猪体外成熟,受精卵的体外培养研究

用自己改良的发育培养基使３．９％￣２０．１％体外成熟体外受精卵在体外发育过了４－细胞阻滞期，到达８￣１６－细胞期，个别发育到桑椹期；培养中还观察到葡萄糖对猪胚胎的体外发育没有抑制作用，说明葡萄糖不是猪胚胎体外培养中出现阻滞的原因，在培养基中添加ｐＦＦ可促进猪胚胎体外发育，使发育至８￣１６－细胞期的胚胎率从３．９％，提高到１０２．２％。     

对昆明白杂种鼠胚胎体外培养的实验研究──2细胞期至卵圆筒期

利用ＣＭＲＬ—１０６６和国产其它药品对昆明白杂种小鼠２—细胞期的胚胎，进行了体外培养试脸，成功地将２—细胞胚胎在体外培养条体下，使之生长发育到卵圆筒阶段。从２—细胞期开始计算，囊胚形成率为７０％，卵化率为３０％，附植率为２％，卵圆筒期胚胎形成率为１％。试验发现，把２—细胞期小鼠胚胎体外培养到卵圆筒期比体外发育到同阶段推迟１～２天，此卵圆筒期胚胎的形成率与国外报道的２４％相比仍然很低，其原因估计可能为：１）小鼠的品种；２）国产药物的纯度；３）ＣＯ２条件不同而造成。     

巢式RT-PCR检测昆明小鼠早期胚胎中G6PD基因表达

根据小鼠肌肉的６－磷酸葡萄糖脱氢酶（Ｇ６ＰＤ）的ｃＤＮＡ序列设计并合成内外２对引物,以巢式ＲＴ－ＰＣＲ方法检测昆明小鼠１－,２－,４－,８－细胞期早期胚盈是否转录出Ｇ６ＰＤ的ｍＲＮＡ,结果发现１￣８－细胞期早期胚胎的ｍＲＮＡ均能以外引物扩增产物为模板通过内引物扩增出一条３７８ｂｐ特异性条带。表明昆明小鼠１￣８－细胞期早期胚胎的Ｇ６ＰＤ基因已表达,磷酸戊糖途径已是其代谢葡萄糖的主要方式之一。     

用酶分离小鼠早期胚胎的研究

用酶分离小白鼠２－－细胞、４－－细胞和８－－细胞胚胎，获取单个卵裂球，将其培养在含有牛血清蛋白质的ＣＺＢ培养基微滴内。培养的小白鼠胚胎发育情况有３种：（１）正常发育；（２）泡囊化；（３）不发育。在体外培养条件下２－－细胞单个卵裂球有８６．５％发育成２－－细胞；有３５．１％发育成４－－细胞，有８．１％发育到８－－细胞，有５．４％发育到桑椹胚；４－－细胞胚的单个卵裂球中有８３．３％发育到２－－细胞，３７．５％发育到４－－细胞，１２．５％发育到８－－细胞，８．３％发育到桑椹胚；在８－－细胞胚的单个卵裂球中有４６．７％发育到２－－细胞，２６．７％发育到４－－细胞，１３．３％发育到８－－细胞、６．７％发育到桑椹胚。实验结果表明用酶分离小白鼠早期胚胎，所获卵裂球具有一定的继续发育能力，而且没有透明带也能发育。     

家兔早期胚胎体外培养和移植研究

用ＦＳＨ，ＰＭＳＧ，ＨＣＧ和ＩＣＩ－８０９９６对２０只家兔进行超数排卵，平均每只排卵１９．１枚，回收胚胎１３．５枚。超排卵数和卵子回收数ＦＳＨ分别为２６．３枚和２１．１５枚，ＰＭＳＧ为２２枚和１３．５。将正常的２５枚１细胞，７枚２细胞和３２枚４细胞期胚胎在ＴＣＭ－１９９培养液，５％ＣＯ２和 ３８．５℃环境中培养６０－７ ０ｈ，６３．１７％的胚胎可发育至囊胚移植至５只体兔后，产出仔兔１３只。     

