶中表达量最低;PwPEBP在各激素及逆境诱导下均有表达,但对盐处理无响应。克隆的PwPEBP启动子序列长度为903 bp,其具有响应GA、ABA、SA、MeJA的顺式作用元件。GUS染色及Luc定量实验显示,PwPEBP启动子均能响应GA、ABA、MeJA和SA外源激素及干旱、高温、低温等逆境胁迫。结论青杄中PwPEBP基因广泛响应干旱、低温、高温等非生物胁迫,其中对干旱胁迫最为敏感,同时还参与了ABA、GA、MeJA和SA激素的信号通路。      

花生生长素响应因子基因AhARF3的克隆与表达分析

生长素响应因子(auxin response factor, ARF)是调控生长素响应基因表达和信号转导的一类转录因子,在植物生长发育的各个阶段均起重要的调节作用。本研究基于花生种子萌发前后转录表达差异分析,克隆到1个生长素响应因子基因AhARF3。序列分析结果显示,该基因的ORF区为2 115 bp,编码704个氨基酸,推测相对分子量为72.92 kD,等电点6.86。不同器官表达谱分析结果显示,AhARF3为组成性表达,茎中的表达量最高,根与花中的表达量较低且近似,干种子中最低。种子萌发过程的表达分析显示,萌发10～72 h的种子中AhARF3表达量均比干种子中极显著增加,尤其是萌发48～72 h,AhARF3的表达水平不仅比萌发前期各阶段种子中的大幅上调,与根、茎、叶、花及各发育阶段的种子相比,也具有明显的表达优势。     

青杄PwVQ1基因的克隆与表达

以青杄cDNA为模板克隆得到青杄VQ基因,命名为PwVQ1。序列分析表明,PwVQ1基因的开放阅读框为819 bp,编码272个氨基酸。生物信息学分析发现,PwVQ1编码的蛋白理论分子量为69.05 k Da,PI值为5.03,为非跨膜的亲水性蛋白。PwVQ1具有VQ家族典型的Fxxx VQx LTG结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,PwVQ1在青杄的根、茎、叶、花粉、果实、种子中都有表达,在根和叶中表达量十分显著;PwVQ1在不同逆境处理下均有响应。4℃冷胁迫下,PwVQ1的表达量在3 h时先下调,在6 h时明显上调,达到8倍左右,在12 h时表达量再次下调。42℃高温胁迫下,PwVQ1的表达量下调。在盐胁迫下,干旱胁迫和ABA处理下,PwVQ1的表达量均上调。推测PwVQ1参与干旱、ABA、高温、低温、盐胁迫等非生物胁迫的响应。     

蜻蜓凤梨AfWIN1基因的克隆及表达特性

为利用基因工程手段调控凤梨科植物生长发育奠定基础,基于转录组数据,利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术从蜻蜓凤梨中克隆APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein(AP2/EREBP)家族的1个转录因子编码序列AfWIN1,并通过在线软件预测其亚细胞定位,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析其转录本表达量,且利用染色体步移方法分离其启动子序列。结果表明:AfWIN1cDNA全长995bp,含有1个501bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码166个氨基酸残基;AfWIN1定位于细胞核的碱性亲水蛋白;AfWIN1的转录本表达量随着植株年龄的增长逐渐上调,但在花器官中表达量很低甚至检测不到;AfWIN1基因5′端上游的调控序列中包含较多响应激素的顺式元件;AfWIN1在幼株和成株心叶中对乙烯响应的方式不尽相同,可能参与蜻蜓凤梨营养生长过程,但不调控花器官发育。     

团头鲂SPATA4基因的分子克隆及表达分析

采用RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术从团头鲂精巢中克隆出精子发生相关基因4(spermatogenesis associated gene 4,SPATA4).该基因cDNA全长为1 076 bp,包括1个678 bp的完整阅读框架,编码225个氨基酸,预测的氨基酸序列的分子质量为25.72 ku,等电点为9.32.序列分析显示团头鲂SPA-TA4基因与其他脊椎动物同源性较高.荧光定量PCR结果显示SPATA4基因在受精后1～206 h期间,该基因在受精后4h和受精后28 h的表达量最高,在受精后50 h表达量最低,而在其他时期的表达水平基本一致;在所检测的10个组织中,SPATA4基因在精巢中的表达量最高.     

