人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因腺病毒载体的构建及包装

【目的】构建能够表达人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的腺病毒。【方法】通过对PCI-neo-hTERT质粒的改造，依次构建出JMB293-hTERT、pAdTrack-hTERT载体，将pAdTrack-hTERT经PmeⅠ线性化后与pAdEasy-1载体共转化到 BJ5183 细菌中进行重组，经卡那霉素抗性筛选获得重组腺病毒载体pAdEasy-hTERT。将pAdEasy-hTERT PacⅠ酶切线性化并回收后，转染HEK293人胚肾细胞，培养7 d后，收集细胞并反复冻融，收集细胞裂解液；反复扩增3次后，测定重组hTERT腺病毒的滴度。【结果】①利用酶切连接的方法得到了穿梭载体pAdTrack-hTERT；②通过同源重组将外源目的基因hTERT整合到腺病毒骨架载体中，得到重组质粒pAdEasy-hTERT；③成功获得了滴度为6.73×10¹⁰ GFU/mL的高滴度腺病毒颗粒。【结论】含有hTERT基因的重组腺病毒颗粒包装成功，为后续哺乳动物原代细胞永生化研究奠定了基础。