影响蕉柑胚性愈伤组织增殖的因素

柑橘胚性愈伤组织具有广泛的研究用途 ,是种质资源离体保存、外源基因转化的理想材料 .柑橘胚性愈伤组织的生长受培养基组成成分影响显著[1,2 ] ,探讨柑橘胚性愈伤组织生长的影响因素将为胚性愈伤组织的长期继代保存提供依据 ,而且生长状况良好的柑橘胚性愈伤组织的获得是进行原生质体融合、外源基因转化及相关生物技术研究的基础 .1　材料与方法　　材料 :华南农业大学生物物理实验室诱导的蕉柑 (Ｃｉｔｒｕｓｒｅｔｉｃｕｌａｔａｖａｒ.ｔａｎｋａｎＨａｙａｔａ)胚性愈伤组织 .培养基 :以ＭＴ为基本培养基 ,添加不同浓度的细胞分裂素 (…     

甘蔗根癌农杆菌介导转化海藻糖合酶基因获得抗渗透胁迫能力增强植株

 由双拷贝CaMV35S启动子驱动担子菌灰树花 (Grifolafrondosa)的海藻糖合酶基因 (TSase)构建植物表达载体 pBBBT ,通过三亲交配法将 pBBBT导入根癌农杆菌EHA10 5菌株 ,经根癌农杆菌介导转化甘蔗 (Saccha rumhybrid)栽培品种 ,以增强甘蔗的抗旱能力。结果表明 ,甘蔗胚性愈伤组织对EHA10 5菌株敏感 ,甘蔗外植体开始大量形成胚性愈伤组织时是感染的适宜时期 ,用膦丝菌素 (PPT)筛选 ,抗性植株发生频率平均为 4 .5 %。经PCR及dot Southern检测证明 ,TSase已经整合到甘蔗基因组中。部分转化植株根叶畸形、株型异常、生长缓慢。移栽到含PEG80 0 0 17.4 % (w/v)的MS培养基后 ,观察到转基因植株抗渗透胁迫能力增强     

低酚棉胚性愈伤组织农杆菌转化体系建立及转DREB1C植株的获得

利用农杆菌介导法对低酚棉胚性愈伤组织转化转录因子DREB1C基因,探讨了低酚棉胚性愈伤组织对潮霉素的敏感性和胚性愈伤组织状态对转化效率的影响。结果表明：胚性愈伤组织对潮霉素较为敏感,适宜的筛选浓度为25mg／L,可明显抑制非转化组织生长。以继代培养7～14d的胚性愈伤组织作为转化受体,转化率高达56．3％。将转化后获得的抗性愈伤组织转入分化培养基中分化成苗,经过PCR检测得到5株阳性植株。     

粳型恢复系C418转基因再生体系的建立

为水稻转基因育种和突变体库的建立创造有利条件,以粳稻C418成熟胚为外植体,通过植物组织培养技术,考察不同基础培养基(N6、MS、MSN、NMB、NB、MB和NBD)和生长素2,4-D浓度(1mg/L、2mg/L和3mg/L)对外植体愈伤组织诱导效果;将继代培养获得的优良愈伤组织采用农杆菌介导法进行遗传转化,并考察适宜的共培养时间以及不同抗生素(头孢霉素、氨苄霉素和m潮霉素)对愈伤组织的分化效果,以建立北方骨干粳型恢复系C418转基因再生体系。结果表明:在愈伤组织诱导过程中,基础培养基NBD+3mg/L 2,4-D处理粳稻C418成熟胚愈伤组织诱导率最高,达90.38%,愈伤组织生长状态最佳;水稻愈伤组织共培养2d获得的抗性愈伤组织最多,筛选培养基中降低头孢霉素浓度并添加氨苄霉素可提高水稻愈伤组织分化率。通过培养基类型、激素浓度、共培养时间及抗生素种类的最佳组合,成功建立北方骨干粳型恢复系C418转基因再生体系,即水稻外植体经次氯酸钠处理后接种于诱导培养基NBD+3mg/L 2,4-D,获得愈伤组织,再用农杆菌悬浮液(含目的基因)侵染愈伤组织,最后获得含目的基因的转基因植株。     