猪胚胎细胞核移植

选用杜洛克２￣１６细胞期胚胎卵裂球作核供体，湖北白猪卵母细胞作核受体，通过显微操作和电融合法构成重组胚。体外培养时，以融合前２ｈ、１ｈ激活及融合前不激活的卵母细胞做核受体的重组胚，发育率分别为６４．６％，５５．３％和３４．５％。     

家兔胚胎细胞核移植的研究

研究改进了兔胚胎细胞核移植的技术体系,并对核移植胚胎的体外培养以及克隆胚胎的体内发育进行了试验。结果表明：卵母细胞去核率为８８．９％（８／９）,重组胚融合率为７６．７％（１７６／２２９）,将融合的重组胚与兔胎儿成纤维细胞共同培养,其２￣４细胞发育率、８￣１６细胞发育率以及桑椹胚和囊胚的发育率分别为６５．７％（２３／３５）、２８．６％（１０／３５）、２２．９％（８／３５）,显著高于“ＴＣＭ－１９９＋１０％ＦＣＳ”系统培养的４３．３％（１３／３０）、２６．７％（８／３０）、１６．７％（５／３０）。１６及３２细胞期卵裂球的重组胚可发育到产仔,将１１１枚重组胚移植给９只同期处理的受体母兔,２只妊娠,其中１只产出２只足月克隆仔兔,１只在产前１周（妊娠２２ｄ）流产。     

SSEA-1、SSEA-3、Oct-4及hTERT在人胚胎生殖细胞中的表达

分离5~9周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜,采用组织块法进行体外培养,免疫细胞化学染色法检测SSEA-1、SSEA-3、Oct-4及hTERT在人胚胎生殖细胞中的表达,以证实利用组织块体外培养所获得的细胞为未分化的人胚胎生殖细胞。结果表明:组织块体外培养得到的细胞或细胞集落均阳性表达SSEA-1、SSEA-3、Oct-4及hTERT,说明组织块体外培养获得的细胞为未分化的人胚胎生殖细胞。     

不同培养体系对绵羊体外受精胚胎发育及细胞凋亡的影响

[目的]通过SOFaaBSA和CR1 aaBSA - FBS两种培养液对体外胚胎发育率及胚胎凋亡发生的影响,筛选适合绵羊体外受精胚胎发育的培养体系,为相关研究提供一定的理论依据和研究基础.[方法]采用激光共聚焦显微镜和细胞原位凋亡检测技术(TUNEL),分析这两种胚胎体外培养系统的绵羊体外受精胚胎发育的影响及各发育阶段的细胞凋亡状况及对胚胎发育的影响.[结果]SOFaaBSA和CR1aaBSA- FBS组的卵裂率、囊胚率和囊胚孵化率均高与其它实验组,但这两组之间差异不显著(P＞0.05).同时,在两种培养液培养的2细胞、3-8细胞期的绵羊体外受精正常形态的胚胎中均未发现凋亡信号,凋亡信号在两种培养液中都是首次出现在9- 16细胞胚胎细胞中,并且随着胚胎发育至囊胚期,凋亡细胞效随着胚龄增长越来越多.在SOFaaBSA培养液培养的桑椹胚和囊胚细胞胚胎凋亡率显著低于CR1aaBSA - FBS培养液培养的桑椹胚和囊胚(P＜0.05),同时,在CR1aaBSA- FBS培养液中桑椹胚和囊胚细胞平均具有凋亡细胞的数量显著高于SOFaaBSA培养液(P＜0.05).[结论]CR1aaBSA- FBS培养系统显著的增加了绵羊晚期体外胚胎的凋亡.CR1 aaBSA - FBS能够支持绵羊体外受精胚胎的发育,但SOFaaBSA培养液更适合绵羊体外胚胎的发育.     

猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究了不同生殖时期猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响,以此建立了适于早期小鼠转基因胚胎体外培养的猪输卵管上皮细胞共培养体系,并用PCR法对体外培养发育到不同阶段的小鼠转基因胚胎进行了外源基因整合检测。结果表明,在受孕初期的猪输卵管上皮细胞(无论是原代还是传代细胞)上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率显著高于发情间期的猪输卵管上皮细胞(P<0.01);在相同生殖时期猪输卵管原代和传代上皮细胞上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率差异不显著;在转基因胚胎不同发育阶段,PCR检测呈阳性的胚胎比率分别为:2-细胞期为96%,4-细胞期为63%,8-细胞期为43%,囊胚期为19%。由此可见,受孕初期的猪输卵管上皮细胞可促进与之体外共培养的小鼠早期胚胎的发育;随着早期小鼠转基因胚胎的发育,PCR检测呈阳性的转基因胚胎的比率逐渐降低。     

超速冷冻8—细胞鼠胚

用３．５Ｍ和２．５Ｍ ＤＭＳＯ作冷冻保护剂进行超速冷冻８－细胞鼠胚。用前者作保护剂的鼠胚，无论在体外培养和体内发育的情况都好于后者。前者中的８－细胞鼠胚解冻后的存活率为７８．９％；存活胚胎体外发育到囊胚的比率为８３．４％，体内附植率为６３．９％，胎儿形成率为４３．２％。实验证明，超速冷冻保护存胚胎是一种省时，省力，省钱的好方法。     

β—转换生长因子对牛体外受精卵体外发育的影响

本研究主要检测ＴＧＦ－β对牛早期胚胎体外发育和移植后的成活率的影响，在试验１和试验２，添加０．３－７．０ｎｇ／ｍＬ的ＴＧＦ－β至无论是复杂培养液还是各成分已知的简单培养液中，囊胚中内细胞团细胞都不同程度地增长，比对照组的囊胚多０．５－１．０倍；此外在含有３．０－５．０ｎｇ／ｍＬ的ＴＧＦ－β的培养液中的囊胚，其孵化率显著地高于对照组。     

小鼠胚胎切割取样后体外培养发育能力的研究

本文对小鼠胚胎切割取样细胞数量的多少，取样后胚胎在室温中停留时间以及透明带存留与否的体外发育情况进行了研究，目的在于为牛胚胎性别鉴定切割取样时供借鉴和探讨。实验中的胚胎依据切割取样的细胞数分１０个细胞以内和大于１０个细胞以上两个组。其体外培养发育率分别为９５．７％（６７／７０）和７６．２％（３２／４２），两者差异极显著（Ｐ＜０．０１）；其中晚期桑椹胚、早期羹胚、扩展囊胚的体外发育率分别为８７．７％（６４／７３）、８６．２％（２５／２９）、１００％（１０／１０），三者之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）；培养前在室温下停留３～７ｈ和９ｈ的体外培养发育率分别为９４．８％（７３／７７）、５７．１％（２０／３５），两者差异极显著（Ｐ＜０．０１）；胚胎取样后透明带存留和脱失的体外培养发育率分别为８７．９％（５１／５８）和８３．３％（４５／５４），两者差异不显著（Ｐ＞０．０５）。     

猪卵子的体外成熟与体外受精研究

从屠宰猪卵巢中取出卵子，在体外培养30小时后卵丘扩散率为70．48％，第一极体释放率15．39％。卵丘层扩散的卵子体外获能的猪精液授精，受精率平均9．56％。将受精卵培养24小时，有51．22％卵子发育到2－细胞期，7．32％发育至4－细胞期。从经超数排卵的猪卵巢中取下3枚A级卵，用体外获能猪精液授精，培养24小时，其中2枚达到2－细胞期，再继续培养48小时，均达到16－细胞期。     

