青杄分子伴侣PwTCP-1基因的克隆及表达分析

分子伴侣TCP-1在调节植物生长发育过程中具有重要作用,但在林木生长发育及对非生物逆境胁迫响应机制方面的研究较少。从青杄c DNA文库中筛选出1个分子伴侣PwTCP-1(T-complex polypeptide 1)片段,通过RACE-PCR技术获得PwTCP-1的末端序列,经过与EST序列拼接,获得PwTCP-1c DNA全长序列。使用clustalx、Mega5.0、DNAMAN和Expasy等工具对PwTCP-1的理化性质、二级结构和三级结构进行生物信息学分析。结果显示,PwTCP-1c DNA全长为2024 bp,开放阅读框1 605 bp,编码534个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子质量为59.2k Da,理论等电点为6.12,富含α-螺旋。通过RT-q PCR技术检测了PwTCP-1组织特异性表达、激素响应模式及在种子萌发过程中表达量变化。结果表明:PwTCP-1在青杄各个组织中均有表达,在花粉中表达量最高,在茎中表达量最低;PwTCP-1表达量随着种子萌发先上升,在第4天达到最高,之后缓慢下降。PwTCP-1能响应多种激素处理。油菜素内酯(brassinolide,BR)和赤霉素(gibberellin,GA)分别处理后,PwTCP-1的表达量均显著降低,而茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)处理后该基因表达量极显著升高。这些结果显示,PwTCP-1可能参与植物种子萌发过程并响应了多种激素反应过程。     

青杄类伸展蛋白基因PwELP1的克隆及表达分析

【目的】克隆青杄类伸展蛋白(extensin-like proteins,ELPs)基因PwELP1并分析该基因的表达特性,为研究ELP基因家族的功能奠定基础。【方法】以青杄cDNA文库为模板,用RACE-PCR方法克隆青杄类伸展蛋白编码基因PwELP1的cDNA全长,利用DNAMAN确定PwELP1的编码框及蛋白氨基酸的翻译,运用clustalx软件与Espript工具进行多序列比对,利用MEGA 5软件的邻位相连法构建系统树,并对编码蛋白进行生物信息学分析;利用RT-qPCR检测PwELP1基因在青杄不同组织中表达的特异性、花粉和种子不同萌发时期及幼苗受到不同逆境处理时的表达差异,分析该基因的组织发育及逆境响应表达特点。【结果】PwELP1基因全长832bp,其编码一个由159个氨基酸组成的蛋白,该蛋白的N端与C端均有比较保守的结构域;此蛋白二级结构由1个α-螺旋、5个β-折叠与3个β-转角结构构成,对其三级结构的预测印证了这一结果,同时发现该蛋白中还存在部分无规则卷曲。其分子质量为17.03ku,理论等电点为5.81。PwELP1在青杄花粉中的表达量较高,且在花粉萌发后期(30~36h)以及种子萌发初期(第2天)表达量高;PwELP1的表达不同程度地受低温、高温、茉莉酸甲酯(MeJA)、H_2O_2、脱水以及脱落酸(ABA)等非生物逆境胁迫处理的诱导,尤其是H_2O_2、高温和ABA,处理初期表达量就显著升高。【结论】PwELP1在青杄花粉和种子萌发过程中可能发挥重要功能,并可参与青杄对非生物逆境胁迫的响应过程。     

青杄PwVQ1基因的克隆与表达

以青杄cDNA为模板克隆得到青杄VQ基因,命名为PwVQ1。序列分析表明,PwVQ1基因的开放阅读框为819 bp,编码272个氨基酸。生物信息学分析发现,PwVQ1编码的蛋白理论分子量为69.05 k Da,PI值为5.03,为非跨膜的亲水性蛋白。PwVQ1具有VQ家族典型的Fxxx VQx LTG结构域。实时荧光定量PCR分析结果表明,PwVQ1在青杄的根、茎、叶、花粉、果实、种子中都有表达,在根和叶中表达量十分显著;PwVQ1在不同逆境处理下均有响应。4℃冷胁迫下,PwVQ1的表达量在3 h时先下调,在6 h时明显上调,达到8倍左右,在12 h时表达量再次下调。42℃高温胁迫下,PwVQ1的表达量下调。在盐胁迫下,干旱胁迫和ABA处理下,PwVQ1的表达量均上调。推测PwVQ1参与干旱、ABA、高温、低温、盐胁迫等非生物胁迫的响应。     

