Vaccinia virus: a tool for research and vaccine development

Vaccinia virus is no longer needed for smallpox immunization, but now serves as a useful vector for expressing genes within the cytoplasm of eukaryotic cells. As a research tool, recombinant vaccinia viruses are used to synthesize biologically active proteins and analyze structure-function relations, determine the targets of humoral- and cell-mediated immunity, and investigate the immune responses needed for protection against specific infectious diseases. When more data on safety and efficacy are available, recombinant vaccinia and related poxviruses may be candidates for live vaccines and for cancer immunotherapy.     

猪圆环病毒2型标签重组病毒构建和免疫试验

猪圆环病毒2型（PCV2）能引起断奶仔猪衰竭综合症,为了获得利于纯化的病毒和新型标记疫苗,采用病毒重组技术,选择利于纯化的6个氨基酸His标签作为标记表位,插入PCV2 Cap蛋白 C端,拯救获得重组标记病毒rPCV2-His。间接免疫荧光和Western blot鉴定结果证明重组病毒所含的标签能稳定表达。通过镍柱纯化重组病毒,该病毒获得了纯化。纯化的重组病毒灭活后免疫小鼠,PCV2特异抗体显著提升,且能产生标记免疫抗体,小鼠攻毒显著降低体内PCV2含量。该重组病毒可作为PCV2新型疫苗研究重要材料。     

盐穗木HcPS_H基因真核表达载体的构建及转化

[目的]盐穗木(Halostachys caspica)属藜科盐生植物,是广泛分布于新疆干旱或半干旱荒漠盐碱环境中的一种极端耐盐的多年生稀盐多汁半灌木,对盐分适应性极强.PS_H基因是一个参与光合反应光系统的基因,在植物光合作用中起着重要的作用.构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体对于了解该基因在盐穗木耐盐过程中的作用有着重要意义.[方法]利用PCR技术扩增得到大小为441 bp的盐穗木HcPS_H基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒HcPS_H-5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒HcPS_H-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体,并且能在真核细胞中正常表达.     

表达鹅细小病毒VP3基因重组腺病毒的构建与鉴定

[目的]构建表达鹅细小病毒 （GPV） VP3基因的重组腺病毒,为机体免疫试验和免疫效果评价奠定基础.[方法]以重组质粒pcDNA-VP3为模板,以GPV-VP3为目的基因,构建GPV-VP3重组腺病毒载体,通过转染获得能稳定表达GPV-VP3基因的重组腺病毒,通过IFA和Western-blot检测GPV-VP3基因的表达情况.[结果]扩增到的GPV-VP3基因全长为1 605 bp,线性化的重组腺病毒穿梭质粒pCR259-VP3能在QBI-HEK293细胞中瞬时表达GPV-VP3基因,表达蛋白的分子量约为60Ku.[结论]该重组腺病毒的构建将为GPV新型疫苗研发和后期体内试验奠定基础.     

A nitric oxide-inducible lactate dehydrogenase enables Staphylococcus aureus to resist innate immunity

Staphylococcus aureus is one of the most successful human pathogens, colonizing 2 billion individuals worldwide and causing invasive infections even in immunocompetent hosts. S. aureus can evade multiple components of host innate immunity, including the antimicrobial radical nitric oxide (NO.) produced by activated phagocytes. We show that S. aureus is capable of metabolically adapting to nitrosative stress by expressing an NO.-inducible L-lactate dehydrogenase (ldh1, SACOL0222) divergently transcribed from the NO.-detoxifying flavohemoglobin (hmp). L-Lactate production allows S. aureus to maintain redox homeostasis during nitrosative stress and is essential for virulence. NO.-inducible lactate dehydrogenase activity and NO. resistance distinguish S. aureus from the closely related commensal species S. epidermidis and S. saprophyticus.     

