利用离子注入技术选育多杀菌素高产菌株

多杀菌素是由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵产生的大环内酯类化合物,是一种应用前景广阔的生物农药。采用氮离子注入方法并结合前体和自身代谢物抗性来选育多杀菌素高产菌株。结果显示利用氮离子注入诱变刺糖多孢菌,其致死率曲线呈典型的马鞍形,并确定30 s×2.6×1013 ions/cm2的注入剂量用于进一步诱变筛选。通过前体及自身代谢物抗性筛选,最终得到5株多杀菌素高产菌株,其多杀菌素的最高产量比选育前提高了44%。表明该技术对多杀菌素高产菌株的选育是一种行之有效的方法。     

96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的研究

考察了刺糖多孢菌在96孔板固体培养基和液体培养基中的生长情况,建立了96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的方法。结果表明：96孔板三明治盖能同时满足过滤杂菌和刺糖多孢菌生长耗氧所需,刺糖多孢菌在96孔板固体培养基中的生长情况与传统斜面培养相当,种子培养最适种龄为60 h,每孔发酵培养基装液量为0.4 mL。与传统摇瓶发酵筛选平台相比,该方法能显著提高多杀菌素高产菌株的筛选效率。     

环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响

【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白（cyclic AMP receptor protein,Crp）基因在刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因（crp）,通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-P_ermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子P_ermE的控制下;PCR扩增P_ermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将P_ermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体pUC-spn-P_ermE-crp。然后,采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-P_ermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中,通过单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,以染色体上整合了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌作为对照菌株。利用PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子;观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基中的生长及菌落形态差异,同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况,测定生长曲线。借用扫描电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态;采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp重组表达载体pUC-spn-P_ermE-crp,并通过接合转移导入到刺糖多孢菌中;PCR检测结果显示,工程菌株作为模板扩增出长约2 kb的cm-P_ermE-crp目的条带,说明crp已成功整合到刺糖多孢菌染色体上,并且获得的重组工程菌株S. spinosa-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培养基上,工程菌株S. spinosa-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株S. spinosa-1相比均有所延迟,但在R6培养基上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株S. spinosa-1相比,液体培养基中工程菌株S. spinosa-Crp二次生长现象消失,且生物量略高于S. spinosa-1。扫描电子显微镜结果显示工程菌株菌丝片段化程度较高,分支较少,有利于提高工程菌株S摇瓶发酵结果表明,工程菌株中的多杀菌素产量与对照菌株相比提高了128%。. spinosa-Crp发酵过程中的溶氧水平。【结论】crp的过量表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长产生一定影响,并有效促进刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成,为通过其他正调控基因的超量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了基础。     

糖多孢菌属菌株的体内转座诱变系统

为实现糖多孢菌的体内转座诱变,采用刺糖多孢菌的强启动子促进Tn5转座酶基因tnp(5)的表达,优化链霉菌高效转座质粒pHL734,构建了转座质粒pJTn1、pJTn2、pJTn3、pJTn4、pJTn5、pJTn6。结果显示:pJTn1～pJTn6系列转座质粒均可在红色糖多孢菌中高效转座;pJTn1和pJTn5可在刺糖多孢菌中进行转座,获得31个刺糖多孢菌转座突变株;其中30个菌株的基因组中检测到标准的Tn5转座,8个突变株的多杀菌素产量显著降低。表明pJTn系列转座质粒可作为糖多孢菌的体内转座诱变工具,为抗生素的产量调控研究和高产育种靶标基因筛选提供理论依据。     

陶氏新农药——乙基多杀菌素

理化性质：乙基多杀菌素是从放线菌刺糖多孢菌（saccharopolyspora spinosa）发酵产生多杀菌素（spinasad）的换代产品。     

多杀菌素产生菌株航天育种效果研究

[目的]探索多杀菌素诱变育种的有效途径。[方法]对多杀菌素经"实践八号"育种卫星搭载后的菌株进行稀释涂布分离并对分离后的菌株进行筛选和发酵测定,计算多杀菌素总效价。[结果]搭载后的刺糖多孢菌SP1,经大量筛选得到2株高产且遗传性状相对稳定的菌株HY463和HY466,多杀菌素总效价分别达到147.51μg/ml和95.33μg/ml,产量分别比出发菌株SP1提高288%和151%。对搭载后的菌株进行稀释涂布分离发现,菌落形态各异,有草帽状、中间凹状、放射线状和宝塔状,并且以草帽状的菌落居多,且不同形态的突变菌株发酵水平也参差不齐。[结论]与UV6、0Co等其他诱变方法相比,空间搭载诱变更能使刺糖多孢菌的产素能力得到较大的提高,是选育多杀菌素高产菌株的有效方法。     

