具杀线虫活性烟草内生细菌的筛选及鉴定

植物寄生线虫是危害植物的重要病原物,为了筛选到能在烟草体内稳定定殖并且对线虫具有明显杀线虫活性的烟草内生生防细菌,从127株烟草内生细菌中筛选出5株对全齿复活线虫(Panagrellus redivivus)具有明显杀线虫活性的细菌。这5株细菌的发酵液稀释5倍处理线虫12 h后,线虫的死亡率均达90%以上;24 h后,死亡线虫虫体发生消解或渗漏。5株杀线虫细菌发酵液的杀线虫活性在12 h内随处理时间的延长而升高,随着稀释倍数的增加而降低。通过16S r DNA序列同源性分析将这5株杀线虫细菌中的4株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其余1株鉴定为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。     

杀松材线虫海洋细菌HT-11的鉴定及培养条件研究

[目的]从海洋中分离并筛选具有杀松材线虫活性的细菌。[方法]采用稀释涂布平板法对采自青岛近海海域的样品进行细菌分离,采用浸渍法测定菌株的杀线虫活性,并对筛选菌株的形态学、生理生化特性和16S r DNA序列进行测定,通过单因素试验筛选产生杀线虫活性物质的最适培养条件。[结果]共分离到36株海洋细菌,根据杀线虫活性筛选出1株具有高杀线虫活性的细菌HT-11。该菌株分离自牡蛎,其培养滤液处理松材线虫24 h的校正死亡率高达92.41%。根据形态学、生理生化特性和16S r DNA序列测定及其系统发育分析结果,将菌株HT-11鉴定为考克氏菌属(Kocuria)。单因素试验结果表明,该菌株在营养肉汤(NB)培养基中产生杀线虫活性物质的最适培养条件为:海水浓度100%,初始p H 7.0,培养温度25℃,培养时间3 d。[结论]该研究可为海洋微生物资源的开发及其杀松材线虫天然活性物质的利用提供理论依据。     

松材线虫生防放线菌的筛选、鉴定及其毒性因子初步研究

目的从土壤中筛选、鉴定出对松材线虫有较高杀灭活性的放线菌,并确定其毒力因子。方法以藤黄八叠球菌、枯草杆菌、大肠杆菌3个敏感菌株为抑菌检测对象,从南阳师范学院校园内、白河边、宝天曼、卧龙岗等地采集的土壤样品中筛选有抑菌活性的放线菌,采用形态学观察以及基于16S rRNA序列分析等方法对抑菌活性最高的菌株进行分类鉴定,将该菌株进行杀松材线虫活性测试,并分离纯化出杀线活性物质。结果筛选出4株有抑菌活性的放线菌菌株:C611、C612、C614、C619,其中C611菌株对藤黄八叠球菌、枯草杆菌和大肠杆菌均有较高抑制活性。结合该菌株形态学、生理学特征以及16S rRNA序列分析等结果,将其初步确定为链霉菌属。将C611发酵液处理松材线虫7 d后,线虫死亡率高达85%,空白对照组死亡率为0,对C611发酵液进行分离纯化后,初步确定活性成分为呋喃它酮。使用含量为0.1%呋喃它酮纯溶液测试杀线虫活性,作用于线虫5 d后其死亡率高达96%。结论本研究筛选到的生防放线菌C611,鉴定出其活性物质为呋喃它酮,丰富了松材线虫生防菌的种类,本研究首次发现呋喃它酮对线虫有较强毒杀作用,为松材线虫生物防治奠定了一定的理论基础。      

松材线虫拮抗细菌的筛选

[目的]筛选对松材线虫(Bursaphelenchuh xylophilus)具有杀线活性的细菌。[方法]对来自松、杨林分的12株细菌进行了杀松材线虫活性测定。[结果]在植物体上共分离获得12株细菌,其中JK-SD001发酵液稀释4倍对松材线虫处理24 h后杀线率仍为100%,且松材线虫虫体出现消解现象,消解率为80.4%。[结论]为开发生物源杀线剂奠定了基础。     