雌性三角帆蚌Srd5a1基因的分子鉴定和功能研究

性类固醇激素与生物生殖、配子排放以及性腺发育密切相关,Srd5a1在性类固醇激素合成过程中扮演重要角色。为了探究性类固醇激素合成相关酶基因Srd5a1对雌性三角帆蚌卵巢发育的影响,本实验应用RACE克隆得到了三角帆蚌Srd5a1全长cDNA序列,通过实时荧光定量（qRT-PCR）、原位杂交技术以及不同浓度17β-雌二醇（E2）和17α-甲基睾酮（MT）激素处理来探究Srd5a1的表达特性。结果显示,Srd5a1 cDNA全长2224 bp,包括446 bp 5′-UTR,953 bp 3′-UTR,825 bp ORF,编码274个氨基酸。Srd5a1在性腺中的表达呈二态性,在卵巢中表达量更高;Srd5a1在卵巢排放期的表达量最高,极显著高于其他各时期（p ＜0.01）。原位杂交结果显示,Srd5a1在卵巢卵母细胞、卵泡以及精巢精母细胞中有表达。不同浓度E2和MT处理24天后,Srd5a1的表达发生了变化。综上,Srd5a1可能在雌性三角帆蚌卵巢卵母细胞发育成熟和配子排放中发挥一定作用,对探索三角帆蚌性腺生长发育具有重要意义,同时为实现三角帆蚌单性化养殖提供理论参考价值。     

平邑甜茶非共生血红蛋白基因GLB1的克隆、表达及转化研究

根据GenBank上苹果GLB1基因的EST序列设计引物,利用PCR技术克隆到平邑甜茶GLB1同源基因MhGLB1（GenBank注册号：GQ423619）,该基因包含一个477bp的开放阅读框,编码158个氨基酸,分子量为17．8ku。成功构建了35S：：MhGLB1正义表达载体,并对“S以12粉”番茄进行农杆菌介导的遗传转化。荧光定量PCR结果显示,MhGLB1在根、茎、叶中均有所表达,但在根中的表达量最高;NO3-和SNP处理能够诱导根中MhGLB1的表达。     

白桦开花调控相关基因FLC、LFY和SOC1的克隆及表达分析

为研究LFY、FLC及SOC1开花调控关键节点基因在白桦花时调控中的作用,从白桦转录组数据中获得了LFY和FLC的全长cDNA序列,分别命名为BpLFY和BpFLC。获得的BpLFY基因编码区长1215 bp,编码405个氨基酸,分子量为45.3 kD。BpFLC基因cDNA编码区长627 bp,编码209个氨基酸,分子量为11.4 kD,这2个基因分别属于FLO-LFY和MADS超家族。对3个基因的启动子进行分析,发现3个基因启动子区均含有2个花粉特异表达的顺式作用元件。通过实时定量PCR对BpLFY、BpFLC及Bp-SOC1在白桦茎尖、叶片、雄花序和叶腋中表达模式的分析结果表明,BpSOC1和BpFLC在白桦各个组织部位均表达,而BpLFY只在雄花序和发育中的腋芽中表达,且在叶片中BpFLC可抑制BpSOC1的表达。     

