1株间座壳属真菌抗松材线虫的活性

筛选对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)有致死作用的内生真菌。从苦楝(Melia azedarach)健康组织(茎、叶、果实)中分离纯化内生真菌,菌株采用摇瓶培养,发酵液和菌丝体分别用乙酸乙酯萃取制备胞外和胞内代谢产物,采用浸渍法进行杀线虫活性筛选。共计分离纯化31株内生真菌,其中菌株J352-03的发酵液对松材线虫有显著的毒杀活性,在2 mg·mL^-1质量浓度下处理48 h,菌株J352-03胞内、胞外的次生代谢产物对松材线虫校正死亡率均达到100%,LC₅₀值分别为0.46 mg·mL^-1、0.42 mg·mL^-1;对松材线虫卵的孵化抑制率分别为66.54%、76.04%,松材线虫体内三磷酸腺苷酶(ATP酶)、过氧化氢酶(CAT)、乙酰胆碱酯酶(AChE)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著低于对照组。菌株J352-03经形态学与rDNA-ITS序列分析鉴定为间座壳属一未知种Diaporthe sp.。综上所述,菌株J352-03对松材线虫有良好的生防潜力,具有进一...     

杀松材线虫海洋细菌HT-11的鉴定及培养条件研究

[目的]从海洋中分离并筛选具有杀松材线虫活性的细菌。[方法]采用稀释涂布平板法对采自青岛近海海域的样品进行细菌分离,采用浸渍法测定菌株的杀线虫活性,并对筛选菌株的形态学、生理生化特性和16S r DNA序列进行测定,通过单因素试验筛选产生杀线虫活性物质的最适培养条件。[结果]共分离到36株海洋细菌,根据杀线虫活性筛选出1株具有高杀线虫活性的细菌HT-11。该菌株分离自牡蛎,其培养滤液处理松材线虫24 h的校正死亡率高达92.41%。根据形态学、生理生化特性和16S r DNA序列测定及其系统发育分析结果,将菌株HT-11鉴定为考克氏菌属(Kocuria)。单因素试验结果表明,该菌株在营养肉汤(NB)培养基中产生杀线虫活性物质的最适培养条件为:海水浓度100%,初始p H 7.0,培养温度25℃,培养时间3 d。[结论]该研究可为海洋微生物资源的开发及其杀松材线虫天然活性物质的利用提供理论依据。     

不同氮源对海洋真菌BH0531发酵液杀线虫活性的影响

海洋来源的枝顶孢霉(Acremnium,BH0531)是一株以松材线虫为靶标筛选出的杀线虫真菌。氮源的化合态和种类对该菌株的生长以及代谢产物的活性有显著影响。研究结果显示,不同氮源对菌体生长量的影响差异显著,有机氮优于无机氮;代谢物的杀线虫活性则表现为无机氮优于有机氮,其中以Na NO3为氮源的发酵液对松材线虫的杀线率以及NH4Cl为氮源的发酵液对根结线虫的杀线率分别高达95.67%和96.60%,均高于有机氮源中最高的蛋白胨。根结线虫对各种无机氮源发酵液的敏感性普遍高于松材线虫。此外,经高温处理的代谢物仍观察到较强的杀线虫活性,显示出良好的热稳定性。     

一株抗南方根结线虫长形赖氨酸芽孢杆菌的分离鉴定及应用

【目的】筛选对南方根结线虫具有良好活性的生防菌株,为杀线虫制剂的研制与应用提供理论依据。【方法】采用平板稀释法对从抗线虫黄瓜根系附近采集的土壤样品进行芽孢杆菌分离,通过浸渍法筛选出杀线活性高且稳定的菌株,结合形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析对活性菌株进行分类鉴定,并通过离体、盆栽及田间试验对分离菌株防治南方根结线虫的效果进行验证。【结果】筛选出1株具有较高杀线虫活性的芽孢杆菌C1,经鉴定菌株C1为长形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus macroides）。杀线活性测定结果表明,菌株C1发酵上清液对南方根结线虫卵孵化的相对抑制率为74.50%、对雌虫孵化的相对抑制率为95.17%、对2龄幼虫的24和48 h校正死亡率分别为98.83%和100.00%,且杀虫活性稳定;盆栽试验发现,菌株C1发酵液50倍稀释液对番茄南方根结线虫的防效为73.24%;田间防病试验结果显示,菌株C1发酵液50倍稀释液对黄瓜南方根结线虫病的防效达82.67%,且产量较清水对照增产20.0%。【结论】菌株C1不仅对南方根结线虫病具有良好的防治效果,且能促进作物生长,可作为生物农药和肥料在农业生产中开发利用。     

