松材线虫效应因子基因筛选及Bx-Hh-grl功能研究

  目的  通过对松材线虫效应因子基因的克隆和功能研究,揭示Bx-Hh-grl对松材线虫致病性的作用,为防治松材线虫提供理论依据。  方法  用松材线虫Bx1022株系接种黑松,20 d后提取线虫总RNA进行转录组测序,将该转录组设为松材线虫植食阶段转录组。提取由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）培养的Bx1022的总RNA进行转录组测序,将该转录组设为菌食阶段转录组。比较分析两个转录组,筛选到差异表达基因Bx-Hh-grl。对Bx-Hh-grl编码蛋白质的跨膜结构域和信号肽进行预测。利用原位杂交检测Bx-Hh-grl表达部位。应用RNAi技术干扰Bx-Hh-grl表达以探究Bx-Hh-grl对松材线虫致病性的作用。通过Q-PCR验证,确定RNAi效果显著。将经RNAi处理的松材线虫接种3年生黑松枝条,以未经处理的松材线虫（CK组）和ddH₂O（Mock组）处理的黑松作为对照,比较黑松发病情况进而比较不同处理后松材线虫的致病性差异。  结果  筛选出植食阶段与菌食阶段转录组差异表达基因Bx-Hh-grl,其编码蛋白质具有跨膜结构域和信号肽。原位杂交试验结果显示Bx-Hh-grl在松材线虫食道腺表达,符合效应因子基因特征。Q-PCR结果显示经RNAi处理后的松材线虫Bx-Hh-grl表达量下调,RNAi处理效果显著。接种实验表明,Bx-Hh-grl-RNAi组显症的时间明显晚于CK组,Mock组黑松一直保持健康状态。  结论  Bx-Hh-grl是与松材线虫致病相关的效应因子基因。明确Bx-Hh-grl功能有利于进一步了解松材线虫致病机理,为降低松材线虫危害,防治松材线虫奠定理论基础。      

松材线虫RNA聚合酶基因的RNA干扰研究

克隆了松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)RNA聚合酶基因片段,构建大量表达松材线虫RNA聚合酶基因片段的特异双链RNA(dsRNA)表达载体,并用表达的双链RNA(dsRNA)对松材线虫进行了RNA干扰实验。结果表明,松材线虫浸泡在20℃的RNA聚合酶基因双链RNA(dsRNA)溶液中干扰24 h后再培养12 d,其繁殖倍数为73.2;对照处理的繁殖倍数为322.8,两者的繁殖倍数相差4.4倍;松材线虫浸泡在4℃的RNA聚合酶基因双链RNA(dsRNA)溶液中干扰24 h后再培养12 d,其繁殖倍数为120.8。RNA聚合酶基因的双链RNA(dsRNA)浸泡明显的抑制了松材线虫的繁殖;并且发现利用浸泡法对线虫进行干扰试验,双链RNA(dsRNA)20℃浸泡的干扰效果要好于前人报道4℃浸泡的干扰效果。     

松材线虫P糖蛋白在药物代谢过程中的功能研究

  目的  探究松材线虫对药物敏感能力产生的分子机制，为防治松材线虫提供理论基础。  方法  本研究从松材线虫基因组中获得秀丽线虫同源解毒基因Bx-pgp23，并对该基因蛋白编码区进行PCR扩增，随后通过生物信息学对蛋白质Bx-PGP23理化性质、亲疏水性、跨膜区分布、磷酸化位点、二级结构和三级结构进行了分析和预测。并通过RNAi技术对Bx-pgp23进行沉默处理，分析Bx-pgp23沉默与否对松材线虫药物敏感程度的影响。  结果  生物信息预测结果显示PGP蛋白稳定系数为38.31，亲水系数为?0.018，三级结构预测PGP蛋白具有多个氨基酸参与构成α螺旋和β折叠并且具有多个核苷酸结合域和跨膜结构域。应用RNAi技术对Bx-pgp23基因进行基因沉默，沉默后的Bx-pgp23基因表达量变为原来的42.65%。药剂敏感性检测实验结果显示，在1.5和2.5 g/L苦参碱溶液处理24 h后，RNAi组松材线虫死亡率与对照组相比升高了7.2%和6.4%，在1.5和2.5 g/L的苦参碱溶液处理48 h后，RNAi组松材线虫死亡率与对照组相比升高9.0%和7.2%。  结论  蛋白质Bx-PGP23是一种稳定的亲水蛋白，具有跨膜外排功能。成功克隆Bx-pgp23基因并合成了该基因dsRNA。Bx-pgp23基因沉默影响了松材线虫对苦参碱的敏感性，在相同质量浓度的苦参碱胁迫下，RNAi组线虫死亡率明显高于对照组，说明Bx-pgp23基因在松材线虫药物代谢调控中发挥着正向调控作用。      

