基于ARF10转录因子功能验证及其对拟南芥种子休眠和萌发的影响

生长素是一种新的调控种子休眠的激素,ARF10作为生长素信号途径下游的一个转录因子也参与其中,然而其调控的分子机制并不清楚。以拟南芥茎生叶为供试材料,克隆获得编码ARF10转录因子的基因片段,利用DNA重组技术构建ARF10过量表达载体35S::ARF10-pCAMBIA1301,并通过浸花法转化野生型拟南芥,获得ARF10过量表达的转基因植株(ARF10-OE),通过检测种子休眠性和对ABA敏感性,探究其对种子休眠与萌发的影响。结果显示,ARF10种子休眠性显著高于野生型,其ABA敏感性也较对照更高。基因表达分析结果显示,ARF10基因过量表达能够明显增强调控种子休眠和萌发的关键基因ABI3、ABI4、ABI5以及NCED9的表达,生长素信号途径下游末端转录因子ARF10可能通过上调ABI3、ABI4、ABI5基因的表达,提高了种子对ABA的敏感性;通过上调NCED9的表达,增强了种子的休眠性。     

小麦MYB基因的表达分析

MYB转录因子在植物生长发育和响应外界环境胁迫中发挥着重要的作用。为了分析小麦MYB基因在小麦不同组织中的表达特性,采用半定量RT-PCR方法研究了小麦MYB基因在根、茎和叶中的表达。结果表明:MYB的转录本在3个组织中均有表达,在根中MYB表达量最高,叶中表达量最低。     

铁盐处理下马铃薯NAC转录因子相对表达量时空差异分析

【目的】为明确马铃薯NAC转录因子在响应铁盐(Fe~(2+))胁迫时的表达特性,本试验对铁盐处理下马铃薯NAC转录因子相对表达量的时空差异进行分析。【方法】基于实验室前期对苗龄20 d的马铃薯品种东农312组培苗施加缺铁(1μmol/L)胁迫处理0、48 h,对其进行转录组测序,发现7个差异表达的NAC转录因子。本试验对MS培养基设置3个Fe~(2+)梯度(缺铁1μmol/L、对照100μmol/L和过量铁500μmol/L),分别用于处理组培条件下继代生长20 d的东农312脱毒试管苗,处理时间分别为0、48和96 h,应用qRT-PCR技术分析上述7个NAC转录因子在根、茎、叶中的相对表达量;并对NAC1～NAC7编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】NAC1～NAC7在根、茎中均受缺铁、过量铁处理诱导表达,转录表达水平在处理48、96 h时较0 h时变化显著。在叶中,NAC1～NAC7在这两个时间点的表达量较0 h无显著上调。NAC1～NAC7编码蛋白含有192～413个氨基酸,均含有NAM结构域,预测分子量为22.81～46.98(kDa),PI值为4.65～9.23。【结论】马铃薯NAC转录因子参与响应铁盐胁迫。在缺铁和过量铁胁迫下,7个NAC基因在根和茎中均呈现显著差异表达,在叶中无显著上调表达。     

黄瓜生长素反应因子(ARF)家族鉴定及表达特异性分析

【目的】鉴定黄瓜生长素反应因子（ARF）,预测small RNAs并验证ARF与small RNAs和生长素的关系;分析ARF在种子萌发过程中的表达模式,推断ARF在黄瓜单性结实和种子萌发过程中是否起到关键作用。【方法】利用拟南芥和水稻ARF蛋白质序列检索黄瓜基因组数据库,对检索到的黄瓜ARF家族进行结构分析和small RNAs预测;将预测到的gma-MIR160o precursur构建到pCAMBIA2301植物表达载体上,利用农杆菌介导法将其导入到单性结实黄瓜品种中,并对PCR检测为阳性的转基因植株进行RT-PCR验证;利用real-time RT-PCR方法分析ARF家族成员在生长素诱导后、开花时期及种子萌发阶段的表达模式。【结果】通过与拟南芥和水稻ARF蛋白序列的比对,共得到18个黄瓜ARF蛋白质序列。将其连同拟南芥和水稻的ARF蛋白质序列共分为4大类。从结构上看,外显子数目2-18不等,但同一类之间基因结构较为相似。进化树分析显示,18个基因之间的相似性不高;18个黄瓜ARF基因均有相对应的small RNA。其中, Csa010564、Csa011935、Csa015176、Csa020560和Csa022361可能都是miR160的靶基因。转基因试验进一步说明Csa010564、Csa011935和Csa015176在表达量上出现下降趋势,而Csa020560和Csa022361的表达量与对照相比略有上升,说明Csa010564、Csa011935和Csa015176是miR160的靶基因;在生长素诱导表达的试验中,Csa007296、Csa011935和Csa015176在根、茎和叶中的表达量均高于对照,说明ARF的表达受IAA的正调控;同时,以上3个基因在叶片和雌花花冠中的表达量均是开花第2 d低于开花当天,而在子房中的表达量确是第2天高于开花当天,尤其是Csa011935和Csa015176上调显著,说明ARF在子房发育过程中起到至关重要的作用;ARF在种子萌发过程中的表达分析显示：大部分基因在吸涨后12 h和48 h处于表达最高峰。【结论】ARF受生长素和相应的small RNAs调控。在黄瓜单性结实和种子萌发过程中,ARF可能起到了关键性作用。     