海南西海岸4种真红树植物根际土壤细菌多样性及其生物活性研究

[目的]研究海南西海岸真红树根际土壤细菌多样性及延缓衰老活性和杀线虫活性,挖掘更多潜在新物种和高效活性物质,为红树林微生物资源的开发应用提供参考依据.[方法]以海南西海岸4种真红树植物(红海榄、桐花树、白骨壤和红树)根际土壤为研究对象,采用9种分离培养基(AGG、M4、M5、M7、M9、M10、M11、P3和P7),以稀释涂布法和三线法从真红树根际土壤中分离细菌,通过菌株形态特征观察及16S rRNA序列分析,探讨真红树根际土壤细菌物种多样性;利用秀丽隐杆线虫活体模型对分离获得的细菌发酵产物粗提物进行延缓衰老活性筛选,并采用96孔板法测试细菌发酵产物粗提物的杀线虫活性.[结果]经排重合并及16S rRNA序列比对分析,从真红树根际土壤中分离得到23株根际细菌,隶属于10目11科12属,其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)11株,占分离细菌总数的47.83%,为优势菌属.有2株细菌(IMDGX 6099和IMDGX 6198)的16S rRNA序列与有效发表菌株的相似性低于98.65%,可能为潜在新种.秀丽隐杆线虫模型筛选发现3株细菌(IMDGX 6153、IMDGX 6098和IMDGX 6198)发酵液具有不同程度延缓线虫衰老的活性,有1株细菌(IMDGX 6094)的发酵液对秀丽隐杆线虫具有杀线虫活性,其半数致死浓度(LC50)为192.02μg/mL.[结论]海南西海岸真红树根际土壤细菌具有较高的物种多样性,蕴藏着丰富的细菌资源,且部分细菌菌株具有延缓衰老和杀线虫活性,在新菌种、生物活性物质的发现及研制新型抗衰老药物和高效生物杀虫剂方面均具有巨大潜力.     

蜡样芽胞杆菌NJSZ-13致死松材线虫的因子

蜡样芽胞杆菌NJSZ-13对松材线虫有较高的致死作用。为了明确蜡样芽孢杆菌NJSZ-13对松材线虫的致死因子，探讨了蜡样芽胞杆菌NJSZ-13对松材线虫的作用机制。首先将NJSZ-13菌悬液处理的松材线虫体表彻底消毒并研磨后涂含青霉素的抗性平板，并通过荧光显微镜观察线虫虫体上含gfp荧光质粒的NJSZ-13菌体以明确菌株在线虫虫体上的存在位置。然后测定菌株与松材线虫混合后上清液及其中胞外蛋白粗提物的杀线活性，并测定虫菌混合液的吸光度，观察菌体繁殖量的变化。结果表明：松材线虫体表彻底消毒研磨后涂布抗性平板未长出菌落，且在松材线虫体表观察到菌株NJSZ-13。菌株与松材线虫混合并静置48 h后，其上清液无显著杀线活性。菌株与松材线虫混合并摇培4 d后，上清液中胞外蛋白粗提物浓缩10倍后具有较高的杀线活性，处理松材线虫48 h后的松材线虫死亡率达到66.23%。粗提物经沸水浴30 min后处理松材线虫，线虫死亡率显著降低，处理48 h后松材线虫死亡率仅有23.88%。菌株与松材线虫混合并摇培1 d后，虫菌混合液的吸光度开始显著高于菌液的吸光度，此后两者吸光度下降明显，摇培2至10 d期间，虫...     

根结线虫生防细菌物种多样性及生防潜力研究

从库存的1471株细菌中筛选出对南方根结线虫二龄幼虫(J2)杀线率≥30%的生防菌99株,进一步从这99株生防菌中筛选出能吸引J2的菌株58株,其中11株的CI>0.2。这58株吸引J2的生防细菌分属于放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)4个大类;其中,厚壁菌门种类最多,共30株,芽孢杆菌属(Bacillus)为优势属,共6种16株菌。Pseudomonas corrugate YMF3.02205和P.rhodesiae YMF3.02254对J2的致死活性和吸引活性最高。这2株生防菌能趋化烟草根系分泌物尼古丁,对烟草根结线虫病的防效分别为65.5%和67.3%,当与40μmol·L^-1尼古丁配合使用时,防效显著提高到75%和76.9%。研究结果表明趋化性生防菌与趋化底物配合使用能显著提高生防菌防效。     