青杆分子伴侣PwTCP-1基因的克隆及表达分析

分子伴侣TCP-1在调节植物生长发育过程中具有重要作用,但在林木生长发育及对非生物逆境胁迫响应机制方面的研究较少.从青杆cDNA文库中筛选出1个分子伴侣PwTCP-1(T-complex polypeptide 1)片段,通过RACE-PCR技术获得Pw TCP-1的末端序列,经过与EST序列拼接,获得PwTCP-1 cDNA全长序列.使用clustalx、Mega5.0、DNAMAN和Expasy等工具对Pw TCP-1的理化性质、二级结构和三级结构进行生物信息学分析.结果显示,PwTCP-1 cDNA全长为2 024 bp,开放阅读框1 605 bp,编码534个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子质量为59.2kDa,理论等电点为6.12,富含α-螺旋.通过RT-qPCR技术检测了PwTCP-1组织特异性表达、激素响应模式及在种子萌发过程中表达量变化.结果表明:Pw TCP-1在青杆各个组织中均有表达,在花粉中表达量最高,在茎中表达量最低;Pw TCP-1表达量随着种子萌发先上升,在第4天达到最高,之后缓慢下降.PwTCP-1能响应多种激素处理.油菜素内酯(brassinolide,BR)和赤霉素(gibberellin,GA)分别处理后,Pw TCP-1的表达量均显著降低,而茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理后该基因表达量极显著升高.这些结果显示,PwTCP-1可能参与植物种子萌发过程并响应了多种激素反应过程.     

青杄分子伴侣PwTCP-1基因的克隆及表达分析

分子伴侣TCP-1在调节植物生长发育过程中具有重要作用,但在林木生长发育及对非生物逆境胁迫响应机制方面的研究较少。从青杄cDNA文库中筛选出1个分子伴侣PwTCP-1(T-complex polypeptide 1)片段,通过RACE-PCR技术获得PwTCP-1的末端序列,经过与EST序列拼接,获得PwTCP-1 cDNA全长序列。使用clustalx、Mega5.0、DNAMAN和Expasy等工具对PwTCP-1的理化性质、二级结构和三级结构进行生物信息学分析。结果显示,PwTCP-1 cDNA全长为2 024 bp,开放阅读框1 605 bp,编码534个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子质量为59.2 kDa,理论等电点为6.12,富含α-螺旋。通过RT-qPCR技术检测了PwTCP-1组织特异性表达、激素响应模式及在种子萌发过程中表达量变化。结果表明:PwTCP-1在青杄各个组织中均有表达,在花粉中表达量最高,在茎中表达量最低;PwTCP-1表达量随着种子萌发先上升,在第4天达到最高,之后缓慢下降。PwTCP-1能响应多种激素处理。油菜素内酯(brassinolide,BR)和赤霉素(gibberellin,GA)分别处理后,PwTCP-1的表达量均显著降低,而茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)处理后该基因表达量极显著升高。这些结果显示,PwTCP-1可能参与植物种子萌发过程并响应了多种激素反应过程。      

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的c DNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因c DNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

东南景天耐镉相关基因SaFer的克隆与功能初步分析

铁蛋白(ferritin)是一种专门存储铁的重要胁迫相关蛋白,参与镉离子吸收的调控。从构建的东南景天Sedum alfredii c DNA文库中筛选出东南景天Ferritin基因c DNA全长,命名为Sa Fer,编码序列为1 117 bp,开放阅读框为759 bp,编码252个氨基酸。以东南景天基因组DNA为模板分离到Sa Fer基因组序列,长度为1 702 bp,含有7个内含子。氨基酸序列同源性分析表明:Sa Fer与苹果Malus domestica Ferritin亲缘关系最近,同源性高达76%。实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)分析发现:根系中Sa Fer基因在镉胁迫12 h后表达显著上调。镉胁迫实验显示,转基因拟南芥Arabidopsis thaliana比野生型有更高的耐镉胁迫能力。Sa Fer基因的分离及其初步功能验证为研究东南景天耐镉机制和林木耐镉转基因育种提供了理论依据。     

黄瓜耐低氮相关基因CsAOC3的克隆及表达分析

从黄瓜叶片中分离获得1个丙二烯氧化物环化酶基因,命名为CsAOC3。该基因c DNA全长为753 bp,编码250个氨基酸,与甜瓜的丙二烯氧化物环化酶(AOC)序列同源性最高。通过荧光定量PCR(qRT-PCR)分析发现,CsAOC3在低氮胁迫条件下只有在耐低氮黄瓜品系D0328中的表达量明显上调,在耐低氮能力弱的黄瓜品系D0422中的表达量并无明显变化。研究结果可为黄瓜耐低氮的基因功能研究提供理论依据。     

斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因的克隆及氨氮胁迫对其时空表达的影响

根据本实验室构建的斑节对虾(Penaeus monodon)c DNA文库得到的EST序列,利用RACE技术获得了斑节对虾谷氨酰胺合成酶基因(Pm GS)的c DNA全长序列,进行了相关生物信息学分析,在此基础上采用荧光定量的方法研究了Pm GS基因在斑节对虾不同组织、氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 420bp,开放阅读框(ORF)为1 086 bp,3'非编码区(UTR)为294 bp,包括含有27个碱基的poly(A)尾,5'非编码区(UTR)为40 bp。ORF可编码361个氨基酸,预测分子量为40.423 ku,理论等电点为6.19。序列含有一个谷氨酰胺结合结构域(Gln-synt_C),8个磷酸化位点,2个糖基化位点。斑节对虾和中国明对虾的GS基因的相似性最高,达99%。Pm GS-mRNA在斑节对虾各组织中都有表达,在淋巴组织中表达量最高,其次为鳃组织,在胸神经中的表达量最低。96 h高浓度氨氮胁迫后,Pm GS-mRNA在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组,但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P0.05)。以上结果暗示,Pm GS在氨氮代谢方面具有重要的作用,可能参与了斑节对虾机体的急性氨氮胁迫应答反应。     

甘蓝型油菜BnTIR1基因的克隆和表达特征分析

植物的转运抑制应答因子1(transport inhibitor response 1,TIR1)作为生长素的受体,在生长素信号的感知与转导过程中发挥重要作用。采用RACE技术从中双9号中克隆了甘蓝型油菜BnTIR1全长c DNA序列和基因组序列。BnTIR1的DNA序列为2 502 bp,包含2个内含子;c DNA序列为2 355 bp,ORF为1 824 bp,其编码蛋白含607个氨基酸。预测发现,BnTIR1蛋白存在AMN1保守结构域。qRT-PCR结果表明,BnTIR1在甘蓝型油菜根、茎、叶、芽、花、角果中均有表达,但表达水平不同,在叶中表达水平最高,花中最低;干旱和ABA均可诱导BnTIR1表达,暗示其可能参与植物逆境胁迫响应过程。     

鹅VNN1基因的克隆及组织表达分析

[目的]Vanin是一种泛酰巯基乙胺酶,在脂类代谢中发挥重要作用。本试验目的是扩增鹅Vanin基因亚型(VNN1)基因的c DNA序列,检测VNN1基因在鹅不同组织中m RNA水平的表达规律。[方法]以太湖鹅(Anser anser)肝脏总RNA为模板,采用RT-PCR和快速扩增c DNA末端(RACE)方法克隆鹅VNN1基因全长c DNA序列,并运用多种生物信息学软件对其进行分析,应用实时荧光定量PCR(q PCR)技术检测VNN1基因在不同组织的表达情况。[结果]序列分析表明:鹅VNN1基因(Gen Bank登录号:KY399733)c DNA全长1 924 bp,包含1 476 bp的开放阅读框,35 bp的5'UTR和417 bp的3'UTR,共编码491个氨基酸。经预测鹅VNN1基因编码的蛋白质由7 646个原子组成,相对分子质量为54 870.61,理论等电点为5.23,是不稳定蛋白。在线预测发现鹅与鸭的VNN1蛋白三级结构呈现高度相似的螺旋和折叠。序列分析表明,鹅与绿头鸭的VNN1基因核苷酸及氨基酸同源性较高。系统进化树分析表明,鹅与绿头鸭亲缘关系较近。q PCR结果表明,鹅VNN1基因在肝脏的表达量显著高于小肠、肾、脾和肺(P0.01)。[结论]获得鹅VNN1基因的全长c DNA序列,该基因在肝脏中高表达。     

棘孢木霉ACCC30536葡聚糖酶基因的克隆及表达

以棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ACCC30536菌株为试材,采用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆获得葡聚糖酶GH71基因的全长c DNA序列。结果表明:此基因的c DNA编码区序列全长1 296 bp,编码区可编码431个氨基酸。经Blast P相似性分析,其属于GH99~GH71超家族,与深绿木霉(T.atroviride)氨基酸序列XP_013941146的同源性最高,达到94%。7种不同诱导条件下,GH71基因的表达量变化明显。在2种病原菌细胞壁的诱导下,GH71基因的表达均呈先上升后下降又上升的趋势,在培养的12 h时达到最大值,分别为未诱导时的24.3倍和23.9倍。而在这2种病原菌发酵液的诱导下,GH71基因的表达均呈先下降后上升的趋势。在山新杨茎与叶的诱导下,GH71基因的表达量在24 h最大,分别为未诱导的25.4倍和25.2倍;在山新杨根的诱导下,GH71基因的表达量在48 h达到最大,是未诱导的28.1倍。     