具杀松材线虫活性的金线莲内生真菌的筛选和鉴定

采用浸渍法对金线莲内生真菌的培养滤液进行杀线活性及其稳定性测定,筛选高效杀线菌株,并 通过形态学和分子系统学对活性菌株进行鉴定。结果表明,从金线莲中分离获得内生真菌139 株,杀线活性大于 50% 的有21 株,其中菌株XX34、XX49 的培养滤液对松材线虫处理24 h 杀线虫率达100%,且这两株菌株的杀线 遗传稳定性较好。经鉴定,XX34、XX49 分别为阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）和竹生炭角菌（Xylaria bambusicola）。高效杀线活性的植物内生真菌筛选在松材线虫生物防治方面具有较大的开发和应用价值。     

海洋放线菌BH3A8代谢产物杀线虫活性研究

植物寄生线虫的危害日趋严重,利用生物防治技术是控制线虫危害的研究重点。对从渤海海域不同深度水样中筛选出的具有杀线活性的菌株BH3A8代谢产物进行研究,测定了BH3A8代谢产物杀线虫谱和对南方根结线虫的温室防效以及对松材线虫形态与运动频率的影响。结果表明,BH3A8代谢产物对南方根结线虫幼虫毒力最强,对松材线虫幼虫毒力次之,对大豆孢囊线虫幼虫毒力最弱。在温室测定中活性菌株发酵液对南方根结线虫防治效果为73.75%。活性菌株代谢产物明显抑制松材线虫运动频率。中毒线虫起初表现为虫体扭曲、颤抖、痉挛,接着线虫游动缓慢、扭动身躯,最后线虫反应迟钝,摆动减慢,首尾同侧展开,标志着线虫死亡。虫体死亡多为僵直状态。BH3A8杀线虫谱广、效果好、使用成本低,在生产上具有很好的应用前景。     

具抑菌活性乳酸菌筛选及抑菌活性物质分析

以大肠杆菌O157∶H7为指示菌,采用spot-on-lawn法从食源性乳酸菌菌种库中筛选获得2株高抑菌活性乳酸菌,基于16S rRNA基因序列分析,分别鉴定为戊糖片球菌和发酵乳杆菌。利用改良牛津杯法测定2株乳酸菌发酵浓缩液对常见食源性病原菌的抑菌谱,并分析蛋白酶K、pH值、温度对抑菌物质活性的影响,结果发现2菌株均能显著抑制大肠杆菌和李斯特菌,其中戊糖片球菌发酵液具有更明显广谱抑菌效果;发酵液抑菌活性均受pH值影响,戊糖片球菌发酵液对蛋白酶、热敏感,发酵乳杆菌发酵液对蛋白酶、热不敏感。研究结果表明,戊糖片球菌发酵液抑菌活性物质有多肽(蛋白)和有机酸,发酵乳杆菌来源的抑菌物质化学成分是一些具有热稳定性的有机酸。该研究获得乳酸菌可以用于食品发酵和防腐领域,且为抑菌物质分离、鉴定和抑菌机制研究奠定基础。     

胡萝卜黑腐病生防放线菌G-1抑菌活性研究

为筛选出对胡萝卜黑腐病防治具有良好效果的放线菌,采用平板稀释涂布法、对峙培养法、生长速率法、盆栽试验和16S rRNA序列分析,对胡萝卜表层土中的放线菌分离、抑菌活性、盆栽防效和分类地位进行研究。结果表明,15株放线菌中仅菌株G-1对胡萝卜黑腐交链孢(Alternaria radicina)具有较好抑菌活性,其平板和发酵液抑菌率分别为77.2%、78.5%,显著高于其他菌株;经16S rRNA序列分析,将该菌株鉴定为微白黄链霉菌(Streptomyces albidoflavus);盆栽防效以稀释50～100倍效果较好,可保持70%以上防效。综上所述,菌株G-1在胡萝卜黑腐病生物防治中具有良好应用价值。     