1株间座壳属真菌抗松材线虫的活性

筛选对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)有致死作用的内生真菌。从苦楝(Melia azedarach)健康组织(茎、叶、果实)中分离纯化内生真菌,菌株采用摇瓶培养,发酵液和菌丝体分别用乙酸乙酯萃取制备胞外和胞内代谢产物,采用浸渍法进行杀线虫活性筛选。共计分离纯化31株内生真菌,其中菌株J352-03的发酵液对松材线虫有显著的毒杀活性,在2 mg·mL^-1质量浓度下处理48 h,菌株J352-03胞内、胞外的次生代谢产物对松材线虫校正死亡率均达到100%,LC₅₀值分别为0.46 mg·mL^-1、0.42 mg·mL^-1;对松材线虫卵的孵化抑制率分别为66.54%、76.04%,松材线虫体内三磷酸腺苷酶(ATP酶)、过氧化氢酶(CAT)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著低于对照组。菌株J352-03经形态学与rDNA-ITS序列分析鉴定为间座壳属一未知种Diaporthe sp.。综上所述,菌株J352-03对松材线虫有良好的生防潜力,具有进一...     

具杀松材线虫活性的金线莲内生真菌的筛选和鉴定

采用浸渍法对金线莲内生真菌的培养滤液进行杀线活性及其稳定性测定,筛选高效杀线菌株,并 通过形态学和分子系统学对活性菌株进行鉴定。结果表明,从金线莲中分离获得内生真菌139 株,杀线活性大于 50% 的有21 株,其中菌株XX34、XX49 的培养滤液对松材线虫处理24 h 杀线虫率达100%,且这两株菌株的杀线 遗传稳定性较好。经鉴定,XX34、XX49 分别为阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）和竹生炭角菌（Xylaria bambusicola）。高效杀线活性的植物内生真菌筛选在松材线虫生物防治方面具有较大的开发和应用价值。     

3种拮抗烟草疫霉及产IAA内生细菌的分离鉴定

为挖掘河南省洛阳地区烟株体内的内生细菌功能菌株,以期开发优良生防菌剂。采用稀释涂布平板法分离纯化烟株各生育时期内生细菌菌株,采用平板对峙法、生长速率法测定内生菌株对烟草疫霉的抑制作用,紫外分光光度计法测定菌株产生IAA的水平。对筛选出的功能内生菌株进行形态学、生理生化鉴定及16S rDNA、gyrB序列分析鉴定,并测定对种子萌发的促生作用。结果表明,筛选出的12株内生菌株的鉴定结果为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)7株,沙福芽孢杆菌(B.safensis)4株,奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)1株。芽孢杆菌属占菌株总数的91.67%,其中菌株LYYY63-1、LYRY39-1、LYSX141具有较强的抑制活性,对烟草疫霉的抑菌率分别为88.10%、84.55%和73.33%;沙福芽孢杆菌菌株LYYY61-2、LYYY117对烟草疫霉的抑菌率达62.10%、64.72%;奇异变形杆菌菌株LYRY45产IAA水平达11.06 mg/L,具有较高的产IAA水平。12株细菌对烟草7种病原真菌具有不同程度的抑制作用,抑菌谱广,对烟草种子根长和总长均有显著的促生...     