多杀菌素发酵培养基的研究

【目的】以刺糖多孢菌C4-10-8B为试验菌株,对多杀菌素发酵培养基进行优化,以提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量。【方法】采用单因素和多因素试验,分别考察了不同碳源、氮源、前体、无机盐和微量元素对多杀菌素生物合成的影响,最后通过正交试验综合考察发酵培养基中各组分对多杀菌素产量的影响。【结果】葡萄糖是较优碳源,最佳质量浓度为40.0 g/L,当葡萄糖与糊精(质量比5∶2)复配时,多杀菌素产量较对照培养基提高18.35%;棉籽蛋白为最优氮源,25.0 g/L棉籽蛋白与15.0 g/L玉米蛋白胨或0.6 g/L硫酸铵复配时,多杀菌素产量分别较对照提高40.0%和45.3%;乙酸钠和谷氨酰胺质量浓度为1.0 g/L时,均能使多杀菌素产量较对照提高21.5%;K2HPO4对多杀菌素合成有明显的促进作用,在其质量浓度为2.5 g/L时,多杀菌素产量较对照提高24.5%;ZnCl2对多杀菌素合成也有促进作用,而MgSO4和CoCl2则显著抑制多杀菌素合成;通过2次正交试验获得最优发酵培养基,利用该培养基时多杀菌素产量可达395.54μg/mL,比对照提高了62.5%。【结论】多杀菌素生物合成的最优发酵培养基为:葡萄糖50.0 g/L,棉籽蛋白25.0 g/L,玉米蛋白胨20.0 g/L,(NH4)2SO40.8 g/L,谷氨酰胺1.25 g/L,乙酸钠0.8 g/L,NaCl 3.0 g/L,K2HPO42.5 g/L,FeSO450.0 mg/L,ZnCl225.0 mg/L,CaCO31.0 g/L。     

刺糖多孢菌鼠李糖和福乐糖胺合成基因的克隆和组装

鼠李糖和福乐糖胺是多杀菌素生物合成必需的2个脱氧糖结构单元,负责其合成的4种酶的基因(gtt、epi、gdh、kre)与多杀菌素生物合成基因簇并不在一起,而是分散分布在染色体的3个位点上。为克隆到完整的多杀菌素生物合成基因簇,采用构建基因组文库、PCR扩增等手段从刺糖多孢菌NRRL18395染色体分别克隆gtt、epi、gdh和kre基因,并将其克隆组装在同一整合型载体上,以便于构建用于表达多杀菌素糖单元合成基因的表达载体。     

拟无枝酸菌宿主构建及次级代谢基因簇异源表达

为将生长快、发酵时间短、遗传操作便捷的稀有放线菌拟无枝酸菌TNS106开发成异源表达宿主,通过同源重组将内源的瑞斯托霉素生物合成关键基因rpsA替换为ΦC31和ΦBT1噬菌体细菌附着位点attB,清除代谢背景并引入整合位点,得到菌株HXR1;将含有来自天蓝色链霉菌的放线紫红素基因簇或来自刺糖多孢菌的多杀菌素基因簇的质粒转到HXR1进行异源表达,检测发酵产物。结果显示,HXR1成功表达放线紫红素和多杀菌素;与红色糖多孢菌宿主LJ161相比,放线紫红素的产生提前1 d,产量提高1.3倍。拟无枝酸菌异源表达宿主HXR1可为从链霉菌和稀有放线菌中发现新的次级代谢产物提供有用的平台。     

利用抗生素抗性筛选技术和基因组重排技术选育刺糖多孢菌提高多杀菌素产量

以刺糖多孢菌(5accharopolyspora spinosa)ATCC49460为出发菌株,通过抗生素抗性筛选技木和基因组重排技术,提高次生代谢产物多杀菌素的产量。结果表明:通过抗生素抗性筛选技术获得的链霉素抗性菌株(Str-70)多杀菌素产量提高3.3倍,庆大霉素抗性菌株(Gen-139)多杀菌素产量提高2.9倍。将以上两种菌株再次作为出发菌株进行四轮基因组重排,获得的同时具有两种抗性的菌株(SG4-34)多杀菌素产量提高6倍。     

Streptomyces spiroverticillatus生产变构霉素发酵动力学研究

在15 L发酵罐内,对Streptomyces spiroverticillatus生产变构霉素的分批发酵动力学特性进行了研究。在发酵过程中在线检测了发酵液的pH、溶氧以及温度,还对发酵产物量、菌体量、总糖含量进行离线检测。基于Logistic方程和Luedeking-Piret方程,建立了变构霉素分批发酵动力学模型。根据发酵试验数据确定了模型参数,得到菌体生长动力学模型、变构霉素生产动力学模型以及总糖消耗动力学模型。在相应的条件下,经验证,实验值与模型的拟合值接近,拟合度分别为0.9922,0.9897,0.9934,表明该动力学模型在初始总糖浓度67.2606～74.8759 g/L、接种量8% (V/V)、搅拌速率150 r/min以及通气量1.1 vvm的发酵条件下能较正确描述变构霉素发酵过程。     