蜡样芽胞杆菌NJSZ-13致死松材线虫的因子

蜡样芽胞杆菌NJSZ-13对松材线虫有较高的致死作用。为了明确蜡样芽孢杆菌NJSZ-13对松材线虫的致死因子，探讨了蜡样芽胞杆菌NJSZ-13对松材线虫的作用机制。首先将NJSZ-13菌悬液处理的松材线虫体表彻底消毒并研磨后涂含青霉素的抗性平板，并通过荧光显微镜观察线虫虫体上含gfp荧光质粒的NJSZ-13菌体以明确菌株在线虫虫体上的存在位置。然后测定菌株与松材线虫混合后上清液及其中胞外蛋白粗提物的杀线活性，并测定虫菌混合液的吸光度，观察菌体繁殖量的变化。结果表明：松材线虫体表彻底消毒研磨后涂布抗性平板未长出菌落，且在松材线虫体表观察到菌株NJSZ-13。菌株与松材线虫混合并静置48 h后，其上清液无显著杀线活性。菌株与松材线虫混合并摇培4 d后，上清液中胞外蛋白粗提物浓缩10倍后具有较高的杀线活性，处理松材线虫48 h后的松材线虫死亡率达到66.23%。粗提物经沸水浴30 min后处理松材线虫，线虫死亡率显著降低，处理48 h后松材线虫死亡率仅有23.88%。菌株与松材线虫混合并摇培1 d后，虫菌混合液的吸光度开始显著高于菌液的吸光度，此后两者吸光度下降明显，摇培2至10 d期间，虫...     

杀松材线虫活性菌株筛选及活性成分分析

在室内条件下,测定了3株淡紫拟青霉菌(Paecilomyces lilacinus)和4株厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)发酵液及7种不同溶剂萃取物对松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)的毒杀活性,并通过柱层析和气质联用对活性菌株的高效萃取物进行了分离和分析。结果表明:淡紫拟青霉PT1菌株的发酵液对松材线虫的毒杀作用最强,处理72 h后松材线虫的校正死亡率高达88.37%。从7种有机溶剂萃取物中筛选出乙酸乙酯是PT1菌株活性成分较合适的萃取溶剂,浸渍法测定结果表明PT1菌株乙酸乙酯萃取物处理松材线虫24 h和48 h的LC_(50)分别为36.001μg/mL和25.317μg/mL。乙酸乙酯萃取物经柱层析后,得到活性组分YZ-4。用GC-MS分析YZ-4组分,共鉴定出4种化合物,分别为假石榴皮碱、棕榈酸、邻苯二甲酸苯基丁基酯和油酸。推测活性菌株PT1发酵产物有望研发出新型微生物源杀虫剂。     

松材线虫效应因子基因筛选及Bx-Hh-grl功能研究

  目的  通过对松材线虫效应因子基因的克隆和功能研究,揭示Bx-Hh-grl对松材线虫致病性的作用,为防治松材线虫提供理论依据。  方法  用松材线虫Bx1022株系接种黑松,20 d后提取线虫总RNA进行转录组测序,将该转录组设为松材线虫植食阶段转录组。提取由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）培养的Bx1022的总RNA进行转录组测序,将该转录组设为菌食阶段转录组。比较分析两个转录组,筛选到差异表达基因Bx-Hh-grl。对Bx-Hh-grl编码蛋白质的跨膜结构域和信号肽进行预测。利用原位杂交检测Bx-Hh-grl表达部位。应用RNAi技术干扰Bx-Hh-grl表达以探究Bx-Hh-grl对松材线虫致病性的作用。通过Q-PCR验证,确定RNAi效果显著。将经RNAi处理的松材线虫接种3年生黑松枝条,以未经处理的松材线虫（CK组）和ddH₂O（Mock组）处理的黑松作为对照,比较黑松发病情况进而比较不同处理后松材线虫的致病性差异。  结果  筛选出植食阶段与菌食阶段转录组差异表达基因Bx-Hh-grl,其编码蛋白质具有跨膜结构域和信号肽。原位杂交试验结果显示Bx-Hh-grl在松材线虫食道腺表达,符合效应因子基因特征。Q-PCR结果显示经RNAi处理后的松材线虫Bx-Hh-grl表达量下调,RNAi处理效果显著。接种实验表明,Bx-Hh-grl-RNAi组显症的时间明显晚于CK组,Mock组黑松一直保持健康状态。  结论  Bx-Hh-grl是与松材线虫致病相关的效应因子基因。明确Bx-Hh-grl功能有利于进一步了解松材线虫致病机理,为降低松材线虫危害,防治松材线虫奠定理论基础。      

