甘蓝型油菜湿害相关基因BnLDH-1的克隆和表达分析

采用RACE技术从中双9号中克隆了甘蓝型油菜BnLDH-1基因全长cDNA序列和基因组序列。BnLDH-1基因的DNA序列为1 432 bp,包含1个内含子;cDNA序列全长1 319 bp,含有1个1 053 bp的ORF,其编码蛋白含350个氨基酸。经预测发现,BnLDH-1蛋白存在LDH-1保守结构域。qRT-PCR结果表明,湿害诱导BnLDH-1表达,但在不同耐湿性甘蓝型油菜品种中,BnLDH-1的诱导表达水平不同。相关分析表明,湿害胁迫后48 h的BnLDH-1表达量与12份测试的甘蓝型油菜材料的耐湿指数呈显著负相关,其相关系数为0.73。     

高油酸含量甘蓝型油菜BnaLCR78基因的克隆、表达及过表达载体的构建

【目的】BnaLCR78是一个来源于甘蓝型油菜的候选基因,实验主要探究其与种子脂肪酸积累相关性。【方法】利用同源克隆获得BnaLCR78基因片段,使用定量PCR技术检测其表达特征并构建其植物表达载体。【结果】获得了长度为376 bp的基因组序列,与油菜基因组数据库中预测的一个类防御素(defensin-like protein)核苷酸水平上的同源性达到98%,属于LCR(low-molecular-weight cysteine-rich)基因家族。从高油酸材料中,获得2种长度分别为376和237 bp的BnaLCR78基因的c DNA序列,证明该基因转录中存在可变剪切。BnaLCR78可在油菜茎内表达,在叶和根中表达量很低,在脂肪酸积累期的表达量显著高于前期。BnaLCR78预测蛋白序列含保守的半胱氨酸位点,具备特异性识别SLR1分泌蛋白的SLG-BP结构域。【结论】推测BnaLCR78基因参与了油菜种子脂肪酸积累。     

芸薹属植物MYBL2基因的克隆及其在A、B、C基因组中的PCR鉴别

【目的】MYBL2负调控拟南芥花青素和原花青素的生物合成。从芸薹属6个物种的不同叶色材料中克隆MYBL2基因,分析其序列和表达模式,探究其在芸薹属植物花青素生物合成途径中的功能,为油菜的品质、抗逆性、观赏性等性状改良提供参考。【方法】以芸薹属6个物种19份供试材料的总DNA为模板,同源克隆MYBL2基因,并进行多序列比对和进化树分析;对白菜、甘蓝型油菜、芥菜型油菜以及埃塞俄比亚芥的紫叶材料进行遮光处理,结合转录组和qRT-PCR分析MYBL2基因表达水平;对甘蓝、甘蓝型油菜、芥菜型油菜以及埃塞俄比亚芥紫、绿叶材料进行qRT-PCR分析MYBL2基因表达水平;根据克隆MYBL2-1和MYBL2-2序列的核苷酸变异位点设计特异性引物,开发能够区分MYBL2基因组来源的PCR标记。【结果】克隆获得MYBL2-1和MYBL2-2各9个同源基因共56个拷贝。其中,BcaMYBL2-1为首次获得,BcaMYBL2-1编码区序列全长为867 bp,包含2个内含子,分别为168和102 bp,编码198个氨基酸,分子量为22.69 kD,等电点（pI）为8.72。序列比对和进化分析表明,BcaMYBL...     