可感染茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒的构建

【目的】构建能够感染家蚕和茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒（rBmNPV）,解决EoNPV扩增困难而不易获得的难题。【方法】通过Bac-to-Bac系统构建具备BmNPV的多角体蛋白基因（polh）表达盒和EoNPV的解旋酶基因（hel）表达盒的重组家蚕核型多角体病毒。【结果】家蚕或家蚕细胞扩增的rBmNPV可以感染茶尺蠖并致病,表明rBmNPV的宿主域拓展至茶尺蠖。【结论】成功构建了能够感染茶尺蠖的rBmNPV,为利用家蚕作为宿主来生产重组病毒杀虫剂打下基础。     

表达犬瘟热病毒融合蛋白基因重组腺病毒的构建与鉴定

利用pVAX1载体的表达元件CMV启动子和poly(A)多聚腺苷酸信号构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因(F)的重组犬腺病毒。首先,利用酶切、连接等实验方法构建了含CDV启动子F蛋白基因表达盒的转移质粒pVAXΔE3LPF。再以含CAV-2SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建重组质粒pCAV-2-pVAXLPF,利用脂质体介导方法转染MDCK细胞,转染3次后,细胞出现了典型的犬腺病毒感染样病变。电镜负染和切片观察、酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明,成功构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因的重组犬腺病毒,表达的融合蛋白分子质量为72ku。在MDCK细胞上连续传30代试验表明重组病毒CAV-2-pVAXLPF具有良好的遗传稳定性。     

dsRNA介导的抗ToMV和CMV植物表达载体的构建

[目的]构建通过表达dsRNA,诱导植物基因沉默机制可抗2种病毒的表达载体.[方法]根据已报道番茄花叶病毒(ToMV)的运动蛋白基因(MP)和黄瓜花叶病毒(CMV)的沉默抑制子基因(2b)的核苷酸序列设计特异性引物,扩增到部分△MP和2b基因;然后通过重组PCR技术将2个病毒基因进行融合,获得长度为676 bp的融合基因△MP-2b.再将融合基因以反向重复的方式与大豆内含子相连,并定向插入到植物表达载体pBIN438上35S启动子下游.[结果]构建了含两种不同病毒来源基因的植物表达载体pBIN438△MP-2b(i/r).酶切和PCR鉴定证明所构建的载体与预期的设计完全一致.[结论]为利用RNA沉默原理进行植物广谱抗病研究奠定了基础.     

谷氨酸棒杆菌麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因的克隆与表达

从谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)基因组中克隆到麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因(treZ),将其插入大肠杆菌表达载体pRSET-B并转化宿主菌E.coli BL21(DE3)pLysS获得重组基因工程菌。经IPTG诱导表达,得到麦芽寡糖基海藻糖水解酶,溶解表达的目的蛋白约占胞内总蛋白的40%,有部分目的蛋白形成包涵体。经薄层层析与离子色谱共同检测证实,该麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)与麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)共同作用于糊精溶液,可得到产物海藻糖,具有工业应用前景。     

谷氨酸棒杆菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆与表达

采用PCR方法从谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）基因组中分离得到2.4 kb的麦芽寡糖基     

人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因腺病毒载体的构建及包装

【目的】构建能够表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的腺病毒。【方法】通过对PCI-neo-hTERT质粒的改造,依次构建出JMB293-hTERT、pAdTrack-hTERT载体,将pAdTrack-hTERT经PmeⅠ线性化后与pAdEasy-1载体共转化到 BJ5183 细菌中进行重组,经卡那霉素抗性筛选获得重组腺病毒载体pAdEasy-hTERT。将pAdEasy-hTERT PacⅠ酶切线性化并回收后,转染HEK293人胚肾细胞,培养7 d后,收集细胞并反复冻融,收集细胞裂解液;反复扩增3次后,测定重组hTERT腺病毒的滴度。【结果】①利用酶切连接的方法得到了穿梭载体pAdTrack-hTERT;②通过同源重组将外源目的基因hTERT整合到腺病毒骨架载体中,得到重组质粒pAdEasy-hTERT;③成功获得了滴度为6.73×10¹⁰ GFU/mL的高滴度腺病毒颗粒。【结论】含有hTERT基因的重组腺病毒颗粒包装成功,为后续哺乳动物原代细胞永生化研究奠定了基础。     