松材线虫及携带细菌对黑松复合的侵染

从不同松树上分离松材线虫、拟松材线虫、滑刃线虫和小杆线虫,并从松材线虫和小杆线虫体上分离细菌,将线虫无菌化处理后与从线虫体上分离到的荧光假单胞杆菌、产气肠杆菌混合接种无菌黑松苗和愈伤组织。结果表明,单独接种无菌线虫或细菌不能使黑松致病,无菌松材线虫、无菌拟松材线虫只有与有毒性的荧光假单胞杆菌混合接种时才能使黑松无菌苗和愈伤组织发病,细菌通过线虫携带在树体内传播扩散,使松树致病。研究进一步证明了线虫和细菌在松材线虫病致病过程中起协同作用。     

松材线虫两种实用分子检测技术

为检验已开发的SCAR标记与实时PCR两种分子检测方法鉴定松材线虫的可靠性,本文选用线虫未知种样品7个以及已知种样品3个为实验材料,采用上述两种分子检测方法进行检测,并且对7个线虫未知种样品进行形态鉴定。结果表明：1）运用SCAR标记检测,第2、3、4、7号4个未知种样品与8号松材线虫样品出现了一条清晰、明亮的860b...     

松材线虫对其携带的一株致病细菌产毒的影响

该文报道了以黑松细胞为材料的一种改进的细胞荧光染色显微生测法.用该方法测定了接种松材线虫虫体上分离到的荧光假单胞GcM5-1A菌株或该菌株和无菌松材线虫混合物接种后的愈伤组织水提物的毒性.结果表明,单独接种无菌松材线虫或单独接种该菌株后的愈伤组织水提液未表现出毒性;而接种无菌松材线虫与该菌株的混合物后的愈伤组织水提液与接种野生松材线虫后的愈伤组织水提液的毒性以及该菌株的NB培养液的无细胞滤液的毒性均很强,并且它们三者之间没有显著差异.该结果说明松材线虫在寄主组织中能促进细菌的产毒.向该菌株的NB培养液的无细胞滤液中添加松材线虫后测定其毒性,结果表明无菌松材线虫对其毒性并无显著影响.实验结果表明松材线虫本身不产生毒素,在荧光假单胞菌培养液的无细胞滤液中加入无菌松材线虫未能显著改变其毒性.      

松材线虫拮抗细菌的筛选

[目的]筛选对松材线虫(Bursaphelenchuh xylophilus)具有杀线活性的细菌。[方法]对来自松、杨林分的12株细菌进行了杀松材线虫活性测定。[结果]在植物体上共分离获得12株细菌,其中JK-SD001发酵液稀释4倍对松材线虫处理24 h后杀线率仍为100%,且松材线虫虫体出现消解现象,消解率为80.4%。[结论]为开发生物源杀线剂奠定了基础。     

松树上几种线虫携带细菌的种类与毒性

从不同地区不同松树上采集分离不同种类的线虫,对线虫携带的细菌进行分离鉴定,并用黑松无菌苗及愈伤组织测定细菌的毒性.细菌分离结果表明:松材线虫携带的优势菌为荧光假单胞菌,与其他线虫携带的细菌种类不同.毒性测定结果显示:松材线虫携带的优势菌株毒性最强,拟松材线虫及滑刃属线虫携带的细菌具有一定程度的毒性,小杆线虫携带的细菌没有任何毒性.结果进一步证明了松材线虫携带的细菌在其致病过程中发挥着重要作用.     

松材线虫携带细菌在疫区和寄主中的分布及致病性研究

作者在江苏、上海、广东、安徽、湖北、浙江等疫区 ,采集了呈现松材线虫病典型症状的黑松、马尾松的病样 ,采用病木组织分离法 ,分离获得松材线虫所携带的细菌菌株 2 4株 ,经鉴定 ,2 4株细菌中 ,假单胞菌属有 11株 ,泛菌属有 6株 ,其余有不解糖消化链球菌、河生肠杆菌、乡间步丘菌和粘质沙雷菌 .由此可知 ,假单胞菌和泛菌分布较广 ,在所有采样疫区感染松材线虫病的马尾松和黑松病死木中都能分离到 ,是普遍存在病木组织中松材线虫携带的主要细菌 .致萎活性测定结果表明 :所有假单胞菌属和泛菌属的菌株对无菌黑松切根苗均有致萎活性 .用假单胞菌和泛菌分别与无菌松材线虫混合接种室内无菌黑松苗和野外多年生黑松 ,结果表明 :用细菌单独接种 ,无菌黑松苗和野外黑松均不发病 ,无菌松材线虫单独接种的无菌黑松苗和野外黑松也不发病或发病轻、慢 ,无菌线虫和致萎细菌二者混合接种能使无菌黑松苗和野外黑松发病快且严重 .由此认为松材线虫携带到寄主组织中的假单胞菌和泛菌属的一些种对松材线虫病有明显的协同作用     