芸薹属物种（B. napus,B. oleracea,B. rapa） MAPK1家族的克隆、进化和表达特征

【目的】克隆甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1家族,分析3个物种MAPK1转录表达器官特异性。【方法】在电子克隆的基础上,利用RACE（rapid amplification of cDNA ends）技术获得3个物种MAPK1全长cDNA序列和gDNA序列。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析3个物种MAPK1家族的器官特异性表达特征。【结果】从甘蓝型油菜、甘蓝和白菜中克隆了MAPK1家族共4个成员基因BnMAPK1-1、BnMAPK1-2、BoMAPK1和BrMAPK1,它们的gDNA长度为2 512—2 525 bp,均有3个外显子和2个内含子,最长标准mRNA为1 599—1 620 bp,ORF均为1 100 bp。系统进化分析表明,甘蓝型油菜MAPK1家族来自于甘蓝和白菜MAPK1之和,其中,BnMAPK1-1对应于BoMAPK1,BnMAPK1-2则对应于BrMAPK1。qRT-PCR结果显示3个物种MAPK1在所有检测器官中均有表达,但器官特异性在种间差异显著,暗示快速进化。【结论】克隆了甘蓝型油菜、甘蓝和白菜MAPK1的全长cDNA序列和gDNA序列,支持甘蓝和白菜通过天然种间杂交形成异源四倍体物种甘蓝型油菜的假说,芸薹属MAPK1基因和蛋白在序列和结构上非常保守,但转录表达的器官特异性上进化极快,近缘种间差异显著。     

甘蓝型油菜FAD2基因调控序列的克隆及瞬时表达分析

油酸去饱和酶FAD2（fatty acid desaturase 2）是广泛存在于植物中的一种能催化油酸脱氢生成亚油酸的还原酶。根据GenBank上已知的甘蓝型油菜FAD2基因设计引物,以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）叶片总DNA为模板,进行TAIL-PCR扩增,获得约1.4 kb片段并测序。序列比对结果说明该片段为已知的FAD2基因编码区上游序列。将该片段进行不同长度的5′端缺失,并用缺失后的序列替换pBI221-LUC质粒上的CaMV35S启动子,构建了甘蓝型油菜瞬时表达载体,进行油菜原生质体瞬时表达的初步研究,结果表明该序列5′端-669 bp至-1019 bp对报告基因表达水平有较大的影响。结合启动子预测分析结果,此片段中可能存在的赤霉素应答元件、光调控元件等顺式作用元件对FAD2基因的表达调控具有重要作用。     

春性甘蓝型油菜FCA同源基因可变剪接体的克隆及表达研究

【目的】克隆特早熟春性甘蓝型油菜的FCA同源基因(sBnFCA)及其可变剪接体,并分析该基因的表达模式。【方法】根据拟南芥和芸薹属植物FCA基因的DNA序列和cDNA序列设计引物,用PCR和RT-PCR技术克隆特早熟春性甘蓝型油菜"86号"的FCA同源基因(sBnFCA)及其可变剪接体,对克隆基因及编码蛋白序列进行生物信息学分析,构建系统进化树,并用qRT-PCR技术检测sBnFCA基因在不同发育时期根、茎、叶、茎尖中的表达量。【结果】克隆出了sBnFCA基因的全长序列(8 827bp),得到了sBnFCA-γ可变剪接体及一个新的可变剪接体(sBnFCA-5),新的可变剪接体在GenBank中的登录号为KJ701579.1。sBnFCA-5剪接体的CDS全长1 986bp,编码662个氨基酸残基,其推导的氨基酸序列具有2个保守的RRM结构域和1个WW结构域。生物信息学分析显示,sBnFCA-5与已报道甘蓝型油菜BnFCA-γ(AF414188.1)的相似性达99%,与拟南芥FCA-γ的相似性达87%。sBnFCA-5比sBnFCA-γ少了172个碱基序列,是一个跨外显子剪接体。sBnFCA蛋白相对分子质量和理论等电点分别为72.5ku和9.2。基因表达模式分析显示,sBnFCA-γ和sBnFCA-5在苗期、蕾期、花期的根、茎、叶和茎尖组织中都有表达,sBnFCA-γ在蕾期茎尖和花期叶片中表达量较高,sBnFCA-5在蕾期茎尖和花期叶片中表达量极高。【结论】克隆的sBnFCA-5为甘蓝型油菜sBnFCA基因的一个新的可变剪接体,该基因在春性特早熟甘蓝型油菜开花调控中可能有着重要的调节作用。     

甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体构建

[目的]为研究质体定位的乙酰辅酶A羧化酶转化叶绿体奠定基础。[方法]根据GeneBank上的甘蓝型油菜的叶绿体DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增获得与甘蓝型油菜叶绿体基因组可发生同源重组的DNA片段,构建甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体,并在大肠杆菌中通过平板定性分析和Western印迹对所构建载体上的表达盒进行功能鉴定。[结果]以甘蓝型油菜的叶片叶绿体基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得4 357 bp的DNA片段,包含2个开放阅读框RbcL和β-CT。成功构建了甘蓝型油菜叶绿体多顺反子单交换表达载体pHBM720,而且同一多顺反子的3个基因均在大肠杆菌中得到表达。[结论]该叶绿体多顺反子单交换表达载体具有较强的通用性与安全性,比双交换表达载体更具优越性。     

甘蓝型油菜△12-脂肪酸脱氢酶基因(BnFAD2)cDNA序列的克隆及其对烟草的转化

通过PCR方法从甘蓝型油菜基因组DNA中克隆出△12-脂肪酸脱氢酶基因BnFAD2的cDNA序列,全长1155bp,编码384个氨基酸,测序结果表明该基因与GenBank已登录的甘蓝型油菜FAD2基因(AF243045)的相似性为99%.将其克隆到植物表达载体pZP212上,利用农杆菌介导法转化烟草NC89品种,经卡那霉素筛选和PCR鉴定,得到阳性植株15棵.     

甘蓝型油菜R2/R3型MYB转录因子BnPAP2a介导花青素累积研究

【目的】探讨甘蓝型油菜R2/R3型MYB转录因子BnPAP2a对花青素累积的作用,为富含花青素油菜的培育提供理论指导。【方法】在全基因组水平系统鉴定甘蓝型油菜PAP1、PAP2亚家族R2/R3型MYB转录因子同源基因。利用BnTIR网站、BRAD网站和GSDS等软件对鉴定所得基因的结构、蛋白序列和组织表达谱进行分析。采用RT-PCR方法从“中双11”cDNA中扩增BnPAP2a基因,并构建35S启动子驱动的植物表达载体35S-pHZM27-BnPAP2a-mGFP,将其转染拟南芥,用显微成像法进行转基因株系种子与幼苗花青素累积表型分析;采用分光光度法测算转基因株系幼苗花青素水平;采用荧光成像技术考察转基因株系中BnPAP2a的亚细胞定位。【结果】成功地在甘蓝型油菜中鉴定到9个PAP1、PAP2亚家族R2/R3型MYB转录因子同源基因,分别为BnPAP1a,BnPAP1b,BnPAP1c,BnPAP1d,BnPAP1e,BnPAP1f,BnPAP1g,BnPAP2a,BnPAP2b。基因结构分析结果显示,拟南芥、白菜、甘蓝和甘蓝型油菜的MYB转录因子同源基因大都含有3个外显子和2个内含子。基因组织表达谱分析表明,BnPAP2a在叶片、花、花蕾、果荚中均有表达但其表达水平不高。成功构建了35S-pHZM27-BnPAP2a-mGFP载体,转染后获得了转基因拟南芥植株。过量表达BnPAP2a基因可使拟南芥种皮由黄褐色转变成紫黑色,幼苗叶片由绿色变为紫色,花青素含量极显著增加。激光共聚焦显微镜下观察发现,过表达BnPAP2a植株GFP荧光信号主要集中在细胞核中。【结论】BnPAP2a为功能性的细胞核定位R2/R3型MYB转录因子,具有促进花青素形成的作用,可利用其培育富含花青素的油菜新材料。     