越橘谷胱甘肽巯基转移酶基因的克隆及表达

以越橘(Vaccinium L.)品种"北陆"为试材,采用反转录PCR克隆技术成功克隆越橘谷胱甘肽巯基转移酶基因c DNA全长序列,获得一个完整的编码区c DNA序列,长为690 bp,编码229个氨基酸,将其命名为VcGSTU1(Gen Bank登录号KT601064)。经与谷胱甘肽巯基转移酶家族其他成员的氨基酸序列比对和系统进化分析,初步确定VcGSTU1属于谷胱甘肽巯基转移酶Tau家族。生物信息学分析表明,该蛋白不稳定指数为28.80,属于稳定蛋白。预测该蛋白分子量为25.499 ku,等电位点为5.68。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的GST-N-Tau和GST-C-Tau结构域。利用反转录PCR和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)2种方法分析谷胱甘肽巯基转移酶的表达模式,该基因在越橘的根、茎、叶芽、叶、花芽、绿果、粉果、蓝果、蓝果果皮、蓝果种子中均有表达,且在蓝果种子中相对表达量最高。     

星星草类萌发素蛋白基因(PutGLP2)的克隆及生物信息学分析

类萌发素蛋白是一类种子萌发相关的特异性标记,其在植物生物和非生物胁迫应答过程中起到了重要作用。本研究通过酵母cDNA文库筛选,获得全长为1 065 bp的PutGLP2基因,其5′非翻译区164 bp,开放读码框666 bp,编码221个氨基酸,3′非翻译区235 bp。利用PCR技术,克隆获得PutGLP2的ORF序列。生物信息学分析发现,PutGLP2在氨基端(N端)具有一个跨膜结构域及N端信号肽,预测定位于细胞壁或胞外间质。将PutGLP2与水稻的43种GLP蛋白进行聚类分析,发现PutGLP2属于类萌发素亚家族2成员之一,并与水稻OsGLP1-1相似性最高。本研究将为丰富植物类萌发素蛋白基因信息提供参考。     

小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基基因TaBβ-1的克隆及其在非生物胁迫下的表达特性

【目的】克隆小麦蛋白磷酸酶2A(PP2A)调节亚基(PR55)基因TaBβ-1,分析其在非生物胁迫下的表达特性,为小麦抗逆育种提供候选基因。【方法】以小麦品种旱选10号为材料,通过电子克隆和RT-PCR获得TaBβ-1的全长cDNA序列,采用生物信息学软件分析TaBβ-1及其编码蛋白TaBβ-1的序列特征,预测其功能,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术分析该基因在小麦孕穗期不同组织中、不同生育时期新叶中的表达情况,以及在PEG、NaCl、低温及外源激素ABA等非生物胁迫下的表达模式,检测不同水分条件下成株期转基因拟南芥的叶片细胞膜稳定性。【结果】获得TaBβ-1的全长cDNA序列1931bp,其开放阅读框(ORF)为1539bp。该基因编码512个氨基酸,预测TaBβ-1蛋白分子量为57.1kD,等电点为5.87,含有PP2A调节亚基的1个CDC55保守结构域、1个alpha/beta结构域、2个PR55保守结构域和6个WD重复子。TaBβ-1在小麦孕穗期的根、穗、叶中均有表达,表达量依次为根穗叶;在不同生育时期的新叶中,苗期叶片的表达量最高。TaBβ-1的表达明显受PEG、NaCl、低温以及外源ABA的诱导。【结论】小麦蛋白磷酸酶2A调节亚基家族基因TaBβ-1在小麦苗期叶片中的表达量明显高于根、穗以及其它时期的叶片;TaBβ-1参与对高渗、高盐、低温等多种胁迫以及ABA处理的应答反应,但表达模式不同;在水分胁迫条件下,转基因拟南芥比野生型具有较高的细胞膜稳定性。     

