多杀菌素产生菌株航天育种效果研究

[目的]探索多杀菌素诱变育种的有效途径。[方法]对多杀菌素经"实践八号"育种卫星搭载后的菌株进行稀释涂布分离并对分离后的菌株进行筛选和发酵测定,计算多杀菌素总效价。[结果]搭载后的刺糖多孢菌SP1,经大量筛选得到2株高产且遗传性状相对稳定的菌株HY463和HY466,多杀菌素总效价分别达到147.51μg/ml和95.33μg/ml,产量分别比出发菌株SP1提高288%和151%。对搭载后的菌株进行稀释涂布分离发现,菌落形态各异,有草帽状、中间凹状、放射线状和宝塔状,并且以草帽状的菌落居多,且不同形态的突变菌株发酵水平也参差不齐。[结论]与UV6、0Co等其他诱变方法相比,空间搭载诱变更能使刺糖多孢菌的产素能力得到较大的提高,是选育多杀菌素高产菌株的有效方法。     

利用离子注入技术选育多杀菌素高产菌株

多杀菌素是由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵产生的大环内酯类化合物,是一种应用前景广阔的生物农药。采用氮离子注入方法并结合前体和自身代谢物抗性来选育多杀菌素高产菌株。结果显示利用氮离子注入诱变刺糖多孢菌,其致死率曲线呈典型的马鞍形,并确定30 s×2.6×1013 ions/cm2的注入剂量用于进一步诱变筛选。通过前体及自身代谢物抗性筛选,最终得到5株多杀菌素高产菌株,其多杀菌素的最高产量比选育前提高了44%。表明该技术对多杀菌素高产菌株的选育是一种行之有效的方法。     

利用抗生素抗性筛选技术和基因组重排技术选育刺糖多孢菌提高多杀菌素产量

以刺糖多孢菌(5accharopolyspora spinosa)ATCC49460为出发菌株,通过抗生素抗性筛选技木和基因组重排技术,提高次生代谢产物多杀菌素的产量。结果表明:通过抗生素抗性筛选技术获得的链霉素抗性菌株(Str-70)多杀菌素产量提高3.3倍,庆大霉素抗性菌株(Gen-139)多杀菌素产量提高2.9倍。将以上两种菌株再次作为出发菌株进行四轮基因组重排,获得的同时具有两种抗性的菌株(SG4-34)多杀菌素产量提高6倍。     

1株高产蛋白饲料菌株的选育及生物特性研究

[目的]研究1株高产蛋白饲料菌株的选育及生物学特性。[方法]以较高产蛋白饲料菌株S4.1为出发菌株,进行紫外线诱变,获得1株高产蛋白饲料菌株S4.107,研究其生物学特性及培养方法。[结果]S4.107生长速度快。粗蛋白含量达到27.31%。S4.107最佳生长时间为26 h,最适生长温度为30℃,最适生长pH值为7,适宜的碳源为6‰蔗糖和10‰葡萄糖,适宜的氮源为8‰的酵母浸出汁和10‰蛋白胨。[结论]利用自然突变和人工紫外线诱变相结合的方法,可获得高产蛋白菌株。     

高产胆固醇氧化酶菌株的诱变选育

[目的]选育高产胆固醇氧化酶菌株。[方法]从环链拟青霉、斜链拟青霉、中国拟青霉和蛹拟青霉中筛选出发菌株,对筛选出的酶活力高的突变株进行紫外诱变,选育出高产胆固醇氧化酶突变株,对其发酵条件进行优化并测定其酶活。[结果]选择环链拟青霉为诱变选育的出发菌株,紫外诱变环链拟青霉获得了一株高产胆固醇氧化酶突变株CM3,确定了紫外诱变的最佳时间是80S。通过优化其发酵条件,得出CM3发酵产酶最优条件为30℃,pH值6．0,接种量为10％。其最高酶活力为1．3360U／ml,比出发菌株（0．3369U／m1）提高了296．6％。[结论]通过紫外诱变能选育出有较高胆固醇氧化酶活力的菌株。     

以脂肪酶活为指标快速筛选吉他霉素高产菌株的研究

[目的]筛选吉他霉素高产菌株。[方法]以1株北里链霉菌Zn14-05为出发菌株,进行紫外线与NTG复合诱变处理,通过以脂肪酶活力为初筛指标和摇瓶复筛筛选吉他霉素高产菌株。[结果]摇瓶发酵效价比出发菌株提高10%;传代试验结果表明其遗传性能稳定。[结论]以高脂肪酶活性为初筛指标选育吉他霉素高产突变株,缩短了选育周期,减少了初筛工作量,提高了选育效率。     