干旱胁迫下沙棘NAC基因的时空表达模式

以青海省湟源县野生沙棘种子繁殖的实生苗为试验材料，对沙棘HrNAC家族转录因子的结构进行分析，并研究HrNAC转录因子时空表达模式。8个HrNAC转录因子等电点为4.910（HrNAC8）~ 9.264（HrNAC1），均属于亲水性蛋白；在沙棘的根、茎、叶中，8个HrNAC转录因子中有7个呈现差异表达，大部分基因随着干旱时间的增加，相对表达量升高，复水后急剧下降。以上结果表明，HrNAC转录因子受干旱胁迫诱导表达，在沙棘响应干旱胁迫过程中发挥重要作用。     

茶树CsWRKY3基因的克隆及表达分析

WRKY转录因子家族普遍存在于植物体内,对植物的多种生理过程有广泛的调控作用,在众多植物转录因子家族中占有重要地位。本研究从茶树中克隆获得一个WRKY基因,命名为CsWRKY3,该基因包含一个1 710 bp的开放读码框,编码569个氨基酸。qRT-PCR结果显示,CsWRKY3在茶树根、叶、花中的表达水平较高,在茎、种子中的表达水平较低。当茶树叶片受到机械损伤或者被茶尺蠖幼虫取食时,CsWRKY3基因被迅速诱导且表达差异显著。本研究表明CsWRKY3转录因子基因参与了茶树的抗虫防御反应。     

大豆GmWRKY148的克隆与功能分析

【目的】WRKY转录因子与植物的生物和非生物胁迫应答密切相关。通过对大豆WRKY转录因子基因GmWRKY148的克隆及在大豆发状根中过表达后对疫霉根腐病抗性的分析,探究大豆与大豆疫霉菌互作的作用机理。【方法】以拟南芥的AtWRKY44序列为探针,利用同源克隆的方法在大豆Williams 82的根部组织中得到其同源基因Glyma.14G199800,命名为GmWRKY148。对GmWRKY148蛋白进行系统进化树分析;利用qRT-PCR方法分析该基因在大豆的根、茎、叶、子叶和接种大豆疫霉菌不同时间点的转录水平;利用双酶切的方法将GmWRKY148完整的CDS序列连接到植物过表达载体p Bin GFP2中,利用基因枪法将重组质粒转化到洋葱表皮细胞中,进行亚细胞定位分析。利用发根农杆菌K599介导的遗传转化体系,经过GFP荧光筛选和qRT-PCR检测,获得大豆过表达GmWRKY148的阳性发状根(OE-GmWRKY148)和转入p Bin GFP2空载体(EV)的阴性对照发状根。对过表达GmWRKY148发状根和阴性对照发状根接种大豆疫霉菌,统计病斑长度、疫霉积累量和卵孢子萌发情况。【结果】GmWRKY148的CDS序列全长为999 bp,编码332个氨基酸,等电点为7.61。系统进化分析发现,GmWRKY148与菜豆(Phaseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)的WRKY转录因子亲缘关系十分相近,且与菜豆的亲缘关系最近。亚细胞定位结果显示,GmWRKY148定位在细胞核中。组织表达分析显示,GmWRKY148在根中的表达量最高,在茎和叶中次之,在子叶中最低。荧光定量PCR结果表明,接种大豆疫霉菌P6497后,在感病品种Williams和抗病品种Williams 82(含有Rps1k)中,GmWRKY148受诱导逐渐上调表达,在侵染24 h后表达水平均达到最高,但在Williams 82中的上调倍数更高。对过表达GmWRKY148和转空载体的大豆阳性发状根分别接种大豆疫霉菌P6497的菌丝块,比较接种24 h后的病斑长度和疫霉积累量,结果显示,与对照EV相比,过表达GmWRKY148大豆阳性发状根的病斑长度显著变短,疫霉积累量显著降低。对过表达GmWRKY148和EV的大豆阳性发状根分别接种疫霉菌P6497的游动孢子,并在接种后24、36和48 h用显微镜观察菌丝的侵染及卵孢子萌发数量,统计结果显示,过表达GmWRKY148的大豆阳性发状根与对照EV相比,菌丝的侵染率及卵孢子萌发率均显著降低。【结论】GmWRKY148参与调控大豆与大豆疫霉的互作,能够增强大豆对大豆疫霉菌的抗性。     