荧光假单孢细菌培养的无细胞滤液导致松萎蔫的病状观察

将松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌混合物、致病细菌鞭毛蛋白无细胞滤液、无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌混合物接种黑松导致的松树萎蔫的病状与野生松材线虫导致松树萎蔫的病状进行观察和对比,结果为:(1)经培养的致病荧光假单孢菌GcM5-1A菌株的无细胞滤液、无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物接种导致的黑松的病状变化趋势与松材线虫致死的黑松病状是一致的;无菌松材线虫、无菌松材线虫和非致病细菌AM2C混合物不能使黑松发病;(2)致病细菌GcM5-1A无细胞滤液和野生松材线虫导致的黑松病状和病程天数无显著差异;(3)接种无菌松材线虫和致病细菌GcM5-1A混合物的黑松病程显著长于接种野生松材线虫的黑松.结果可以用松萎蔫病是松材线虫和其携带的细菌的复合侵染病害的假说和松材线虫与其携带的细菌之间的互惠共生关系的论点来解释,说明松材线虫携带的致病细菌无细胞滤液是松萎蔫病致病的真正原因.     

松材线虫及携带细菌对黑松复合的侵染

从不同松树上分离松材线虫、拟松材线虫、滑刃线虫和小杆线虫,并从松材线虫和小杆线虫体上分离细菌,将线虫无菌化处理后与从线虫体上分离到的荧光假单胞杆菌、产气肠杆菌混合接种无菌黑松苗和愈伤组织。结果表明,单独接种无菌线虫或细菌不能使黑松致病,无菌松材线虫、无菌拟松材线虫只有与有毒性的荧光假单胞杆菌混合接种时才能使黑松无菌苗和愈伤组织发病,细菌通过线虫携带在树体内传播扩散,使松树致病。研究进一步证明了线虫和细菌在松材线虫病致病过程中起协同作用。     

松材线虫BxPrx基因抗H2O2胁迫的转录模式及功能

为探究松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)响应H_2O_2胁迫的分子机制,利用荧光定量PCR测定松材线虫过氧化物还原酶基因BxPrx在不同浓度(2.5、5.0、7.5、10.0mmol/L)H_2O_2胁迫下的转录水平;利用RNA干扰技术,沉默松材线虫BxPrx基因,比较H_2O_2胁迫下BxPrx基因沉默组与非基因沉默组松材线虫存活率的差异。结果显示:松材线虫的存活率与H_2O_2胁迫浓度呈负相关;松材线虫BxPrx在H_2O_2胁迫下的转录水平均提高;在5.0、7.5、10.0 mmol/L H_2O_2胁迫下,经过BxPrx基因沉默处理的松材线虫存活率显著低于对照组。     

