指天蕉β-1，3-葡聚糖酶基因全长cDNA的克隆及序列分析

 【目的】克隆植物中主要的防卫基因β-1, 3-葡聚糖酶基因,为该基因功能研究和有效利用提供理论依据。【方法】通过分析芭蕉科植物的β-1,3-葡聚糖酶基因,据其保守区域设计一对简并引物,通过RACE法从野生指天蕉中克隆得到一个β-1,3-葡聚糖酶基因的全长cDNA——glu。【结果】glu全长为1 114 bp,其推导的氨基酸序列与GenBank中其它来源的β-1,3-葡聚糖酶蛋白序列的相似性为54%—71%。其中,与芭蕉科植物Grand Nain的β-1,3-葡聚糖酶蛋白序列的相似性最高（71%）。【结论】在芭蕉类作物中克隆了一个新的β-1,3-葡聚糖酶基因,为进一步研究该基因的功能并应用于作物转基因抗病育种研究奠定了基础。     

短小芽孢杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆、表达及其酶特性研究

提取短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)基因组,通过PCR克隆了短小芽孢杆菌β-葡聚糖酶基因全长序列.结果表明:该基因全长754 bp,ORF为717 bp,编码239个氨基酸,计算分子量为26.98 kD,等电点为6.08.经Blast分析,该序列与地衣芽孢杆菌同源性最高(91%),该基因首次在GenBank上登录(登录号AY164456).在克隆载体上亚克隆基因全长,构建重组表达载体pET-pum,导入大肠杆菌BL 21中表达.SDS-PAGE电泳表明:在27 kD左右有表达带,酶活较低(7.24 U/mL),仅为出发菌酶活的16%,其最适温度为50 ℃左右,最适pH在5左右.     

Bacillus subtilis LC-9产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质与催化特性研究

[目的]系统研究Bacillus subtilis LC-9所产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质,探讨其在催化应用上的可行性。[方法]采用两步阴离子交换层析法对B.subtilis LC-9发酵液中的β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行纯化,用SDS-PAGE检测其纯度,研究纯酶的酶学性质及该酶对β-葡聚糖和地衣多糖的降解特性,并采用TLC法检测其水解液中糖的成分。[结果]从自行筛选的糖苷酶产生菌B.subtilis LC-9的发酵液中经两步纯化,得到电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,其比活力达3 502 U/mg,表观分子量为28 kDa;酶的最适反应pH和温度分别为6.5和45℃,且在45℃下稳定;该酶催化地衣多糖的Km值和Vmax分别为4.13 mg/ml和1 238μmol/min/mg,催化大麦β-葡聚糖的Km值和Vmax分别为3.84 mg/ml和1 427μmol/min/mg;该酶降解大麦β-葡聚糖产生寡聚糖,最终产物主要为三糖和四糖,而降解地衣多糖终产物主要为三糖。[结论]从Bacillus subtilis LC-9发酵液中纯化获得了电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,性质研究表明该酶是专一性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,有望用于啤酒、饲料等领域。     

来源于枯草芽孢杆菌的漆酶cotA基因克隆与表达及其酶学性质研究

漆酶作为一种含铜离子的多酚氧化酶,在环境保护、生物能源、食品工业和纸浆漂白等工业中有重要的应用价值。从枯草芽孢杆菌168菌株中克隆漆酶cotA基因,全长1 542 bp,编码513个氨基酸,外加一个终止密码子。将该基因在大肠杆菌Transetta（DE3）菌株中通过微好氧发酵法进行异源表达和纯化,获得的重组酶蛋白CotA的最适反应温度为60℃,最适pH为4.5。该酶在60℃具有较好的热稳定性,保温90 min后仍有71.70%的剩余酶活。最适反应条件下,重组酶对ABTS的Km为63.9±5 μmol/L,kcat为39.1±1/s,最大反应速率为0.005 μmol/L·min·mg,且在最适反应条件下,微好氧发酵法获得的重组酶蛋白CotA的比活（557.8 U/mg）是低温诱导法（0.2 U/mg）的2 655.4倍。因此,通过微好氧发酵法可以显著提高重组漆酶CotA的比活力。     

热稳定性过氧化氢酶高产菌的筛选、鉴定及酶学性质研究

从无锡惠山采集的土样中分离获得一株过氧化氢酶产量较高的菌株SYBC-01,根据其形态、生理生化特性和16S rDNA序列分析,鉴定该菌为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。初步试验表明,该菌产过氧化氢酶酶活达293.88 U/mg细胞,所产过氧化氢酶的最适反应pH 7,最适反应温度70℃,在pH6~10范围内较稳定,60℃以下热温度性较好,表观Km值为23.71 mmol.L-1,Vmax为34 672 U.mg-1蛋白。     