白桦扩展蛋白基因的克隆分析及植物表达载体构建

从白桦中分离了4条扩展蛋白家族基因全长c DNA序列和2条大于400 bp的部分c DNA序列,命名为Bp EXP1~Bp EXP5和Bp EXPL,其中4个全长c DNA推导蛋白氨基酸残基数为186~258个,编码蛋白的分子量为20.07~27.80 k Da,理论等电点为5.57~9.20。氨基酸序列分析结果表明:5个alpha-expansin序列有共同的结构特征,即在N-末端有8个保守的半胱氨酸残基的丰富域,C-末端有4个保守的色氨酸残基的丰富域,中间有1个组氨酸功能域。利用Real time RTPCR分析EXP家族基因在白桦不同器官和组织内的表达模式,结果表明:6个EXP基因在白桦的不同器官和组织中有着不同的表达水平,其中Bp EXP1在分生木质部中表达量最高,推测其与木材形成过程的细胞壁修饰相关;Bp EXP3在发育的蒴果中表达量最高,推测其与果实和种子发育过程中的细胞壁修饰相关。最后选择Bp EXP1和Bp EXPL基因,构建了pROKⅡ-Bp EXP1和pROKⅡ-Bp EXPL植物表达载体。     

茄子生长素响应因子SmARF8的克隆与分析

 【目的】克隆茄子生长素响应因子新基因,为研究茄子果实形成发育的分子机制提供依据。【方法】采用RT-PCR 和RACE 技术克隆茄子ARF家族相应基因的cDNA全长序列。经序列联配进行与其它物种同源基因的保守域和进化关系分析。实时定量PCR 检测目的基因在茄子不同组织中的表达情况。【结果】将该基因命名为SmARF8,它的cDNA序列全长为3 671 bp,编码阅读框全长2 676 bp。氨基酸序列分析表明,SmARF8蛋白拥有核定位序列,蛋白质结构具有ARF家族的N-端DNA结合域,中间脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸残基富集的非保守调控域,C-末端蛋白互作域。氨基酸与拟南芥的调控单性结实基因ARF8相似性较高,进化树分析表明它们聚集在一个分支上,进化关系非常密切。SmARF8基因在幼果中表达最强,在根、茎、叶、花蕾、花朵及成熟果实中表达较强烈。【结论】从茄子中克隆得到一个生长素响应因子家族基因SmARF8。     

牙鲆Toll样受体1基因全长cDNA的克隆及特征分析

[目的]克隆牙鲆TLR1(Toll like receptors)全长基因,并对其结构特征和表达规律进行分析。[方法]采用同源克隆和快速扩增cDNA末端技术,从牙鲆头肾组织中克隆出TLR1基因cDNA全长序列,并对该基因进行生物信息学和表达模式分析。[结果]牙鲆TLR1基因cDNA全长2 947 bp,开放阅读框(ORF)2 418 bp,编码805个氨基酸,包括26个氨基酸组成的信号肽、2个跨膜区、6个富含亮氨酸重复结构域(LRR)和一个TIR结构域(Toll/interleukin(IL)-1 receptor)。该蛋白的分子量为91.15 kDa,等电点为6.49。氨基酸序列同源性分析显示,牙鲆TLR1基因与其他脊椎动物的TLR1基因序列全长同源性达到69%～35%,TIR序列的同源性达到84%～62%。在系统发生树上牙鲆的TLR1基因首先与斜带石斑鱼聚类。通过荧光定量qRT-PCR检测,结果显示牙鲆TLR1基因的mRNA主要表达于肝脏、心脏和脾脏等组织。[结论]该研究结果为进一步研究TLR1基因的功能和开发牙鲆免疫增强剂奠定了基础。     