松材线虫携带细菌在疫区和寄主中的分布及致病性研究

作者在江苏、上海、广东、安徽、湖北、浙江等疫区 ,采集了呈现松材线虫病典型症状的黑松、马尾松的病样 ,采用病木组织分离法 ,分离获得松材线虫所携带的细菌菌株 2 4株 ,经鉴定 ,2 4株细菌中 ,假单胞菌属有 11株 ,泛菌属有 6株 ,其余有不解糖消化链球菌、河生肠杆菌、乡间步丘菌和粘质沙雷菌 .由此可知 ,假单胞菌和泛菌分布较广 ,在所有采样疫区感染松材线虫病的马尾松和黑松病死木中都能分离到 ,是普遍存在病木组织中松材线虫携带的主要细菌 .致萎活性测定结果表明 :所有假单胞菌属和泛菌属的菌株对无菌黑松切根苗均有致萎活性 .用假单胞菌和泛菌分别与无菌松材线虫混合接种室内无菌黑松苗和野外多年生黑松 ,结果表明 :用细菌单独接种 ,无菌黑松苗和野外黑松均不发病 ,无菌松材线虫单独接种的无菌黑松苗和野外黑松也不发病或发病轻、慢 ,无菌线虫和致萎细菌二者混合接种能使无菌黑松苗和野外黑松发病快且严重 .由此认为松材线虫携带到寄主组织中的假单胞菌和泛菌属的一些种对松材线虫病有明显的协同作用     

松材线虫对其携带的一株致病细菌产毒的影响

该文报道了以黑松细胞为材料的一种改进的细胞荧光染色显微生测法.用该方法测定了接种松材线虫虫体上分离到的荧光假单胞GcM5-1A菌株或该菌株和无菌松材线虫混合物接种后的愈伤组织水提物的毒性.结果表明,单独接种无菌松材线虫或单独接种该菌株后的愈伤组织水提液未表现出毒性;而接种无菌松材线虫与该菌株的混合物后的愈伤组织水提液与接种野生松材线虫后的愈伤组织水提液的毒性以及该菌株的NB培养液的无细胞滤液的毒性均很强,并且它们三者之间没有显著差异.该结果说明松材线虫在寄主组织中能促进细菌的产毒.向该菌株的NB培养液的无细胞滤液中添加松材线虫后测定其毒性,结果表明无菌松材线虫对其毒性并无显著影响.实验结果表明松材线虫本身不产生毒素,在荧光假单胞菌培养液的无细胞滤液中加入无菌松材线虫未能显著改变其毒性.      

Cathepsin B基因的沉默对香蕉穿孔线虫繁殖力的影响

【目的】通过研究cathepsin B基因对香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)繁殖力的影响,探索cathepsin B基因的功能,为利用该基因防治香蕉穿孔线虫和植物寄生线虫组织蛋白酶的进一步研究提供科学依据。【方法】根据已知香蕉穿孔线虫cathepsin B基因(Rs-cb-1)的序列,从香蕉穿孔线虫克隆cathepsin B基因,以含有目的基因的质粒DNA为模板合成特异的双链RNA(dsRNA),采用dsRNA浸泡的方法对香蕉穿孔线虫进行RNA干扰(RNAi)试验,通过室内接种胡萝卜愈伤组织繁殖线虫的方法,研究cathepsin B基因的沉默效应对香蕉穿孔线虫繁殖力的影响。【结果】用Rs-cb-1dsRNA浸泡12、24、48、72h后香蕉穿孔线虫的平均繁殖倍数分别为165、93、54、53,而未经dsRNA处理的该线虫繁殖倍数均大于420;并且Rs-cb-1dsRNA浸泡的时间不同,对应各处理之间的繁殖倍数差异显著。RT-PCR检测,经Rs-cb-1dsRNA浸泡12h后,目的基因在香蕉穿孔线虫的表达量明显减弱,浸泡24h后其表达量进一步减弱,但还有微量表达,经dsRNA浸泡48、72h后目的基因基本不表达。【结论】Rs-cb-1与香蕉穿孔线虫的繁殖力相关;Rs-cb-1dsRNA的浸泡可以明显抑制cathepsin B基因的表达量,从而影响香蕉穿孔线虫的繁殖力,但浸泡时间不同Rs-cb-1的沉默效率也不同,沉默效率最好的干涉时间是48h。     