人参CYP716A53v2基因的克隆与序列分析

研究人参皂苷生物合成途径中的影响因子。以五年生人参根组织为试验材料,提取总RNA,反转录合成c DNA的第1条链,利用PCR法对人参中的原人参三醇合成酶(CYP716A53v2)基因的c DNA进行克隆及序列分析。获得CYP716A53v2基因全长片段为1 506 bp,开放阅读框长1 410 bp,编码470个氨基酸多肽。生物信息学分析显示,CYP716A53v2基因编码蛋白质不含跨膜区域。说明CYP716A53v2基因与其他植物氨基酸序列具有较高同源性,其中与人参、西洋参、三七同源性分别为99%、98%、98%。     

鹅Apo A1,CD36和DGAT2基因的cDNA克隆与序列分析

利用RACE技术,克隆获得了鹅Apolipoprotein A-1(Apo A1),Fatty acid translocase(CD36)和Diacylglycerol O-acyltransferase 2(DGAT2)基因的c DNA序列,包括全长的编码区序列(coding sequence,CDS)。结果表明,获得的鹅Apo A1基因的c DNA序列长度为1 106 bp(Gen Bank accession:KF460562),包括135 bp的5’UTR(untranslated region,UTR)序列,795 bp编码区和176 bp的3’UTR序列,编码265个氨基酸。获得的鹅CD36基因的c DNA序列长度为2 262 bp(Gen Bank accession:KF460563),包括196 bp的5’UTR序列,1 416bp编码区和650 bp的3’UTR序列,编码472个氨基酸。获得的鹅DGAT2基因的c DNA序列长度为1 341 bp(Gen Bank accession:KF460564),包括93 bp的5’UTR序列,1 077 bp编码区和171 bp的3’UTR序列,编码359个氨基酸。同源性分析结果表明,鹅这3个基因c DNA与鸭的同源性最高,达到90%以上,与人等哺乳动物的同源性均较低。     

红鳍东方鲀gsdf基因的克隆及表达模式分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes的性别决定因子(gonadal soma derived factor,GSDF),利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆了红鳍东方鲀gsdf基因(Trgsdf)的c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR914667)。结果表明:Trgsdf c DNA序列全长为1734 bp,其中5'端非编码区144 bp,开放阅读框648 bp,3'端非编码区942 bp,共编码215个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为19个氨基酸的信号肽和相同长度的跨膜区,1个N-糖基化位点NST,1个TGF-β家族成员特有的保守结构域;BLAST同源性分析结果显示,红鳍东方鲀GSDF氨基酸序列与其他鱼类的相似性为26%~58%;系统发育分析结果显示,鱼类GSDF单独聚为一支,与TGF-β超家族内的其他成员分开,红鳍东方鲀与青鳉Oryzias latipes GSDF的亲缘关系最近,先聚为一支,后与三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus聚在一起,与矛尾鱼Latimeria menadoensis的GSDF亲缘关系最远;应用RT-PCR技术检测Trgsdf mRNA在雌性和雄性红鳍东方鲀成鱼不同组织中的表达,结果显示,Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表达,在皮肤和肌肉组织中微量表达,在其他组织中无表达;采用相对实时荧光定量PCR方法比较了成鱼卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表达量,结果显示,Trgsdf mRNA在精巢中的表达量显著高于卵巢(P0.05),约为卵巢表达量的6倍。研究表明,gsdf基因可能在红鳍东方鲀的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

东南景天捕光叶绿素a/b结合蛋白基因SaLhcb2的分离及功能

LHCB基因对植物适应各种环境胁迫的过程中起着重要作用。序列分析显示:东南景天Sedum alfredii的SaLhcb2基因全长929 bp, 其中开放阅读框(ORF)为798 bp, 含有1个74 bp的内含子。通过蛋白序列比对, SaLhcb2基因编码的蛋白与多种植物的蛋白序列同源性都很高(92%以上)。分析400 μmol·L-1镉离子(Cd2+), 铜离子(Cu2+)和铅离子(Pb2+)胁迫处理后的东南景天, 结果显示:镉处理后SaLhcb2基因在茎、叶中表达量快速上升(12.0 h内), 根中表达量到48.0 h后才上调。铜处理后0.5 h根中表达显著上调, 胁迫6.0 h后茎中表达量显著上调, 随后一直降低, 叶片中该基因表达量一直较低。铅处理后, 根中表达量降低, 96.0 h左右比对照略微上调, 而茎中96.0 h内表达量相比对照都上调, 叶片中96.0 h内都降低。研究结果表明:SaLhcb2与东南景天的镉、铜、铅胁迫抗性有密切的相关性。     