鹦鹉幼雏病毒结构蛋白VP1基因的克隆及原核表达

采用湖北省云梦县患鹦鹉幼雏病死亡的虎皮鹦鹉体内分离得到的鹦鹉幼雏病毒(budgerigar fledgling disease virus，BFDV)，应用PCR方法获得BFDV主要结构蛋白基因(VP1)，克隆到pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18T-VP1并进行测序，结果显示，结构蛋白基因(VP1)与BFDV欧美分离株的同源性为96％～99％，表明VP1是BFDV保守基因；将VP1亚克隆到原核表达载体pET32( )b，构建重组质粒pET32( )b-VP1，转化菌株BL21(DE3)，诱导表达，经SDS-PAGE和Westem-blot分析，克隆在his-tag下游的结构蛋白基因获得了高效融合表达，表达的融合蛋白分子量约为55 kD。为建立快速、灵敏的鹦鹉幼雏病毒血清学检测方法以及研制基因工程疫苗提供了科学依据。     

禽流感病毒疫苗研究进展

疫苗接种仍然是防控禽流感的最有效措施之一,目前有紧急接种、预防接种、系统接种及替代接种等4种常见形式。禽流感疫苗的主要类型包括灭活全病毒疫苗、亚单位疫苗、重组病毒载体疫苗、DNA疫苗、复制缺陷型疫苗、病毒样颗粒疫苗及通用疫苗等,影响其免疫效果的因素有免疫原选择及佐剂类型、病毒变异、决策机构的反应速度、免疫覆盖率、疫苗质量及稳定性、遗传结构及机体免疫状态、加强免疫方案等。鉴于传统禽流感疫苗不能对不同亚型禽流感病毒（AIV）及变异株提供交叉保护,且所使用的油佐剂副作用较大,对动物机体损伤较严重,今后应加强研制新型免疫佐剂及其他更安全高效的新型疫苗来弥补现有禽流感疫苗的不足。     

Oral Salmonella typhimurium vaccine expressing circumsporozoite protein protects against malaria

Immunization with radiation-attenuated malaria sporozoites induces potent cellular immune responses, but the target antigens are unknown and have not previously been elicited by subunit vaccines prepared from the circumsporozoite (CS) protein. A method is described here for inducing protective cell-mediated immunity to sporozoites by immunization with attenuated Salmonella typhimurium transformed with the Plasmodium berghei CS gene. These transformants constitutively express CS antigens and, when used to immunize mice orally, colonize the liver, induce antigen-specific cell-mediated immunity, and protect mice against sporozoite challenge in the absence of antisporozoite antibodies. These data indicate that the CS protein contains T cell epitopes capable of inducing protective cell-mediated immunity, and emphasize the importance of proper antigen presentation in generating this response. Analogous, orally administered vaccines against human malaria might be feasible.     

Development and testing of AIDS vaccines

Recent advances in delineating the molecular biology of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) have led to innovative approaches to development of a vaccine for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). However, the lack of understanding of mechanisms of protective immunity against HIV-1, the magnitude of genetic variation of the virus, and the lack of effective animal models for HIV-1 infection and AIDS have impeded progress. The testing of AIDS vaccines also presents challenges. These include liability concerns over vaccine-related injuries; identification of suitable populations for phase 3 efficacy studies; balancing the ethical obligation to counsel research subjects to avoid high-risk behavior with the necessity to obtain vaccine efficacy data; and the effect of vaccine-induced seroconversion on the recruiting and welfare of trial volunteers. Several candidate AIDS vaccines are nevertheless currently under development, and some are undergoing phase 1 clinical trials. Rapid progress will depend on continued scientific advancement in conjunction with maximum use of resources, open information and reagent exchange, and a spirit of international collaboration.     