苎麻BnbZIP1转录因子基因的克隆与表达特征分析

【目的】克隆苎麻转录因子基因BnbZIP1,分析其序列及表达特征,同时进行原核表达以及亚细胞定位分析。【方法】根据苎麻转录组测序中的Unigene48047片段序列,采用RT-PCR结合RACE技术克隆该基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用Real-time PCR分析该基因在不同组织和不同胁迫条件下表达特征;构建原核表达载体,进行原核表达;构建含EGFP的融合表达载体,观察其亚细胞定位情况。【结果】苎麻BnbZIP1的cDNA全长为2 071 bp,开放读码框为1 407 bp,编码468个氨基酸,推导该多肽的等电点和分子量为7.12和51.57 kD,与毛果杨（XP_002307972）的bZIP基因氨基酸序列的相似性最高,达到93%;IPTG诱导产生的重组蛋白相对分子量约为52 kD,与理论值一致;亚细胞定位分析表明其定位在细胞核中;荧光定量PCR分析表明,该基因在苎麻根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达,其中,在雄花中表达最高,在根中表达最低,且该基因受ABA、干旱和高盐诱导上调表达。【结论】获得了BnbZIP1的全长cDNA序列,其编码蛋白具有植物bZIP转录因子典型的结构域,且该基因响应ABA、干旱和高盐逆境胁迫,预示该基因可能在植物抗逆反应中发挥着重要的调控作用。     

The Structure and Sequence Analysis of TLR4 Gene in Cattle

Toll-like receptor 4 （TLR4） is essential for initiating the innate response to lipopolysaccharide （LPS） from Gram-negative bacteria by acting as a signal transducting receptor. In order to help in investigating TLR4 as a candidate disease-resistance gene in cows, we isolated the cDNA （GenBank accession no. DQ839566） by RT-PCR and rapid amplification of cDNA ends （RACE） experiments and analyzed the sequence characters by bioinformatics. The results showed that cattle TLR4 gene about 3 739 bp contains an open reading frame of 2 526 bp encoded 841 amino acids （aa）, 470 bp 5′ untranslated region （UTR）, and 743 bp 3′ UTR. Tissue expression profile by RT-PCR indicated that TLR4 gene expresses in mammary glands, liver, muscle, duodenum, fats, uterus, kidneys, hearts, lungs, pancreas, and ovary. TLR4 protein domain predicted by bioinformatics consists of signal peptide, transmembrane helices domain, 3 sorts of leucine-rich repeat domains （LRR, LRR-TYP, and LRRCT）, and a toll-interleukinl-resistance domain （TIR）. Leucine-rich repeat domains were related with recognizing a broad of pathogen-associated molecular patterns （PAMP） from pathogen, and TIR domain for downstream signaling transduction was most conservative （98% identify） than other domains after alignment of protein from ovine, porcine, human, and mouse. In addition, a 470 bp 5′-flanking region sequence was amplified by PCR, and 15 putative DNA binding sites were predicted, but this sequence lacks TATA box, CCAAT character, and GC-rich regions.     

长春花黄素单加氧酶基因的克隆与组织表达分析

利用RACE方法克隆到长春花中编码黄素单加氧酶的基因(YUCCA),YUCCA(YUC)是植物生长素吲哚乙酸(IAA)合成通路上的关键酶。长春花YUC(CrYUC,GeneBank登陆号KF827426)cDNA序列全长1 863bp,包括编码405个氨基酸的1 218bp开放阅读框、5’非编码区、3’非编码区和poly A尾巴;其相应的DNA中有3个内含子。生物信息学分析结果显示:预测CrYUC的分子量为45.3kDa,等电点为9.01;有16个磷酸化活性位点;与其他物种的YUC有较高相似度。初步表达分析发现:YUC在长春花的叶片、花、根及茎中均有表达,且茎及叶片中表达量高于花及根中表达量。     

Bioinformatics Analysis on Regulating Axillary Branch Gene of Cucumber（Cucumis sativus L.）

The regulating axillary branch gene was cloned and named as CsCCD7.Using a series bioinformatic computer softwares,database and online programes,CsCCD7 nucleotide sequence and CsCCD7 amino acid sequence were analyzed and CsCCD7 function was predicted.The results showed that CsCCD7 cDNA full length sequence was 2 136 bp,and included a 1 665 bp ORF which encoded a 554 AA protein;there were 32 kinds of cis-acting regulating element in 2 136 bp cDNA sequence;CsCCD7 was an unstable protein(the unstable coefficie...     