桑树AKR2A伴侣蛋白基因的克隆及分析

通过RACE等生物学技术,从桑叶中克隆获得AKR2A同源基因。c DNA全长1 488 bp,ORF长为1 050 bp,编码349个氨基酸。编码蛋白预测分子量为37.31 ku,等电点4.43;富含螺旋结构,与同类蛋白同源性较高。盐胁迫后AKR2A在根组织中表达量上升,在不同桑树品种叶片中表达丰度存在差异。     

花生热激蛋白AhHSP70与热激因子AhHSF基因的克隆及表达分析

热激蛋白(heat shock proteins,HSPs)和热激转录因子(heat shock factors,HSFs)在植物热胁迫信号转导和耐热性的产生过程中发挥了重要作用。本研究从花生转录组文库中筛选到HSP70、HSF的c DNA片段,通过序列比对在花生全基因组序列中获得这两个基因的基因组序列,根据序列信息设计引物,以花生叶片c DNA为模板扩增全长ORF并进行生物信息学分析。结果显示,Ah HSP70基因的ORF全长为1 962 bp,编码653个氨基酸,分子质量为71.45 k D,理论等电点p I为4.93;Ah HSF基因的ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸,分子质量为46.03 k D,理论等电点p I为4.85。Ah HSP70与Ah HSF均不具有信号肽,为可溶性蛋白,二级结构中有大量无规则卷曲。利用这两个基因的氨基酸序列分别与来源于其他物种HSP70、HSF的氨基酸序列进行同源比对,并构建进化树进行亲缘关系分析,结果表明,Ah HSP70与大豆Gm HSP70亲缘关系较近,与番茄Sl HSP70亲缘关系比较远;Ah HSF与菜豆Pa HSF亲缘关系较近,而与蒺藜苜蓿Mt HSF的亲缘关系较远。利用实时荧光定量PCR对Ah HSP70和Ah HSF在热胁迫情况下的表达进行分析,结果表明这两个基因在42℃高温条件下表达量显著升高,Ah HSP70在高温胁迫3 h后表达明显升高,热处理24 h和48 h后,表达量为对照的50倍和135倍;转录因子Ah HSF在高温胁迫3 h后表达明显升高,高温处理6 h后达到最高,随后下降。本研究初步验证了花生热激蛋白和热激因子基因在花生响应高温胁迫中的作用。     

深绿木霉1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶基因的克隆及表达

以深绿木霉(Trichoderma atroviride)ACCC30153为试材,应用聚合酶链式反应(PCR)技术克隆获得1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶ACCD基因的c DNA全长。结果表明:此基因的c DNA编码区序列全长1 083 bp,编码区可编码360个氨基酸。经Blast P相似性分析,其属于Try-synth-beta-Ⅱ家族,与里氏木霉(T.reesei)氨基酸序列XP-006967764的同源性最高,达到91%。在5种不同诱导条件下,ACCD基因的表达量均有明显变化。在C、N饥饿培养基中分别培养8 h与16 h时,ACCD基因表达量达到最大值,为未诱导时的22.7倍与22.4倍;在山新杨叶粉与茎粉的诱导下,ACCD的表达量分别在培养的24 h与2 h达到最大,为未诱导的22.6倍与27.3倍。     

火龙果HuABAR的克隆、生物信息学分析及亚细胞定位

在前期利用SSH筛选到抗旱相关基因HuABAR的Unigene序列的基础上,进行了HuABAR的全长cDNA克隆、生物信息学分析及亚细胞定位。结果表明:HuABAR基因cDNA全长为1 239bp,5′-UTR为264bp,3′-UTR为414bp,完整开放阅读框(ORF)共561bp,编码187个氨基酸;生物信息学分析显示,HuABAR基因编码蛋白具有典型的SRPBCC结构域,并与PYR1/PYLs(pyrabactin resistance 1/PYR1like)家族具有较高的相似性;HuABAR在干旱、高温(42℃)和低温(4℃)等逆境胁迫下显著上调表达,并在干旱胁迫5d、高温3d时表达量最高,低温处理5d内,表达量持续上升;通过PEG介导法瞬时转化拟南芥原生质体进行亚细胞定位分析,发现该基因定位于细胞质,与已报道的其他PYR1/PYLs家族基因一致。因此,HuABAR基因可能在火龙果干旱胁迫应答中发挥重要作用。