表达H9亚型禽流感病毒HA基因重组鸭肠炎病毒的构建

【背景】H9亚型禽流感病毒（AIV）存在宿主范围扩大、毒力增强的趋势,并为其他亚型AIV重排提供基因,给养禽业和公共卫生造成极大威胁。水禽不仅是流感病毒的宿主,更是其天然储存库,在禽流感病毒的传播和变异中发挥着重要作用。因此有效控制水禽感染对养禽业健康发展、公共卫生安全具有重要意义。鸭肠炎病毒（DEV）属于疱疹病毒,能感染鸭、鹅等雁形目禽类,可引起产蛋下降及高死亡率。DEV基因组大,免疫原性好,具有开发成活疫苗载体的潜力。【目的】构建缺失gE基因、表达H9亚型AIV HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA,探讨重组病毒rDEV-△gE-HA作为防治DEV-AIV的二联重组活载体疫苗的可行性。【方法】以H9N2亚型禽流感病毒HA基因作为靶基因,构建含有HA基因表达盒的转移载体pT-gE-HA,将其与携带绿色荧光蛋白标记的重组rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞后,进行蚀斑筛选、纯化表达HA基因的重组病毒rDEV-△gE-HA;利用PCR、基因测序鉴定重组病毒;在CEF中连续传代重组病毒20次,测定外源基因传代稳定性。以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,分析重组病毒rDEV-ΔgE-HA对致死性DEV强毒攻毒保护效果;将不同剂量（10 ³-10 ⁶TCID₅₀）rDEV-△gE-HA免疫鸭,免疫后14、21、28 d分别采集血清,测定H9血凝抑制（HI）抗体,并在免疫后28 d,以10 ⁸EID₅₀的剂量静脉注射H9N2 AIV（A/duck/GD/08）,攻毒后2 d,采集喉拭子,进行病毒分离试验。【结果】将构建的转移质粒载体pT-gE-HA与rDEV-△gE-GFP共转染CEF细胞,经过3轮蚀斑筛选,获得纯化的重组病毒rDEV-△gE-HA。PCR鉴定及基因测序结果显示,HA基因成功地插入到DEV基因组中,替换了绿色荧光蛋白。重组病毒在CEF中至少能稳定传代20代。重组病毒rDEV-ΔgE-HA以10 ³ TCID₅₀免疫易感鸭,能抵抗致死性DEV强毒攻击。重组病毒rDEV-ΔgE-HA免疫易感鸭后14 d,各剂量免疫组均能检测到H9 HI抗体效价;免疫后21日,各组抗体效价水平略有上升,10 ³TCID₅₀剂量免疫组HI抗体效价达到1:2 ⁴,而10 ⁴-10 ⁶TCID50剂量免疫组HI抗体效价在1:2 ^2.4-1:2 ³。免疫鸭后28 d,用H9N2 AIV进行攻毒,10 ³、10 ⁴、10 ⁶TCID₅₀免疫组均未从喉拭子分离到病毒H9N2,说明能完全保护,阻止喉头排毒,而10 ⁵TCID₅₀免疫组保护率为80%（4/5）,1/5病毒分离阳性。【结论】成功构建了稳定表达H9亚型AIV HA基因的重组DEV,该重组病毒保留了亲本毒的免疫原性,能抵抗致死性DEV强毒的攻击;免疫鸭后能诱导产生AIV HI抗体,尽管HI抗体滴度不高,但至少80%免疫鸭能阻止排毒。该研究为研制DEV-H9亚型AIV二联重组活载体疫苗奠定了基础。     

重组昆虫杆状病毒杀虫剂研究进展

从亲本病毒及其启动子的选择，外源毒素基因，昆虫专性激素和酶基因，增效基因，标记基因，宿主反义RNA基因的引入，病毒自身基因的修饰以及重组病毒的安全性等方面综述了该领域的最新研究进展。     