甘蔗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因Sc-SAMDC的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗(Saccharum officinarum)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因,并进行序列特征、原核表达和不同逆境胁迫下表达特性分析。【方法】通过对甘蔗茎全长cDNA文库测序和分析,获得SAMDC基因cDNA全长,命名为Sc-SAMDC,并进行序列分析。随后将编码S-腺苷蛋氨酸脱羧酶的cDNA片段克隆到原核表达载体pET29a(+)中,构建融合表达质粒,转化至Esherichia coli BL21(DE3)中进行表达。最后利用定量PCR技术分析甘蔗幼苗中该基因在不同外源胁迫下的表达特性。【结果】序列分析显示,甘蔗Sc-SAMDC基因(GenBank Accession number:GQ246459)cDNA全长1968bp,存在3个读码框(袖珍读码框tORF、上游读码框uORF和主读码框mORF),mORF长1200bp,编码399个氨基酸的SAMDC酶原,预测分子量为43.6kD,该酶原含有两个高度保守的功能结构域(酶原剪切位点和PEST结构域)。原核表达产物经SDS-PAGE表明,Sc-SAMDC以融合蛋白形式表达,相对分子量约为50kD。定量PCR分析表明,Sc-SAMDC基因在聚乙二醇(PEG)、NaCl、水杨酸(SA)和H2O2外源胁迫下表达特性不同,受PEG和NaCl的诱导,受SA和H2O2的抑制。【结论】本研究成功地克隆了Sc-SAMDC基因并在原核生物中进行了表达研究,分析了该基因的表达特性,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

鹌鹑VIPR-1的克隆、序列特征和组织表达分析

【目的】对鹌鹑血管活性肠肽1型受体（vasoacitve intestinal peptide type 1 receptor,VIPR-1）cDNA全长基因进行克隆及分析,为鹌鹑的分子育种提供基础资料。【方法】通过比较基因组学,采用RT-PCR和RACE技术,获得鹌鹑了VIPR-1 cDNA全长序列;通过生物学软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了比对;采用实时定量PCR方法检测了VIPR-1在8个组织中的表达。【结果】鹌鹑VIPR-1的cDNA全长2 427 bp,包含了1 341 bp的开放性阅读框,编码446个氨基酸;序列分析显示,克隆获得的鹌鹑VIPR-1编码区序列与鸡该编码区序列存在41个碱基的差异,造成4个氨基酸残基的不同;VIPR-1氨基酸序列与鸡、火鸡、斑胸草雀的氨基酸的一致性分别为99.1%、92.2%、88%,与其它物种的一致性在60%-78%;各物种VIPR-1蛋白进化树符合物种进化规律;VIPR-1理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,蛋白二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和β-转角构成;在N-端存在一个由22个氨基酸残基（MKSARLRVLLPLLGCLLSAASS）组成的信号肽,7个α-螺旋构成的跨膜域和C-端结构域,在跨膜域有胆固醇结合位点;在所检测的8个组织中VIPR-1 mRNA均有表达,在小肠中表达量最高。【结论】成功地克隆了鹌鹑VIPR-1 cDNA全长序列,该基因在小肠组织的表达高于其它组织,在跨膜域存在胆固醇结合位点。     

萝芙木异胡豆苷-β-D-葡萄糖苷酶(SGD)基因的克隆与分析

[目的]对萝芙木异胡豆苷-β-D-葡萄糖苷酶(SGD)基因进行克隆与分析。[方法]以萝芙木为材料,采用RACE技术,从萝芙木中克隆SGD的全长cDNA,并对其进行表达谱分析和相关生物信息学分析。[结果]萝芙木SGD基因cDNA全长1 856 bp,包含1 608 bp的开放阅读框,编码536个氨基酸,预测分子量为61 kDa,等电点pI为6.16;生物信息学分析显示,RvSGD与蛇根木SGD及长春花SGD的序列相似性分别高达90.1%和70.9%,RvSGD也具有SGD蛋白的3个保守氨基酸催化位点His-161、Glu-207和Glu-419;荧光定量PCR表明,RvSGD在树皮中表达量最高,其次是老叶、根、嫩叶和茎。[结论]RvSGD基因的克隆和功能分析有助于在分子水平上更好地了解这个基因在TIAs的生物合成中的作用,并为今后调控TIAs的生物合成提供了新的靶点。