核桃JrbHLH转录因子家族鉴定与响应冷胁迫基因表达分析

为了探究核桃bHLH转录因子家族在响应冷胁迫过程中的作用，本研究通过转录组数据结合隐马尔可夫模型筛选技术在核桃全基因组挖掘出bHLH转录因子家族成员并进行结构分析，进一步对该家族成员响应冷胁迫的差异表达基因进行冷胁迫不同时间与不同组织中的表转录水平分析。结果表明，核桃bHLH转录因子家族包含72个基因，编码72条蛋白，开放阅读框为393～1 839 bp，编码的蛋白长度为130～612个氨基酸，等电点为4.61～9.51，均为亲水性蛋白；各成员均含有典型的碱性区域和螺旋-环-螺旋结构域；与拟南芥同家族聚类分析发现，核桃bHLH家族成员可分布到15个亚群，且同源性较高。结合转录组数据筛选到16个响应冷胁迫的差异表达基因，在冷胁迫不同时间后出现不同程度响应，并且在不同组织中存在特异性表达。本研究将为核桃bHLH转录因子家族在响应冷胁迫过程中的作用研究奠定基础。     

向日葵逆境应答转录因子DREB的克隆与表达分析

DREB类转录因子在作物抵御逆境胁迫上起重要作用,利用该类基因改良作物抗逆性具有重要意义。研究利用同源克隆方法在6份向日葵资源中均分离到1个DREB类转录因子基因。该基因序列全长945 bp,推测编码蛋白含314个氨基酸,与NCBI中该基因序列同源性均达到99%以上,不同材料之间该基因序列存在单碱基突变,突变位置不一致,且未发现与耐旱性有明显相关性。表达分析显示,6份向日葵材料根、茎和叶中的DREB基因均受干旱、盐害和低温的诱导,作出表达量上调的应答,胁迫超过一定时间,表达量出现下降的趋势。所有材料叶中DREB基因的上调幅度明显高于根和茎中,低温胁迫后的表达上调量要明显低于干旱和盐害胁迫下的表达上调量。各材料根、茎、叶中DREB的表达量与耐旱性未发现有明显相关性。     

促生解淀粉芽胞杆菌SQR9定殖对黄瓜根系基因表达的转录组学研究

[目的]本文旨在阐明黄瓜植株接种促生解淀粉芽胞杆菌SQR9后其根系基因的表达谱变化特征,从植物响应微生物的角度揭示植物根际促生细菌(plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)的作用机制。[方法]利用Illumina高通量测序技术研究接种菌株SQR9对黄瓜根系基因表达谱影响的转录组特征,对显著差异表达基因进行GO功能和KEGG富集分析。[结果]与未接种的对照黄瓜植株比较,菌株SQR9接种72 h后黄瓜根系有484个基因的表达发生显著变化,包括300个上调基因和184个下调基因。Real-time PCR验证表明基因表达差异趋势与转录组测序结果一致,证明测序结果可信。黄瓜根系响应菌株SQR9的差异基因主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、次级化合物代谢和信号转导途径等。在植物促生方面,氨基酸代谢途径中ASP1基因(编码天冬氨酸转氨酶)表达上调约4倍;糖酵解途径中PDC基因(编码丙酮酸脱羧酶)和卡尔文循环中FBA6基因(编码果糖二磷酸醛缩酶)表达均上调3～5倍;生长素响应途径中编码生长素抑制子的IAA8基因表达显著下调,而编码响应蛋白的基因SAUR77和SAUR21表达均上调3倍左右,表明菌株SQR9产生的外源吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)激活了植物内源的IAA信号途径。在植物免疫方面,免疫信号途径转录因子的编码基因WRKY29和ERF1B表达上调,激活植物系统抗性并有助于提高抗病能力;编码抗胁迫因子的C_4H和ADH1基因表达也显著上调,提高植物抗逆能力。[结论]菌株SQR9可通过调控黄瓜根系代谢相关基因表达和激活免疫途径相关基因的方式促进黄瓜植株生长并提高其抗病能力。