环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响

【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白（cyclic AMP receptor protein,Crp）基因在刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因（crp）,通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-P_ermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子P_ermE的控制下;PCR扩增P_ermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将P_ermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体pUC-spn-P_ermE-crp。然后,采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-P_ermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中,通过单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,以染色体上整合了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌作为对照菌株。利用PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子;观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基中的生长及菌落形态差异,同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况,测定生长曲线。借用扫描电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态;采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp重组表达载体pUC-spn-P_ermE-crp,并通过接合转移导入到刺糖多孢菌中;PCR检测结果显示,工程菌株作为模板扩增出长约2 kb的cm-P_ermE-crp目的条带,说明crp已成功整合到刺糖多孢菌染色体上,并且获得的重组工程菌株S. spinosa-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培养基上,工程菌株S. spinosa-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株S. spinosa-1相比均有所延迟,但在R6培养基上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株S. spinosa-1相比,液体培养基中工程菌株S. spinosa-Crp二次生长现象消失,且生物量略高于S. spinosa-1。扫描电子显微镜结果显示工程菌株菌丝片段化程度较高,分支较少,有利于提高工程菌株S摇瓶发酵结果表明,工程菌株中的多杀菌素产量与对照菌株相比提高了128%。. spinosa-Crp发酵过程中的溶氧水平。【结论】crp的过量表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长产生一定影响,并有效促进刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成,为通过其他正调控基因的超量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了基础。     

丁烯基多杀菌素高产菌株的巴龙霉素抗性筛选

为了提高须糖多孢菌Saccharopolyspora pogona的丁烯基多杀菌素产量水平,利用核糖体工程技术,对其进行巴龙霉素抗性筛选,在10×MIC巴龙霉素浓度下,分离得到巴龙霉素自发抗性突变株54株。通过对原始菌株和突变株代谢产物变化的初步研究发现,相比于原始菌株,丁烯基多杀菌素组分在抗性突变株中的合成能力有明显差异,有6株抗性突变株的产量明显高于原始菌株,约20%左右的突变株产量提高,约45%左右的突变株产量降低。其中突变株P-7的丁烯基多杀菌素产量提高幅度最大,相比原始菌株提高2.2倍。对巴龙霉素抗性突变株P-7进行DNA序列分析,在编码核糖体S12蛋白的rps L基因保守区域中发现点突变,第314位的C突变为A,由脯氨酸突变为谷氨酰胺;第320位的C突变为T,由丙氨酸突变为缬氨酸。