基于诱变和抗性突变的多杀霉素高产菌株的选育

为提高菌株发酵液中多杀霉素产量,本试验利用常温常压等离子体(ARTP)诱变、紫外(UV)诱变和抗性突变技术处理刺糖多孢菌株DS0322-3,结合高通量筛选和摇瓶发酵选育多杀霉素高产菌株。结果显示,通过ARTP诱变和UV诱变育种,筛选获得384株突变菌株,其中有9株突变菌株的效价较原始菌株增加10%以上,且1株效价较原始菌株增加20%以上,经过ARTP诱变30 s,得到的突变菌株AR1019-4效价为547.78 mg/L,较原始菌株增加了21.88%。以ARTP诱变得到的高产突变菌株AR1019-4为出发菌株,通过抗性突变筛选技术筛选获得1 152株突变株,其中13株突变菌株的效价较出发菌株增加10%以上,且2株效价较出发菌株增加15%以上,在0.5 mg/L的氯霉素平板上得到的突变菌株Chl 1215-5效价为637.12 mg/L,较出发菌株增加了16.31%;12 mg/L的庆大霉素抗性突变筛选到了突变菌株Gen 1207-8,效价为597.59 mg/L,该菌株的Spinosyn D组分由10%～15%增加至30%～35%左右,经遗传稳定性试验验证,突变菌株Chl1215-5和Gen1207-8可稳定遗传。试验结果表明ARTP诱变、紫外诱变和抗生素突变技术对选育多杀霉素高产菌株具有重要意义。     

高产谷胱甘肽酵母菌株的筛选和抗乙硫氨酸突变株的选育

[目的]选育高产谷胱甘肽的酵母菌株。[方法]通过紫外线进行诱变处理,运用推理育种技术获得抗乙硫氨酸突变株。[结果]从土壤中筛选出一株高产GSH的菌株HSJB1,其摇瓶发酵生物量为3.87 g/L,GSH产量为91.87 mg/L。依据菌株的细胞形态特征及生理生化特征,初步鉴定其为Saccharomyces cerevisiae。通过紫外线对出发菌株HSJB1进行诱变处理,获得一株抗乙硫氨酸突变株YBS77,该突变株经摇瓶发酵,生物量达7.60 g/L,GSH产量为211.96 mg/L。[结论]通过选育获得的突变株生物量比出发菌株提高了96.38%,GSH产量提高了130.72%,表明该育种方法可行。     

微波联合抗生素抗性诱变选育泰妙菌素高产菌株

为了获得泰妙菌素高产菌株,以泰妙菌素19-127为出发菌株,采用微波诱变对泰妙菌株进行诱变,并结合特比萘酚及制霉菌素两种抗生素抗性筛选法获得泰妙菌素高产菌株。结果表明,经过发酵验证最终选育出5株突变株20-016、20-029、20-048、20-072和20-088,相较于对照组效价分别增长19.9%、21.6%、20.2%、22.5%和23.1%,连续传代5次,遗传性状稳定。比较两种抗生素在泰妙菌素高产菌株选育中的作用,制霉菌素更有利于高产菌株的选育。     

阿维菌素高产工业菌株的推理选育研究(英文)

[目的]通过推理选育,获得高产的阿维菌素工业生产菌种。[方法]以Biok Av-023为出发菌株,首先采用常规紫外诱变筛选出正突变菌株,再通过添加L-异亮氨酸诱导推理选育方法选育高产阿维菌素生产菌株。[结果]经紫外诱变和L-Ile定向筛选表明,L-Ile筛选浓度以0.5%最佳,经复筛后获得的高产突变菌株AV60s-32最高效价可达4 520 IU/ml,与出发菌株相比提高了23.4%。[结论]采用紫外诱变和L-Ile推理选育相结合的方法可有效提高阿维菌素菌种发酵效价。     

环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响

【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白（cyclic AMP receptor protein,Crp）基因在刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因（crp）,通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-P_ermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子P_ermE的控制下;PCR扩增P_ermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将P_ermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体pUC-spn-P_ermE-crp。然后,采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-P_ermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中,通过单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,以染色体上整合了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌作为对照菌株。利用PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子;观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基中的生长及菌落形态差异,同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况,测定生长曲线。借用扫描电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态;采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp重组表达载体pUC-spn-P_ermE-crp,并通过接合转移导入到刺糖多孢菌中;PCR检测结果显示,工程菌株作为模板扩增出长约2 kb的cm-P_ermE-crp目的条带,说明crp已成功整合到刺糖多孢菌染色体上,并且获得的重组工程菌株S. spinosa-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培养基上,工程菌株S. spinosa-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株S. spinosa-1相比均有所延迟,但在R6培养基上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株S. spinosa-1相比,液体培养基中工程菌株S. spinosa-Crp二次生长现象消失,且生物量略高于S. spinosa-1。扫描电子显微镜结果显示工程菌株菌丝片段化程度较高,分支较少,有利于提高工程菌株S摇瓶发酵结果表明,工程菌株中的多杀菌素产量与对照菌株相比提高了128%。. spinosa-Crp发酵过程中的溶氧水平。【结论】crp的过量表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长产生一定影响,并有效促进刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成,为通过其他正调控基因的超量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了基础。     