一个新的枳NAC基因cDNA全长的克隆及其亚细胞定位分析

以拟南芥的NAC1 cDNA序列作为模板,对柑橘EST数据库进行同源检索筛选,利用生物信息学方法克隆了柑橘NAC1基因的cDNA序列。以枳(Poncirus trifoliata)花的cDNA为模板,根据以上cDNA序列设计特异性引物,利用5'RACE和3'RACE技术,分别获得了NAC1基因的5'和3'末端,序列拼接后获得枳的NAC1 cDNA全长,命名为Pt-NAC1。Pt-NAC1全长为1351 bp,含有1个1047 bp完整的开放读码框(ORF),5'末端起始密码子ATG起始于25 bp,3'末端非翻译区为280 bp。该cDNA推导编码348个氨基酸,与苹果、拟南芥、杨树中相应序列的同源性分别为64.8%、57.0%、61.3%。生物信息学分析结果表明:Pt-NAC1 cDNA序列中有miRNA164的识别位点,还有高度保守的NAC结构域。构建Pt-NAC1亚细胞定位载体35S-GW-GFP-FJ619349,用基因枪转化洋葱表皮细胞,亚细胞定位结果表明:Pt-NAC1均定位于细胞膜中。     

Bioinformatic Analysis of an Aquaporin Gene from Upland Cotton

[目的]对陆地棉水通道蛋白基因GhNIP5.1进行生物信息学分析,为深入研究陆地棉水通道蛋白的功能提供研究基础。[方法]利用电子克隆的方法,获得棉花 GhNIP5.1基因的开放阅读框序列,并对该序列进行了生物信息学分析;利用已公布的棉花基因组测序结果,搜索获得 GhNIP5.1基因的编码区序列。[结果]序列分析表明,所获得 cDNA序列具有完整的897 bp的开放阅读框,编码298个氨基酸残基;该氨基酸序列具有 MIP超家族典型的 NPA保守序列;它同葡萄和拟南芥的NIP5.1氨基酸序列的一致性最高,分别为89.3%和83.2%,在拟南芥 NIP家族9个成员中,GhNIP5.1蛋白的氨基酸序列同 AtNIP5.1同源性最高;该蛋白的三维结构也同拟南芥AtNIP5.1的非常相似;GhNIP5.1基因的编码区全长2067 bp,包含4个外显子和3个内含子,所有内含子的左右边界均为 GT-AG结构。[结论] GhNIP5.1基因可能具有同拟南芥AtNIP5.1类似的生理功能。     

甘蔗钙依赖蛋白激酶基因克隆与序列分析

[目的]克隆甘蔗钙依赖蛋白激酶基因(ScCDPK1),为其功能解析和育种利用打下基础.[方法]根据甘蔗cDNA文库中的CDPK基因序列信息设计引物,利用RT-PCR克隆ScCDPK1基因,并采用在线生物信息学分析软件对其推导蛋白的理化性质、跨膜结构、信号肽及保守结构域等进行预测分析.[结果]克隆获得的ScCDPK1基因完整编码区大小1650 bp,编码549个氨基酸,相对分子量61.971 kD,等电点(pI)6.78,不稳定指数35.63.同源性和遗传进化树分析结果显示,ScCDPK1基因与小麦TaCPK7基因亲缘关系最近,同源性达88%;ScCDPK1蛋白与其他已知CDPK蛋白一致,具有CDPKs家族特有的4个保守区域(可变区、蛋白激酶区、自抑制区和钙离子结合区),其二级结构主要由α螺旋(42.80%)和无规则卷曲(32.97%)构成;蛋白功能分类预测结果显示,ScCDPK1蛋白是一种阳离子通道蛋白,可能参与植物胁迫应答、信号转导和翻译调控等生物反应.[结论]ScCDPK1基因编码的蛋白与其他已知CDPK蛋白一致,具有CDPKs家族特有的4个保守区域,是一种阳离子通道蛋白.