链霉菌702产红谷霉素分批发酵动力学研究

以链霉菌702 D34为供试菌株,对链霉菌702产红谷霉素分批发酵动力学模型进行研究。建立了该菌株分批发酵合成红谷霉素的菌体生长、产物合成和葡萄糖消耗的动力学模型,并对模型参数进行了非线性回归。结果表明,预测值与实验值有良好的拟和性,说明所建数学模型能较好地描述实际合成红谷霉素的分批发酵过程。     

美味牛肝菌产胞外多糖分批发酵的动力学模型研究

采用分批发酵方法研究了美味牛肝菌胞外多糖的合成特性。结果表明,美味牛肝菌多糖合成和菌体生长呈部分生长偶联型。根据Logistic和Luedeking-Piret方程分别建立了美味牛肝菌发酵过程中菌体生长、胞外多糖生成和基质消耗的动力学模型,并利用1stOpt软件对模型参数进行了非线性拟合,将模型拟合值与试验值进行比较,得3个模型的拟合度分别为0.996、0.987、0.996。     

Establishment of Kinetics Models for Batch Fermentation Process of β-mannase with Bacillus licheniformis HDYM-04

In order to improve the yield of β-mannase and to investigate the rules of fermentation production, a high-yield β-mannase producing strain, Bacillus licheniformis HDYM-04, was used to investigate the kinetics models based on the optimal fermentation conditions: HDYM-04 strain was fermented at 37℃ for 30 h with agitation speed at 300 r/min and aeration rate at 3 L/min in a 5 L fermenter, the initial addition amount of konjac flour was 2%(w/v), the initial pH of medium was 8.0, and the inoculum concentration was 6.7%(v/v). Three batch fermentation kinetic models were established(cell growth kinetic model, substrate consumption kinetic model,product formation kinetic model) bases on Logistic and Luedeking-Piret equations.To be specific, cell growth kinetic model wasdX dt=0.431X(1-X15.522), substrate consumption kinetic model was-dS dt=1.11dX dt+0.000 2dP dt+0.000 8X, and product formation kinetic model wasdP dt=133.1dX dt+222.87X. The correlation coefficients R2of the three equations were 0.990 21, 0.989 08 and 0.988 12, respectively, which indicated a good correlation between experimental values and models. Therefore,the three equations could be used to describe the processes of cell growth, enzyme synthesis and substrate consumption during batch fermentation using B. licheniformis strain HDYM-04. The establishment of batch fermentation kinetic models(cell growth kinetic model, substrate depletion kinetic model, product formation kinetic model)could lay the theoretical foundation and provide practical reference for the application of HDYM-04 in fermentation industry.     

甘蔗糖蜜发酵合成茁霉多糖及其发酵动力学

为探明以甘蔗糖蜜为原料发酵合成茁霉多糖（Pullulan)的过程,采用Logistic equation模型和Luedekingpiret方程对Pullulan发酵动力学进行了研究,通过研究建立出芽短梗霉MM生长、Pullulan合成和底物(糖蜜)消耗相关的动力学模型参数,阐述Pullulan的动力学特征,结果表明：出芽短梗霉MM发酵进程中前期菌体生长速度较快,72h后生长趋于稳定期,其茁霉多糖的合成随菌体的生长不断上升,到132h时多糖达到最高,为4．078g／L,基于Logistic equmion方程和Luedeking-piret方程,得到了描述发酵过程的动力学模型和模型参数,该模型反映了菌体生长、多糖合成和底物消耗之间的关系,模型的拟合结果与实验值吻合较好,误差小于10％。     

不同酿酒酵母利用荔枝渣生产酒精性能的比较

[目的]比较不同酿酒酵母菌利用荔枝渣产酒精发酵性能,筛选出适合在荔枝渣培养基中发酵的最佳菌种。[方法]研究了5株酿酒酵母菌在荔枝渣培养基中的生长情况,测定了其在荔枝渣培养基中的失重量、产酒精能力和残糖含量。[结果]在最适生长温度为36℃,pH值为3.5的条件下,安琪耐高温高活性酿酒酵母发酵产酒精能力强。[结论]安琪耐高温高活性酿酒酵母在该条件下发酵综合性能最好。     

蜡蚧轮枝菌液体发酵的代谢动力学

研究蜡蚧轮枝菌菌株在19 L全自动发酵罐发酵培养过程中生物量、产孢量和营养物质等代谢变化,并对其动力学特性进行了分析.结果表明,蜡蚧轮枝菌在发酵过程中菌体生长可分为延迟期、指数生长期、稳定期和衰退期,菌体生长量与葡萄糖消耗量密切相关,同时液生孢子产量的发酵动力学特征为部分生长连动型发酵.