松材线虫侵染对马尾松苗不同部位内生细菌菌群结构的影响

  目的  探究松材线虫Bursaphelenchus xylophilus侵染下松干、松针与根系部位内生细菌菌群的结构变化,可充分挖掘马尾松Pinus massoniana内生细菌资源。  方法  采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)及高通量测序技术,对松材线虫侵染下3年生马尾松不同部位内生细菌的结构多样性进行分析。  结果  ①马尾松不同部位内生细菌菌群结构存在较大差异,菌群多样性从大到小依次为松干、松针、根系。②松干部位部分细菌属在侵染15 d时丰度明显增加,但苗木表面并不表现任何症状。③马尾松体内共检测到内生细菌442属,分属35门49纲110目210科。其中松干与松针部位的甲基杆菌属Methylobacterium、假平胞菌属Sphingomonas、薄层菌属Hymenobacter、泛菌属Pantoea、假单胞菌属Sphingomonas与短小杆菌属Curtobacterium在侵染过程中相对丰度变化较大。  结论  松材线虫侵染下,马尾松根部基本不受影响,但松干部位内生细菌菌群结构变化极显著,其次是松针。部分内生细菌可能对松材线虫病具有潜在生防效果,有助于后期生防菌株的挖掘。在侵染高峰期实时监测干部内生细菌菌群结构变化,有助于松材线虫病的早期诊断。图5表1参25     

1株烟草青枯病拮抗内生细菌的分离及鉴定

为了筛选具有生防价值的拮抗烟草青枯雷尔氏菌的内生细菌,从湖南长沙、永州、郴州烟草青枯病发病区的健康烟株采集茎秆,采用稀释平板分离法获得150个内生菌株.抑菌结果表明,21个内生菌株对烟草青枯雷尔氏菌2316菌株有拮抗效果,占总菌株数的14.0％.拮抗菌株中,F1菌株24 h对烟草青枯雷尔氏菌株2316抑菌圈直径达6.5...     

荧光假单孢细菌培养的无细胞滤液导致松萎蔫的病状观察

将松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌混合物、致病细菌鞭毛蛋白无细胞滤液、无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌混合物接种黑松导致的松树萎蔫的病状与野生松材线虫导致松树萎蔫的病状进行观察和对比,结果为:(1)经培养的致病荧光假单孢菌GcM5-1A菌株的无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物接种导致的黑松的病状变化趋势与松材线虫致死的黑松病状是一致的;无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌AM2C混合物不能使黑松发病;(2)致病细菌GcM5-1A无细胞滤液和野生松材线虫导致的黑松病状和病程天数无显著差异;(3)接种无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物的黑松病程显著长于接种野生松材线虫的黑松.结果可以用松萎蔫病是松材线虫和其携带的细菌的复合侵染病害的假说和松材线虫与其携带的细菌之间的互惠共生关系的论点来解释,说明松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液是松萎蔫病致病的真正原因.     

丹参内生细菌抗氧化及抗菌活性

对8株分离自陕西杨凌的丹参根部内生细菌进行抗氧化和抗菌活性研究,抗氧化活性采用DPPH法,抗细菌活性采用二倍稀释法,抗植物病原真菌采用抑制菌丝生长速率法。结果表明：8株内生细菌均具有抗氧化活性,尤其是B1(Pseudomonas brassicacearum subsp. neoaurantiaca)和B5(Bacillus aryabhattai);8株丹参内生细菌对5种人体病原细菌抑制活性较弱,仅B1、B3(Pseudomonas thivervalensis)和B5具有较弱活性;丹参内生细菌对8种植物病原菌菌丝生长有较强的抑制活性,对番茄灰霉病菌尤其敏感,IC₅₀为1.48~12.06 g/L,其中B5的广谱性较强,对测试菌株都有活性,IC₅₀为1.48~32.28 g/L。     

银杏内生拮抗菌株的鉴定及脂肽类物质的活性

为筛选防治草莓灰霉病原菌(Botrytis cinerea)的内生细菌拮抗菌株,采用16SrRNA基因序列同源性分析与平板对峙法相结合研究分离自银杏(Ginkgo biloba)根茎叶的内生细菌拮抗菌株种类及其次级代谢产物的体外抑菌活性。结果表明:分离筛选出7株对草莓灰霉病原菌具有不同程度抑制作用的内生细菌,其中,菌株YJ5为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其对草莓灰霉病原菌的抑菌作用较为明显,其脂肽类物质能有效地抑制草莓灰霉病原菌的生长,抑菌带宽15mm。     