烟草β-1,3-葡聚糖酶的生物学分析

[目的]以烟草β-1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列为材料,对其特性进行深度挖掘。[方法]采用NCBI-PROTEIN筛选蛋白序列,依次运用Prot Param、Signal P 4.1和TMHMM 2.0工具进行预测并分析烟草葡聚糖酶的理化特性、信号肽和跨膜结构的组成成分。[结果]NtBGl-2的分子量最大(40 390.76 Dk),NtBGl-3的分子量最小(37 722.64 Dk);NtBGl-1和NtBGl-2的等电点小于7.0,而NtBGl-3的等电点大于7.0;NtBGl-1和NtBGl-2属于不稳定蛋白,NtBGl-3属于稳定性蛋白,且耐热性大于NtBGl-1和NtBGl-2;NtBGl-1和NtBGl-2的优势氨基酸为甘氨酸和丝氨酸,NtBGl-3的为天冬酰氨和丙氨酸;NtBGl均含有信号肽,属于分泌蛋白;NtBGl-1无跨膜区,而NtBGl-2(13~35)和NtBGl-3(7~29)含有跨膜结构区域,属于跨膜蛋白。[结论]该研究为深入研究烟草葡聚糖酶奠定基础。     

毕赤酵母产β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵优化及酶学性质研究

对毕赤酵母表达β-1,3-1,4-葡聚糖酶条件进行优化,在摇瓶水平上研究了温度、pH、甲醇流加量、诱导时间,油酸等因素对重组葡聚糖酶的影响;得优化条件为:最适温度30℃、pH6.0,最佳甲醇诱导浓度为0.5%,最佳诱导时间为84h,酶活力达27.4U/mL,比初始酶活力提高了1.9倍。酶反应的最适pH为6.0,最适温度为50℃。在pH3.5～8.0的范围内和温度55℃以下保存时具有较好的稳定性;其中,CaCl2对重组酶的激活效果显著,使酶活力提高达92%。     

耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

【目的】研究耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达,并检测其酶学性质,为耐热β-半乳糖苷酶的应用和工业化生产奠定基础。【方法】利用基因工程的原理和方法,将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆到大肠杆菌pET表达系统(pET-28a(+)),并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。将构建的重组菌(pET28a-bgaB)在含硫酸卡那霉素的液体LB培养基中以IPTG为诱导剂,对表达产物的最适反应温度、最适反应时间I、PTG诱导浓度、热稳定性及酶促动力学进行检测。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bgaB,并测得耐热β-半乳糖苷酶的最适反应温度为65℃,最适反应时间为6 h,IPTG的最佳诱导浓度为1 mmol/L,且具有良好的热稳定性;在诱导后6 h,耐热β-半乳糖苷酶的表达量占菌体总可溶性蛋白的20%,表达效率较高;对透析蛋白进行蛋白质定量,蛋白质量浓度为0.75 mg/mL,透析蛋白的耐热β-半乳糖苷酶活性为75 U/mL,比活性为100 U/mg;酶促动力学研究表明,耐热β-半乳糖苷酶的反应常数为0.398μmol/mL,最大反应速度为27.435μmol/(min.mL)。【结论】耐热β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中得到成功表达,并且在很大程度上提高了耐热β-半乳糖苷酶的活性。     

木质层孔菌产木聚糖酶和β-葡聚糖酶的研究

研究了木质层孔菌不同发酵条件对木聚糖酶、β-葡聚糖酶性能的影响,并对其酶作用特性进行了研究结果表明:木质层孔菌产木聚糖酶最适碳源为麸皮,氮源为蛋白胨,最适发酵温度为25℃;而产β-葡聚糖酶最适碳源为木糖,氮源为酵母膏,最适发酵温度为28℃。就产酶时间而言,在发酵前60 h菌株均不产生β-葡聚糖酶和木聚糖酶,在72 h才有微量的酶产生,到192～240 h两种酶均达到产酶高峰,并以216h产酶最高;两种酶的最佳缓冲液均为柠檬酸缓冲液,木聚糖酶的最适作用pH值5.0,最适反应温度为50℃,而β-葡聚糖酶最适作用pH值4.6,最适反应温度为60℃。     

重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化及部分酶学性质研究

[目的]研究重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质。[方法]由重组大肠杆菌制备重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵液,经乙醇分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析分离纯化后进行SDS-PAGE纯度鉴定,最后分析纯化后重组酶的酶学性质。[结果]SDS-PAGE分析表明纯化后得到了较纯的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶,比活力达13 437 U/mg,纯化倍数为19.85倍,回收率为20.60%,分子量约30 kDa。纯化后重组酶的最适pH值为6.0,pH值4.5~6.0较稳定;最适温度为50℃,40~50℃较稳定;Cu2+和Fe2+对其活力有显著的抑制作用,Mg2+、Zn2+和Mn2+对其活力有抑制作用,比较适合在啤酒酿造上使用。[结论]该研究为重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的工业化应用奠定了基础。     

