人端粒酶催化亚基hTERT活性中心基因的克隆及其真核表达载体的构建

人端粒酶催化亚基是端粒酶活性所必须的组分，通过提取端粒酶活性癌组织的mRNA，反转录获得端粒酶活性中心基因的cDNA片段，PCR扩增获得端粒酶催化亚基活性中心基因，并将扩增产物连入真核表达载体pCR3.1，利用pCR3.1载体的自身特点即具有T7启动子，可在真核细胞内启动基因的转录与表达，为将来获得端粒酶酶活性中心蛋白，研究其结构与功能奠定了基础，从而为解决肿瘤问题提供新的思路。     

端粒酶基因的腺病毒包装条件优化及其 活性功能验证

[目的]构建携带人类端粒酶催化亚基基因(hTERT)的腺病毒载体并优化其包装条件,为进一步探究端粒酶与细胞重编程调控间的作用机理提供参考依据.[方法]利用腺病毒载体pAdEasy-1构建携带hTERT基因的重组腺病毒载体,分别采用脂质体法和电转法及不同浓度胎牛血清在HKE293A细胞中进行包装,筛选出最佳病毒包装条件,收集重组腺病毒rAd-hTERT并体外感染小鼠胎儿成纤维细胞,验证重组腺病毒rAd-hTERT的活性功能.[结果]以腺病毒载体pAdEasy-1为骨架质粒,成功构建获得携带hTERT基因的重组腺病毒载体(pAd-hTERT),其最佳病毒包装条件是采用脂质体法结合15%胎牛血清,此条件下收集获得的病毒滴度最高(1×1011 IFU/mL).以携带hTERT基因的腺病毒rAd-hTERT感染小鼠胎儿成纤维细胞72 h后,可扩增出片段大小约3450 bp的目的基因条带,即hTERT基因在小鼠胎儿成纤维细胞中成功表达.[结论]采用脂质体法结合15%胎牛血清包装获得的携带hTERT基因重组腺病毒具有较高病毒滴度,感染小鼠胎儿成纤维细胞能成功表达hTERT基因,进一步证实端粒酶具有蛋白功能的生物学活性.     

人乳铁蛋白腺病毒载体的构建及细胞表达

将人乳铁蛋白基因与腺病毒基因组骨架质粒重组,在293细胞中包装重组腺病毒颗粒,获得真核细胞表达的栽体pAd-hLTF.以pcDNA3X为模板,PCR扩增hLTF基因,腺病毒穿梭栽体pshuttle-cmv与hLTF重组为pshuttle-cmv-hLTF:再与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组为pAd-hLTF质粒:脂质体法将重组pAd-hLTF质粒转染HEK 293细胞.包装成重组腺病毒颗粒.Western blot和ELISA法测定细胞中hLTF基因的表达.结果表明,pAd-hLTT质粒转染293细胞后,7～10 d后,获得细胞裂解液,将细胞裂解产物再次接种新鲜的293细胞,3～5 d后,80%以上的细胞变圆、膨胀、漂浮.Westem blot和ELISA结果显示,上清液中有hLTF基因的表达,为重组人乳铁蛋白的体外表达及其功能分析奠定了基础.     

水貂生长激素基因重组腺病毒的构建

本研究利用AdEasyTMXL腺病毒载体系统构建了水貂生长激素基因重组腺病毒。利用PCR、酶切、凝胶回收等方法,从质粒pCMVmGH中获得水貂生长激素基因(mGH),构建穿梭质粒pShuttle-CMV-mGH。pShuttle-CMV-mGH经PmeⅠ酶切线性化后转化至BJ5183感受态大肠杆菌内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1进行同源重组,构建重组腺病毒质粒pAd-CMV-mGH。重组质粒经PacⅠ酶切线性化后转染AD-293细胞。PacⅠ酶切结果表明质粒重组成功。转染第10天,细胞出现圆缩、死亡、漂浮等典型病变,透射电镜检测到重组病毒。TCID50测得第2代重组病毒的滴度达到10-7.89/0.1ml。RT-PCR结果证实,重组病毒能够正确转录目的基因。结果表明本试验成功构建了水貂生长激素基因重组腺病毒,为水貂促生长的研究提供了新的科学手段。     

狂犬病毒CVS株G基因和IFN-a基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过RT-PCR方法扩增得到狂犬病毒G基因,PCR方法得到IFN-Αa基因并亚克隆入pIRES获得pIRES-a质粒.双酶切G基因和pIRES-a质粒并回收目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒.线性化后的重组腺病毒质粒转染人胚肾293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒.结果表明:该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达,说明成功构建了G和IFN-a双基因共表达重组腺病毒载体.     