松材线虫内生细菌与病原细菌的互作关系分析

采用16S rRNA基因文库和 illumina Miseq技术测序对松材线虫内生细菌群落的宏基因组进行初步分析,文库显示优势菌群为黄单胞菌科(22.41%)、鞘脂杆菌科(17.66%)、丛毛单胞菌科(14.71%)、根瘤菌科(10.17%)。采用稀释平板法,从松材线虫体内分离出5株内生细菌。利用形态学、生理学及16S rRNA 序列特征等对这些内生细菌进行了分类鉴定。研究发现这些内生细菌在体外均显示较强的杀线虫活性,其中克雷伯氏菌属sct5的杀虫活性最大,作用4 d松材线虫的死亡率即可达到100％。该细菌产生毒性蛋白酶并在体外快速形成生物膜。进一步研究发现,该内生细菌与杀线虫芽孢杆菌B16之间具有强亲和性,混合2个菌株sct5+B16作用1 d对松材线虫的防效为75％,明显好于单菌株sct5 (60％)和B16(40％)。而另一内生细菌肠杆菌属sct29与B16存在拮抗关系,两者不亲和,混合菌株sct29+B16作用1 d对松材线虫的防效仅为13％。本研究首次系统地报道了松材线虫可培养内生细菌的杀虫活性及其与杀线虫芽孢杆菌B16的亲和关系,对研制开发组合生防菌剂、提高生防菌株的稳定性等奠定理论基础,本研究从新的视角阐释了松材线虫内生细菌与病原细菌之间的互作关系。      

松材线虫细胞色素cyp-13A11基因RNA干扰载体的构建及其功能分析

  目的  构建松材线虫cyp-13A11基因RNA干扰载体,研究cyp-13A11基因的功能,为松材线虫病的生物防治提供理论依据。  方法  本文通过设计特异性引物,扩增松材线虫cyp-13A11基因片段,构建至pEASY-T1干扰载体上并转入Trans1-T1大肠杆菌菌株。采用浸泡法对松材线虫进行RNA干扰,通过qRT-PCR检测cyp-13A11基因的表达,将干扰后的线虫分别接种至长满灰葡萄孢菌丝的培养皿中和黑松苗上,测定RNA干扰后线虫的取食、繁殖、致病力和干扰效率等指标。  结果  成功构建了带有pEASY-T1干扰载体的Trans1-T1菌株并且能够合成cyp-13A11 dsRNA,通过RNA干扰抑制了松材线虫cyp-13A11基因的表达。松材线虫RNA干扰后接种至灰葡萄孢第3天,cyp-13A11 dsRNA处理松材线虫的取食面积较小,ddH₂O处理松材线虫取食面积达到了整体的2/3;接种第6天,cyp-13A11 dsRNA处理松材线虫的取食面积为整体的1/3,而ddH₂O处理松材线虫已将灰葡萄孢菌丝取食殆尽。ddH₂O处理松材线虫的繁殖数量比cyp-13A11 dsRNA处理高4.28倍。松材线虫接种至黑松苗第10天,ddH₂O处理黑松发病率为22.2%,而cyp-13A11 dsRNA处理黑松发病率为5.6%;接种至20天,ddH₂O处理的黑松发病率为44.4%,cyp-13A11 dsRNA处理的黑松发病率为33.3%;直至接种30天,ddH₂O和cyp-13A11 dsRNA处理的黑松全部枯萎,发病率达到100%。  结论  成功构建了松材线虫cyp-13A11基因RNA干扰载体,cyp-13A11基因表达沉默后影响了松材线虫的取食,降低了松材线虫的繁殖能力和致病力。      

进境木片松材线虫PCR检测方法研究

利用松材线虫rDNA内转录区（ITS）特异性引物,对泉州口岸入境木片携带的线虫基因组DNA进行特异性PCR扩增,建立一套快速准确的线虫检测鉴定方法。将该检测方法应用于泉州口岸现场检疫鉴定,结果未检测到松材线虫,与传统形态学鉴定方法结果一致。