啤酒废酵母自溶过程强化研究

[目的]研究啤酒废酵母强化自溶过程,优化强化作用因素。[方法]对影响啤酒废酵母自溶后释放的超氧化物歧化酶(SOD)、氨基酸、葡萄糖内容物含量及SOD的活性提取的各因素进行单因素试验,并设计物理因素正交试验进行各因素参数优化;同时对啤酒酵母自溶后释放的上述活性物质进行添加葡聚糖酶、木瓜蛋白酶促进自溶过程的单因素影响研究,并设计化学因素正交试验进行各因素参数优化。[结果]物化因素影响的正交试验表明,啤酒废酵母自溶过程氨基酸含量提取的最优组合为pH 5.0、加水量300%、加盐量3%,葡萄糖含量提取的最优组合为pH 5.0、加水量250%、加盐量1%,SOD含量提取的最优组合为pH 5.5、加水量300%、加盐量2%,SOD活性提取的最优组合为pH 5.5、加水量250%,加盐量1%。生化因素影响的正交试验表明,氨基酸含量提取的最优组合为pH 6.0、温度60℃、酶用量6 g/kg葡聚糖酶+4 g/kg木瓜蛋白酶,葡萄糖含量提取的最优组合为pH 6.0、温度55℃、酶用量6 g/kg葡聚糖酶+4g/kg木瓜蛋白酶,SOD含量提取的最优组合为pH 6.0、温度55℃、酶用量6 g/kg葡聚糖酶+2 g/kg木瓜蛋白酶,SOD活性提取的最优组合为pH 6.5、温度60℃、酶用量6 g/kg葡聚糖酶+4 g/kg木瓜蛋白酶。[结论]在优化的啤酒废酵母自溶过程强化作用各提取物的最优组合条件下,可简化操作过程、降低操作难度,提高酵母菌成分的利用率及其得率。     

基于响应曲面法优化蜂胶的乙醇提取工艺

蜂胶具有优良的保健效果,一直被作为功能食品而加以应用。为了满足实际生产中提高蜂胶产品质量和生产效率的要求,在充分模拟实际生产条件的基础上,利用响应曲面法对蜂胶提取率和总黄酮含量的影响因素（提取时间、乙醇浓度、固液比、提取次数、提取温度）进行了分析。结果表明,针对本实验中采用的蜂胶毛胶样品,回归模型预测的蜂胶提取率达到38.324 6%,总黄酮含量达到199.776 0 mg/g;最佳提取条件为提取时间24 h,乙醇浓度95%,固液比1∶10,提取次数2次,提取温度为室温。为了达到指导实际生产的目的,试验结论须得到生产车间的实际检验。     

利用生物信息学手段获得两个对硫磷水解酶

以黄杆菌(Flavobacterium)对硫磷水解酶(parathion hydrolase)的序列(AAA24930．1)对芽孢杆菌的基因组进行BLASTP,从Bacillus halodurans中发现两个对硫磷水解酶类似蛋白PTEa和PTEb,长度分别为679和331个氨基酸。利用conserved domain search和motif scan软件分析的结果证实它们具有对硫磷水解酶的结构特征。PTEa和PTEb的对硫磷水解酶上游标志区分别是“GVCACHEHL”和“GFTYSHEHI”,与标准的“G—x—T—L—x—H—E—H-【LIV]”大致吻合。PTEb的对硫磷水解酶下游标志区“AVARAHHETKAPIHSH”也与典型的“A—x—A—x—A—x(4)-G—x—P-[LIVM]-x(2)-H”基本一致,而PTEa中缺乏明显的下游标志区。PTEb序列对枯草杆菌基因组TBLASTN的结果表明枯草杆菌也可能存在对硫磷水解酶类似蛋白。     

高效液相色谱法检测肉制品中L-抗坏血酸与D-异抗坏血酸

利用偏磷酸溶液提取,以0.01 moL/L磷酸二氢钾溶液(pH值2.5~2.8)为流动相,亲水性Venusil MP C18色谱柱分离,二极管阵列检测器测定,检测波长245 nm,建立准确快速的高效液相色谱仪检测肉制品中L-抗坏血酸与D-异抗坏血酸含量的方法。结果表明,L-抗坏血酸与D-异抗坏血酸可以达到基线分离,在2~100 mg/L范围内线性相关系数均>0.999;10~100 mg/kg浓度水平添加回收率为79.3~105.1%,相对标准偏差4.5%~13.6%(n=6)。此法可以准确快速地分析肉制品中L-抗坏血酸含量与D-异抗坏血酸。     