猪Ⅱ型圆环病毒Cap基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪Ⅱ型圆环病毒(PCV2)衣壳蛋白Cap基因的重组腺病毒表达载体。首先将Cap基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV上,再将重组质粒pAdTrack-CMV／Cap用Pme Ⅰ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-Cap。为进一步研究PCV2腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

狂犬病毒CVS株G基因和N基因共表达重组腺病毒载体的构建

通过引入内部核糖体进入位点序列,构建狂犬病毒G基因和N基因共表达的腺病毒载体。通过RT-PCR方法扩增得到RVG基因、N基因。N基因先亚克隆入pIRES质粒;G基因经Kpn I和Mlu I,pIRES-N质粒经Mlu I、Not I双酶切,回收目的基因后与经Kpn I和Not I双酶切处理的腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV连接,再与pAdEasy-1质粒在BJ5183菌中同源重组产生腺病毒载体质粒。线性化后的重组腺病毒质粒转染293细胞,通过观察报告基因绿色荧光蛋白的表达鉴定重组的腺病毒,RT-PCR 法检测狂犬病毒糖蛋白和核蛋白基因片段。该重组病毒质粒经酶切鉴定与预期结果一致;转染293细胞后观察到绿色荧光蛋白的表达;RT-PCR 法可检测到糖蛋白和核蛋白基因片段。试验成功构建了G和N双基因共表达重组腺病毒载体,为狂犬病活载体疫苗的研制提供了依据。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2基因重组腺病毒表达载体的构建

通过细菌内同源重组的方法成功构建了含有猪细小病毒(PPV)VP2基因的重组腺病毒表达载体。将VP2基因亚克隆连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV上,并将重组质粒pShuttle-CMV/VP2用Pme I线性化后转化至携带有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-VP2,为进一步研究PPV腺病毒活载体疫苗奠定了基础。     

野生型PTEN基因重组腺病毒表达载体构建的改进及其鉴定

目的为改进构建野生型抑癌基因PTEN重组腺病毒表达载体的方法。方法用抑癌基因PTEN与带有绿色荧光蛋白基因的穿梭载体pAdTrack-CMV重组后转化含腺病毒骨架载体pAdEasy1的E.coliBJ5183(Ad-1 cells),以获得重组腺病毒质粒,经限制酶PacⅠ线性化后,转染293细胞,检测PTEN蛋白的表达,并以Ad-PTEN感染人乳腺癌MCF-7细胞后,测其感染率。结果获得PTEN基因的重组腺病毒表达载体(Ad-PTEN),受Ad-PTEN转染的293细胞发生肿胀或圆缩的形态改变,经PCR对传代的Ad-PTEN分析证实得到目的基因PTEN,荧光显微镜下能观察到293细胞内有绿色荧光。通过Western blot可检测到293细胞中PTEN蛋白高效表达。Ad-PTEN感染的人乳腺癌MCF-7细胞,感染率达80%~90%。结论PTEN重组腺病毒表达载体可在细菌体内进行同源重组而构建,方法较简便、快速,且生成的病毒滴度高、感染率高。     

脱氧核酶对端粒酶hTERT mRNA的切割以及对鼻咽癌细胞凋亡相关基因的影响

目的:探讨脱氧核酶对端粒酶蛋白亚基hTERTmRNA的切割作用及对人鼻咽癌细胞凋亡相关基因表达的影响。方法:针对hTERT基因的核苷酸序列,合成“10～23”型脱氧核酶及其类似物,提取总RNA在体外切割hTERTmRNA;转染鼻咽癌细胞后,用RT-PCR扩增hTERT基因片段,用PCR-ELISA法测定端粒酶活性,用RT-PCR和荧光免疫测定凋亡相关基因bcl-2和bax的表达。结果:未经修饰的脱氧核酶DzT和在DzT的3'末段添加倒位连接T碱基的脱氧核酶DzTi在体外能够有效地切割hTERTmRNA;在转染鼻咽癌细胞后,DzTi比DzT对hTERTmRNA表现出更强的切割作用,DzTi能够显著地降低鼻咽癌细胞端粒酶活性(P<0.01)、抑制鼻咽癌细胞的生长(P<0.05)和bcl-2基因的表达(P<0.05),上调bax基因的表达(P<0.05)。DzT和DzTi的催化中心的一个碱基被替换后形成的脱氧寡核苷酸DzT'和DzTi'在体外和胞内均不表现对hTERTmRNA的切割作用。结论:人工合成的脱氧核酶确实能够高效特异地切割端粒酶hTERTmRNA,并降低鼻咽癌细胞的端粒酶活性,促进鼻咽癌细胞凋亡。作为一种新发现的催化性核酸,脱氧核酶在肿瘤的基因治疗领域中将具有极其重要的应用价值。     

表达犬瘟热病毒融合蛋白基因重组腺病毒的构建与鉴定

利用pVAX1载体的表达元件CMV启动子和poly(A)多聚腺苷酸信号构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因(F)的重组犬腺病毒。首先,利用酶切、连接等实验方法构建了含CDV启动子F蛋白基因表达盒的转移质粒pVAXΔE3LPF。再以含CAV-2SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建重组质粒pCAV-2-pVAXLPF,利用脂质体介导方法转染MDCK细胞,转染3次后,细胞出现了典型的犬腺病毒感染样病变。电镜负染和切片观察、酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明,成功构建了含犬瘟热病毒融合蛋白基因的重组犬腺病毒,表达的融合蛋白分子质量为72ku。在MDCK细胞上连续传30代试验表明重组病毒CAV-2-pVAXLPF具有良好的遗传稳定性。     