28种植物提取物对松材线虫的毒杀作用

测定了采自广东、湖南、云南和新疆的骆驼蓬等15科28种植物提取物对松材线虫的生物活性。骆驼蓬、黄文江鱼藤、紫花山毛豆、厚果鸡血藤、雷公藤、了哥王、博落回等7种植物甲醇索氏提取物杀线虫活性强烈,以1000μg／mL处理后72h,校正死亡率均在88％以上。乙醇是骆驼蓬杀线虫活性成分较合适的提取溶剂。浸渍法测定结果表明,骆驼蓬种子乙醇提取物的石油醚萃取物、氯仿萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物对松材线虫毒杀活性顺序强弱依次为：正丁醇〉氯仿〉水〉石油醚萃取物,其中正丁醇萃取物处理后24h和48h,LC50分别为33．98μg／mL和10．18μg／mL。松枝水培试验结果表明,骆驼蓬种子正丁醇萃取物能明显延缓松材线虫引致的松树萎蔫病的发展,以250μg／mL处理后12d病情指数仅0．17,显著低于“清水＋虫”处理的病情指数0．75。     

骆驼蓬提取物对松材线虫的生物活性及生理效应

 为寻找创制新型生物合理杀线虫剂提供活性模板化合物和理论基础，首次报道广泛分布于中国西北地区的荒漠抗逆植物骆驼蓬对松材线虫的生物活性及生理效应。松枝水培试验结果表明，骆驼蓬种子正丁醇萃取物250 ?g·ml-1处理后，松枝蒸腾强度、流脂量级别和病情指数均与清水对照差异不显著，对松材线虫病害的控制效果明显优于石油醚萃取物、氯仿萃取物和水萃取物。从正丁醇萃取物中分离获得骆驼蓬总碱、骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱和馏分A1～A8。毒力测定表明，骆驼蓬碱、馏分A1和A6是骆驼蓬杀线虫的主要活性成分，处理后48 h，对松材线虫(混合虫龄)LC50分别为135.74、160.40和86.02 ?g·ml-1。正丁醇萃取物、骆驼蓬总碱、骆驼蓬碱、去氢骆驼蓬碱、馏分A1和A6均能显著抑制乙酰胆碱酯酶和酸性磷酸酯酶活性，但对碱性磷酸酯酶活性无显著影响，对 -和 -乙酸萘酯羧酸酯酶活性有不同程度的抑制作用，以100 ?g·ml-1处理松材线虫后6 h，乙酰胆碱酯酶比活力抑制率为50.15%～73.14%，对酸性磷酸酯酶活性的抑制率为38.56%～48.37%。抑制乙酰胆碱酯酶活性可能是骆驼蓬提取物主要杀线虫机理之一。     

毛竹根部解磷细菌的筛选及多样性研究

本研究对毛竹(Phyllostachys pubescens)根部(包括根际、根面及内生细菌)解磷细菌进行了筛选,并通过16S rDNA序列分析对其多样性进行了初步研究。从179株毛竹根部细菌中筛选出26株解磷细菌,包括14株根际细菌、8株根面细菌、4株内生细菌。其中,芽孢杆菌BK24的解磷活性最高,其解磷活性达到369.06 mg/L。16S rDNA序列分析表明:26株解磷细菌中,13株属于厚壁菌门(Firmicutes,50.00%),5株属于变形菌门β亚群(Betaproteobacteria,19.23%),4株属于变形菌门γ亚群(Gammaproteobacteria,15.38%),4株属于放线菌门(Actinobacteria,15.38%)。芽孢杆菌属(Bacillus,38.46%)和伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia,19.23%)为优势菌属。     

松材线虫伴生细菌与松材线虫的关系及致病性机理研究

松材线虫病又称松树萎蔫病,近年来成为了国内严重毁坏型病害。如何治理该病害成为了当今植物保护界研究热点,降低该病害对生产造成的损失尤为迫切,现通过对松材线虫病的危害进行分析,总结前人对松材线虫病的研究成果:分析松材线虫伴生细菌的多样性,发掘松材线虫伴生细菌与松材线虫的关系,结合国内外研究松材线虫伴生细菌的致病性机理研究,总结得出松材线虫伴生菌种较多,没有明显的专一性,结合微生物细菌研究的发展,分离和鉴定出越来越多的细菌种类;指出了松材线虫与携带细菌之间存在密切相关,毒素在松材线虫伴生细菌的致病机制中起着重要作用。