可溶性Sox2-11R重组蛋白的制备与鉴定

旨在通过原核表达制备可溶性Sox2-11R重组蛋白,并验证其穿膜能力。首先,采用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)与蛋白转导域11聚精氨酸（11 arginine, 11R）的融合表达和与成纤维细胞的共孵育验证11R的穿膜能力。其次,将目的基因Sox2-11R在原核表达载体pET30a中表达,通过优化表达条件获取可溶性Sox2-11R重组蛋白。最后,利用Ni柱纯化重组蛋白,SDS-PAGE及Western blotting对其进行鉴定;并用免疫荧光染色验证重组蛋白是否具有进入细胞核的能力。结果表明,成功构建了pET30a-Sox2-11R原核表达载体,纯化的Sox2-11R重组蛋白具有穿膜能力,且在细胞培养基中具有较高溶解度,这为制备其他重编程因子的重组蛋白提供了参考,也为外源蛋白诱导iPSCs奠定了基础。     

Newcastle disease virus-based MERS-CoV candidate vaccine elicits high-level and lasting neutralizing antibodies in Bactrian camels

Middle East respiratory syndrome coronavirus(MERS-Co V),a member of the Coronaviridae family,is the causative pathogen for MERS that is characterized by high fever,pneumonia,acute respiratory distress syndrome(ARDS),as well as extrapulmonary manifestations. Currently,there are no approved treatment regimens or vaccines for MERS. Here,we generated recombinant nonvirulent Newcastle disease virus(NDV) La Sota strain expressing MERS-Co V S protein(designated as r LaMERS-S),and evaluated its immunogenicity in mice and Bactrian camels. The results revealed that r La-MERS-S showed similar growth properties to those of La Sota in embryonated chicken eggs,while animal immunization studies showed that r La-MERS-S induced MERS-Co V neutralizing antibodies in mice and camels. Our findings suggest that recombinant r LaMERS-S may be a potential MERS-Co V veterinary vaccine candidate for camels and other animals affected by MERS.     

牛源犬新孢子虫NcSAG1基因重组腺病毒株的构建及动物免疫试验

【目的】构建表达牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,并接种Balb/c小鼠,评价重组腺病毒株对Balb/c小鼠的体液免疫和细胞免疫应答水平。【方法】PCR扩增牛源犬新孢子虫NcSAG1基因,构建pMD18-T-NcSAG1克隆质粒和pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒;将鉴定正确的pCR259-NcSAG1重组腺病毒穿梭质粒依次转化HighQ-1 Transpose-Ad 294和HighQ-1™感受态细胞,构建Transpose-Ad-NcSAG1重组腺病毒表达质粒;PacI酶切线性化后,脂质体介导转染QBI-HEK 293细胞包装重组腺病毒Ad5-NcSAG1,应用PCR和Western blotting技术检测Ad5-NcSAG1及其表达蛋白产物。测定Ad5-NcSAG1重组腺病毒滴度后,接种Balb/c小鼠,测定小鼠血清中IgG特异性抗体和细胞因子IFN-γ、IL-4水平,以此评价重组腺病毒株的免疫应答效果。【结果】扩增的牛源犬新孢子虫NcSAG1基因大小为982bp,与GenBank中发表的NcSAG1（AF132217）核苷酸序列的同源性为99.2%;经PCR和Western blotting检测,重组腺病毒Ad5-NcSAG1在QBI-HEK 293细胞中包装成功,表达蛋白的分子量为33kD,具有较好的反应原性;测得重组腺病毒Ad5-NcSAG1滴度为1010TCID50/mL,Ad5-NcSAG1接种Balb/c小鼠后,能够诱导产生高水平的IgG特异性抗体和IFN-γ、IL-4细胞因子。说明Ad5-NcSAG1重组腺病毒对Balb/c小鼠产生了较强的体液免疫和细胞免疫应答。【结论】成功构建了牛源犬新孢子虫NcSAG1基因的重组腺病毒株,该毒株能够诱导Balb/c小鼠产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答,为犬新孢子虫新型疫苗的临床试验奠定了基础。