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测罗氏沼虾诺达病毒

用逆转录聚合酶链式反应方法,检测5尾来自广西某罗氏沼虾养殖场典型白肉病症状罗氏沼虾肌肉中的诺达病毒,结果是阳性5尾,占100%。该检测方法耗时短,特异性、实用性强,灵敏度高。     

mRNA差别显示技术及其在植物基因研究中的应用

mRNA差别显示技术是近年发展起来的一种用于分离和克隆正常与异常细胞之间差异表达基因的PCR方法 ,是目前筛选差异表达基因的有效方法之一 .自问世以来在动物遗传育种方面取得了很大的成绩 ,广泛用于人类及其他动物生长发育基因调控、基因克隆的研究 .在植物基因研究方面应用起步较晚 ,现已开始用于植物基因分析、杂种优势机理等方面的研究 .在此 ,该文介绍了mRNA差别显示技术的原理、步骤、优缺点及其发展 ,并对其在植物特异基因分离方面的研究及其应用前景做了探讨 .     

Construction of a universal recombinant expression vector that regulates the expression of human lysozyme in milk

The mammary gland provides a novel method for producing recombinant proteins in milk of transgenic animals. A key component in the technology is the construction of an efficient milk expression vector. Here, we established a simple method to construct a milk expression vector, by a combination of homologous recombination and digestion-ligation. Our methodology is expected to have the advantages of both plasmid and bacterial artificial chromosome (BAC) vectors. The BAC of mouse whey acidic protein gene (mWAP) was modified twice by homologous recombination to produce a universal expression vector, and the human lysozyme gene (hLZ) was then inserted into the vector by a digestion-ligation method. The final vector containing the 8.5 kb mWAP 5′ promoter, 4.8 kb hLZ genomic DNA, and 8.0 kb mWAP 3′ genomic DNA was microinjected into pronuclei of fertilized mouse embryos, to successfully generate two transgenic mouse lines that expressed recombinant human lysozyme (rhLZ) in milk. The highest expression level of rhLZ was 0.45 g·L⁻¹, and rhLZ exhibited the same antibacterial activity as native hLZ. Our results have provided a simple approach to construct a universal milk expression vector, and demonstrated that the resulting vector regulates the expression of hLZ in milk.     

普通PCR与TD-PCR扩增叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因的比较

为了比较普通PCR和降落PCR( TD - PCR)扩增Hepcidin基因的效果,通过Trizol法提取叶尔羌高原鳅肝胰脏总RNA并合成cDNA,分别利用普通PCR和降落PCR扩增Hepcidin基因片段.结果显示,降落PCR能有效扩增叶尔羌高原鳅Hepcidin.测序结果显示:叶尔羌高原鳅抗菌肽Hepcidin基因...     

携带人血清白蛋白cDNA的逆转录病毒质粒载体的构建

采用粘平端定向基因克隆技术,成功地构建了携带ＨＳＡｃＤＮＡ基因片段的重组逆转录病毒质粒载体ＧＩＮＨＳＡａ。经限制性酶切鉴定和菌落原位杂交证明ＨＳＡｃＤＮＡ已克隆到Ｇ１Ｎａ当中并得到９个重组病毒质粒载体阳性克隆。     

苏云金芽孢杆菌NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的克隆和敲除载体的构建

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki)8010为研究材料,通过PCR技术获得Bt 8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游2个片段,以含有卡那霉素抗性基因的pDG780质粒为中间载体,通过酶切、连接和PCR,构建含待敲除NAD(P)H:醌氧化还原酶基因上下游片段、卡那霉素抗性基因的重组质粒pRN5101DKU,为后续Bt8010菌株NAD(P)H:醌氧化还原酶基因的敲除做准备.     

苹果多胺氧化酶(PAO)基因家族鉴定与表达分析

从金冠基因组数据库中,利用BLAST网站在苹果中鉴定得到8个编码多胺氧化酶(polyamine oxidase,PAO)的家族基因(命名为MdPAO1~8),对其进行理化性质、系统进化、蛋白结构、基因结构和启动子元件分析。结果表明,MdPAO蛋白的分子量为54.053~64.813 ku,等电点介于5.16~6.02。根据进化树分析,MdPAO被分为3个亚家族(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ),且同一亚家族的成员具有相似的蛋白结构、基因结构和蛋白保守基序分布。利用GEO数据库检测出8个MdPAO在不同组织器官中的表达具有明显差异。以苹果主栽品种长富2号为材料,利用实时荧光定量PCR检测分析得出8个MdPAO在不同组织中的表达情况,结果表明,MdPAO3、MdPAO4、MdPAO5/6和MdPAO8在花中有较高的表达水平;MdPAO1/2和MdPAO7在茎和果中有较高的表达水平。外源亚精胺处理后发现,除MdPAO3以外,其余MdPAO的转录水平显著提高,表明MdPAO在PA代谢途径中具有重要作用。