Bx–daf–2与Bx–tre–1协同调控海藻糖促进松材线虫低温抗逆

分析–5℃处理松材线虫转录组数据,筛选出低温胁迫诱导差异表达基因胰岛素样生长因子受体基因Bx–daf–2。筛选低温胁迫和Bx–daf–2 RNA干扰松材线虫共表达基因,发现海藻糖酶基因Bx–tre–1受Bx–daf–2调控。进一步研究低温胁迫下松材线虫Bx–tre–1功能,结果表明,松材线虫Bx–tre–1表达量下调,参与低温胁迫响应,从而导致海藻糖酶活性降低,海藻糖含量升高。Bx–tre–1 RNA干扰处理组松材线虫低温胁迫下海藻糖酶活性下降,海藻糖含量升高,存活率升高,说明低温胁迫条件下,海藻糖含量升高有助于提高松材线虫存活率,Bx–daf–2与Bx–tre–1协同调控海藻糖含量升高,促进松材线虫低温抗逆。     

伐根在松材线虫病流行中的作用

通过对病根中媒介昆虫松褐天牛种群数量、松材线虫密度以及线虫演替规律的调查研究,对伐根在松材线虫病流行中的作用进行初步评价。认为伐根在病害流行中的作用很小,考虑到挖除病根增加的劳动强度和经费支出,今后在疫区内部可以不强调挖根,而在疫区的边缘应挖除病根以防止这种国内森林植物检疫对象的自然蔓延。     

松材线虫病疫木除害的微波设备与技术参数

为了快速高效杀灭松材线虫病疫木(简称松疫木)内的松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)和松墨天牛(Monochumus alternatus),用家用机、原木机、板材机3种微波机型开展了疫木除害试验。结果表明:3种微波机均能快速杀灭疫木内的线虫和天牛,最短2min就能100%杀灭疫木内线虫;微波除害难以得到杀灭线虫的松疫木临界温度,松疫木温度≥60、41～59、≤40℃,线虫死亡率分别为88.9%、61.3%、0;微波杀灭线虫与单位质量疫木所受到的微波能量有关,夏季3.5W.min.g-1、冬季9.0W.min.g-1能100%杀灭线虫;杀灭天牛所需能量高于线虫,其中杀灭天牛需能9.76W.min.g-1,杀灭线虫需能8.86W.min.g-1。微波杀灭线虫K与微波处理时间T和微波机功率W呈正比,与疫木质量m和升温Δt呈反比,可用公式K=T.W/(m.Δt)表达;微波处理疫木所需时间T与疫木质量m和升温Δt成正比,与微波功率W成反比,可用公式T=K.Δt.m/W表达。     

进境木片松材线虫PCR检测方法研究

利用松材线虫rDNA内转录区（ITS）特异性引物,对泉州口岸入境木片携带的线虫基因组DNA进行特异性PCR扩增,建立一套快速准确的线虫检测鉴定方法。将该检测方法应用于泉州口岸现场检疫鉴定,结果未检测到松材线虫,与传统形态学鉴定方法结果一致。     

西日本松材线虫病生态地理分布图式的研究

本文对西日本98个地域,21个生态因子,采用灰色聚类和模糊聚类的分析方法,研究了松材线虫病(Bursaphelenchus xylophilus)在西日本的生态地理分布图式。其结果将西日本识别为最适宜、适宜、比较适宜、一般适宜、不适宜、最不适宜6类分布环境类型,并给出了分布图。     

松材线虫传播机理的研究进展

松材线虫Bursaphelenchus xylophilus主要靠媒介昆虫松墨天牛Monochamus alternatus传播,并通过天牛造成的伤口侵入松树,因此,掌握松材线虫的传播机制,有助于了解线虫病的发生机理和发生规律。综述了松材线虫与其媒介昆虫关系研究的最新进展。     

松材线虫体壁物的厚度和糖含量比较

为进一步弄清松材线虫的致病机理,该文对松树上分离的松材线虫、拟松材线虫和小杆线虫的体壁物进行了初步研究。 通过电镜观察和可溶性糖含量分析,发现松材线虫体表有一层很厚的物质,而拟松材线虫和小杆线虫体表比较光滑;松材线虫比其他两种线虫体表有更多的糖类物质。研究同时提出,松材线虫和拟松材线虫体表物质的厚度和糖含量,可能与二者的致病性有密切关系。