马卡丛生芽培养条件优化及玻璃化控制研究

优化了南美产十字花科植物马卡丛生芽诱导和继代过程中的培养条件,使玻璃化现象得到了控制,提高了丛生芽的存活率。优化后的丛生芽诱导条件为:MS(pH 5.85~5.90)附加1~2 mg/L 6-BA,0.25 mg/L NAA,蔗糖30~35 g/L,琼脂6 g/L,诱导温度20~25℃,光照强度24μmol/(m2.s),光照时间16 h/d;优化后的丛生芽继代条件为:MS(pH 5.85~5.90)附加2 mg/L6-BA,0.25 mg/L NAA,培养温度15℃,光照强度24~41μmol/(m2.s),光照时间16 h/d。     

热稳定6-磷酸-β-葡萄糖苷酶TteBglB异源表达、分离纯化及酶学性质分析

6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.86)催化6-磷酸-葡萄糖苷类化合物(如6-磷酸-纤维二糖、6-磷酸-纤维素寡糖)产生6-磷酸-葡萄糖而使纤维素完全分解,在微生物碳源利用过程中起重要作用。腾冲嗜热厌氧杆菌是一株嗜热厌氧微生物,提供了丰富的热稳定性蛋白基因资源。从该菌株中克隆编码6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因Ttebgl B,并在E.coli BL21(DE3)进行了异源表达。结果表明,TteBglB催化反应的最适p H为6.0、最适温度为70℃,在pH 4~10或70℃时有着良好的稳定性;同时证实,TteBglB属于糖基水解酶家族1(GH1)成员,可不依赖Mn2+、Ni2+、Co2+或Fe2+等二价金属离子而发挥催化作用。以pNPβG6P为底物时,催化反应的Km为0.054 mmol/L,Kcat为81.47/min,Vmax为0.003992 mmol/min,酶比活为18.093 U/mg。     

Delftia sp.T3-6酰胺水解酶DamH晶体制备及X-射线衍射分析

Dam H是菌株Delftia sp.T3-6产生的具有酯键水解活性的酰胺酶,对其原核表达、纯化、结晶条件及蛋白晶体X-射线衍射条件进行了研究。经过原核表达,采用Ni-NTA亲和层析法和透析法纯化蛋白,成功获得了适合晶体生长的蛋白Dam H。289 K下采用座滴气相扩散法进行晶体筛选和制备,在蛋白浓度为15 mg/m L及含有0.2 mol/L乙酸铵,pH 7.1,21%(W/V)聚乙二醇3350的缓冲液中获得了理想的蛋白晶体。在低温100 K下通过X-射线衍射仪(Rigaku Micro Max-007 HF)收集了晶体衍射数据。晶体衍射分辨率为3.4,空间群为三斜晶系P1,晶胞参数为a=14.1,b=23.9,c=85.7,α=112.6°,β=77.2°,γ=89.1°。结晶条件的优化和晶体制备为Delftia sp.T3-6 Dam H高分辨率晶体制备提供了参考,晶体衍射数据的收集为Dam H三维结构的解析奠定了前期基础,将有助于阐明Dam H的催化机制。     

蝴蝶兰再生体系优化的研究

探讨了蝴蝶兰的组织培养技术和方法。试验表明:用幼叶在散射光下培养诱导蝴蝶兰原球茎的效果最好,最适培养基为:MS+6-BA10mg/L+NAA1mg/L+CW20%+蔗糖20g/L+琼脂7g/L(pH值5.4);最适增殖培养基为:MS+6-BA2mg/L+NAA1mg/L+CW20%+蔗糖20g/L+琼脂7g/L(pH值5.4);最适生根长苗培养基为:1/2MS+NAA1mg/L+苹果酸30g/L+香蕉泥100g/L+活性炭1g/L+蔗糖15g/L+琼脂7g/L(pH值5.4)。     

稻瘟病菌假定的糖基水解酶62家族初步研究

 【目的】了解糖基水解酶62家族细胞壁降解酶系在稻瘟病菌致病中的作用。【方法】通过生物信息学方法对稻瘟病菌基因组中假定的糖基水解酶62家族成员进行基因结构、蛋白分泌特性及系统发育分析,并对其中一个成员MGG_01403.6进行过量表达、基因敲除分析。【结果】该家族共有8个成员,均具有细胞壁降解酶（糖基水解酶62家族）保守结构域,且均为胞外分泌蛋白;系统发育分析可以将这些成员分别聚类在两个进化分支中;成员间在不同侵染阶段表达模式有差异;MGG_01403.6过量表达和基因敲除均不影响稻瘟病菌的致病性。【结论】糖基水解酶62家族可能存在功能冗余作用,进一步的双突变或多突变可能是明确这类多基因家族基因功能的重要方法。