体外生产的牛胚胎在不同发育期的性比率

本研究旨在证实牛体外培养的雄性胚胎生长发育是否快于雌性胚胎。胚胎的性别鉴定采用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术。在体外受精的第５天，胚胎根据发育期划分为三个组：１６细胞期，多于１６细胞期和桑椹期。在３个组中，雄性胚胎所占百分率分别是３２％，５３％和６３％。在体外受精的第７天，胚胎根据发育期划分为４个组：桑椹期、早期囊胚期、囊胚期和扩张囊胚期。在性别鉴定后，４个组中雄性胚胎所占百分率分别是２８％，３８％，６０％和７０％。结果表明：牛早期胚胎在体外培养条件下，雄性发育快于雌性。     

乳酸钠对小鼠1—细胞胚胎体外发育的影响

小鼠 1-细胞胚胎在含10.8,16.2,21.6和32.4 mM 乳酸钠不同 Whitten's 液中培养时,分别有2.6%,172%,8.5%和0%的胚胎发育到扩展囊胚。在4种培养液中均有60%以上的胚胎完成了第1次卵裂,发育到2-细胞期,但以后的发育则有明显差异。培养液中较高浓度乳酸钠的存在,可能是造成小鼠胚胎体外培养的“2-细胞早期阻断”的原因之一。     

速冻中低温保护剂浓度对小鼠胚胎发育的影响

用快速冷冻方法，冷冻小鼠的２－细胞胚、４－细胞胚、８－细胞胚、桑椹胚和囊胚，低温保护液分别含有０．５，１．５，２．５，４ｍｏｌ／Ｌ丙二醇，含１０％的犊牛血清和０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖。对于８－细胞以前的小鼠胚胎，快速冷冻保存时丙二醇的浓度在２．５ｍｏｌ／Ｌ和４ｍｏｌ／Ｌ时效率较好。随着小鼠早期胚胎（囊胚以前）的发育，抗低温冷的能力加强。     

速冻中低温保护剂浓度对小鼠胚胎发育的影响

用快速冷冻方法，冷冻小鼠的２－细胞胚、４－细胞胚、８－细胞胚、桑椹胚和囊胚，低温保护液分别含有０．５，１．５，２．５，４ｍｏｌ／Ｌ丙二醇，含１０％的犊牛血清和０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖，对于８－细胞以前的小鼠胚胎，快速冷冻保存时丙二醇的浓度在２．５ｍｏｌ／Ｌ和４ｍｏｌ／Ｌ时效果较好，随着小鼠早期胚胎（囊胚以前）的发育，抗低温冷冻的能力加强。     

绵羊8—16细胞胚胎的超微结构

利用透射电镜技术研究了绵羊８－１６细胞胚胎的超微结构，并与２细胞胚胎作了比较．结果表明，８－１６细胞胚胎卵裂球间以间隙连接联系，胞质主要成分是一种带有界膜的囊泡，线粒体丰富，以带帽线粒体为主，也有少量横嵴线粒体，１６细胞胚胎中，后者的比例高于８细胞胚胎．与２细胞胚胎相比，８─１６细胞胚胎的高尔基体发达．但滑面内质网数量减少、８细胞胚胎卵裂球具有数个致密的球形或环形核仁前体，１６细胞胚胎的核仁中出现次级小泡腔，标志着ｒＲＮＡ开始合成．     

不同时期鸡胚体外培养及其影响因素的研究

采用代用蛋壳体外培养方法，对不同时期鸡胚胎换蛋壳培养进行了研究。结果表明：体外受精卵体外培养发育率为10％。X期胚胎体外培养的出雏率为1.2%；孵化1日龄胚胎体外培养的出雏率为7.9%；去1／4壳的鸡胚出雏率为3.7%；鸡胚胎换蛋壳以后，添加6－8mL稀蛋白对换壳鸡胚发育比较适宜。