96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的研究

考察了刺糖多孢菌在96孔板固体培养基和液体培养基中的生长情况,建立了96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的方法。结果表明：96孔板三明治盖能同时满足过滤杂菌和刺糖多孢菌生长耗氧所需,刺糖多孢菌在96孔板固体培养基中的生长情况与传统斜面培养相当,种子培养最适种龄为60 h,每孔发酵培养基装液量为0.4 mL。与传统摇瓶发酵筛选平台相比,该方法能显著提高多杀菌素高产菌株的筛选效率。     

刺糖多孢菌分批发酵动力学研究

利用摇瓶培养试验研究了刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa的分批培养过程中生物量、培养液pH、葡萄糖消长、多杀菌素含量等因素的变化规律。利用MATLAB软件对试验数据进行非线性回归，拟合出了细胞生长动力学模型、基质消耗动力学模型和产物生成动力学模型，得到了细胞生长量、残糖量、多杀菌素产量在发酵过程中随时间变化的规律，相关系数分别为0．98934、0．99266和0．98635．拟合曲线95％置信度区间分析的结果表明，该模型能够很好的反映出刺糖多孢菌分批发酵的过程．     

麦角酰胺产生菌Claviceps paspali的复合诱变及理性筛选

麦角酰胺是由麦角菌(Claviceps paspali)所产生的次级代谢产物,具有多种药理活性,目前已广泛用于治疗神经内分泌、脑血管系统的疾病以及产后止血,同时还作为原料用于合成其他重要药物。根据麦角酰胺的生物合成途径,以麦角酰胺产生菌HY17-3为初始菌株,经紫外诱变(UV)与甲基磺酸乙酯(EMS)复合诱变后,逐步筛选出乙酸钠、5-甲基色氨酸、丁二酸、山梨醇以及麦角酸的耐受株,最终得到高产菌株HY73-9,其摇瓶发酵效价达到590μg·mL-1,与初始菌株HY17-3(300μg·mL-1)相比,麦角酰胺的产量提高了97%。通过传代实验表明该菌株的高产遗传特性稳定。发酵罐发酵(30 L)实验显示麦角酰胺的产量可达815μg·mL-1,与初始菌株HY17-3相比,产量提高了172%。研究对于利用Claviceps paspali进行麦角酰胺的工业化生产具有重要意义。     

小菜蛾对辛硫磷的抗性选育及其乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶活力变化

在室内模拟田间药剂的选择压力,用辛硫磷对小菜蛾（Plutella xylostella）逐代处理,以选育其抗性种群,并测定乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE）和羧酸酯酶（carboxylesterase,CarE）的活性变化。选育至12代,对辛硫磷抗性增长到4.524倍。生化分析表明,抗性品系AChE和CarE活性均显著高于敏感品系。在抗性选育过程中,小菜蛾AChE酶活性增长迅速,其比活力由F0的0.035μmol/L·mg·min上升为F12的0.209μmol/L·mg·min;小菜蛾不同选育世代CarE酶活性差异显著,F12比活力增长到F0的12.944倍。     

刺糖多孢菌鼠李糖和福乐糖胺合成基因的克隆和组装

鼠李糖和福乐糖胺是多杀菌素生物合成必需的2个脱氧糖结构单元,负责其合成的4种酶的基因(gtt、epi、gdh、kre)与多杀菌素生物合成基因簇并不在一起,而是分散分布在染色体的3个位点上。为克隆到完整的多杀菌素生物合成基因簇,采用构建基因组文库、PCR扩增等手段从刺糖多孢菌NRRL18395染色体分别克隆gtt、epi、gdh和kre基因,并将其克隆组装在同一整合型载体上,以便于构建用于表达多杀菌素糖单元合成基因的表达载体。     

应用花培技术选育优质低温敏水稻核不育系金山S-1

选用性状互补的两个亲本8—1S和香125S杂交，采用系谱育种和花药培养相结合的方法育成两用核不育系金山S-1，已于2004年12月通过福建省科技厅技术鉴定。该两用不育系具临界温度低、不育性稳定、不育期长（〉120d）、米质优、配合力好、异交率结实高等特点。以金山S-1配制的杂交稻新组合具产量高、米质优等特点，具有较广阔的应用前景。     

佳木斯辣椒光合特性研究

日光温室内佳木斯辣椒光合速率日变化呈“双峰”曲线,11:00时达第一峰值(Pn=18.22 靘ol CO2·m-2·S-1),15:00时达第二峰值(Pn=17.3 9 靘ol CO2·m-2·S-1),12:00 ~14:00时表现明显“午休”现象,其中12:00~13:00时为气孔因素所致,13:00~14:00时为非气孔因素所致;光合作用光补偿点和饱和点分别为44.6 靘ol·m-2·S-1和1 166.6 靘ol m-2·S-1;CO2补偿点和饱和点分别51.7 L·L-1和1 416.6 L·L-1;座果节叶片光合速率、蒸腾速率和气孔导度均显著高于无果节叶片。