农杆菌介导抗草甘膦基因(EPSPS)的玉米转化及相关因子的影响研究

对影响农杆菌转化效率的一些因素进行了研究优化,结果表明,诱导培养基中添加200 mg/L的头孢霉素既能抑制农杆菌的生长又不影响幼胚的愈伤诱导;诱导和筛选培养基中添加5 mg/L硝酸银能有效抑制玉米愈伤组织褐变,显著改善愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导率;分化培养基中添加2μmol/L的嘧啶醇能延缓试管苗的生长速度,使苗更健壮。利用优化的根癌农杆菌介导转化体系将抗草甘膦基因(EPSPS)转入玉米杂交材料HiⅡ中,获得了PCR阳性植株。     

农杆菌介导冷调节基因（Cbcor15a）遗传转化甘蔗体系的建立

【目的】利用农杆菌介导法,将外源冷调节基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织,建立快速、高效的甘蔗遗传转化体系,为培育具抗寒性甘蔗品种奠定基础。【方法】以新台糖22号（ROC22）为材料,通过对愈伤组织诱导、分化、生根等培养基进行优化,筛选出外源基因转化甘蔗的适合激素种类与用量、PPT用量、抗生素种类与用量;利用甘蔗转基因二元植物表达载体pCambia1300-Cbcor15a-bar,通过农杆菌介导法将目的基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织。【结果】当农杆菌菌液OD600为0.4、侵染20 min时有利于愈伤组织分化;甘蔗愈伤组织诱导和分化培养阶段的最佳PPT为0.50mg/L。侵染后在共培养中添加500.00 mg/L抗生素Cef能有效抑制农杆菌,添加300.00 mg/L抗生素Cef能促进愈伤组织分化成苗,添加200.00 mg/L抗生素Cef能促进幼苗生根。MS培养基中添加低量NAA更有利于甘蔗愈伤组织的分化;在促进细胞分裂时KT的效果明显优于6-BA。MS培养基中添加5.00 mg/LNAA和70.00g/L蔗糖能有效促进分化苗生根。利用建立的遗传转化体系可获得286株转冷调节基因Cbcor15a的甘蔗转化植株;选取83株通过PPT抗性筛选后长势良好的转化植株进行阳性检测,其中有4株呈阳性。【结论】利用农杆菌介导的Cbcor15a基因转化甘蔗的遗传转化体系能成功将Cbcor15a基因整合到甘蔗基因组。     

柳枝稷成熟胚愈伤组织诱导的影响因素

为优化柳枝稷愈伤组织诱导培养条件,以柳枝稷成熟胚为外植体,通过正交设计,研究基因型、2,4-D、6-BA、基本培养基、碳源和pH等因素对柳枝稷成熟胚愈伤组织诱导的影响。结果表明,6种因素中,2,4-D对柳枝稷成熟胚愈伤组织诱导的胚性愈伤率影响最大,6-BA次之,再次为基本培养基,而基因型、碳源和pH对胚性愈伤率影响较小。柳枝稷成熟胚愈伤组织诱导的最佳培养基组合为2,4-D 5 mg/L,6-BA0.2mg/L,基本培养基B5或MS或N6以及基因型西稷3号。柳枝稷成熟胚愈伤组织诱导的胚性愈伤率与出愈率、愈伤组织鲜质量和干质量均呈显著正相关关系,出愈率与愈伤组织干质量和愈伤组织鲜质量无显著相关性。     

农杆菌介导棉花遗传转化影响因素的研究

为优化农杆菌介导棉花胚性愈伤的遗传转化体系,我们以2个栽培棉花品种新陆中36、新陆中45的胚性愈伤组织作为受体材料,利用农杆菌介导法转化Bt基因,研究愈伤组织状态、菌液处理浓度、侵染时间及共培养条件等因素对转化率的影响。结果表明:(1)预培养15~20天呈颗粒状、生长旺盛、分散性好的胚性愈伤组织适于转化,其中以继代18天的新陆中36愈伤组织转化率最高,为80%,不同基因型间存在差异。(2)菌液浓度0.4~0.5 OD600,农杆菌侵染10~15分钟是这两种胚性愈伤组织的最佳侵染时间。(3)50 mg/L是卡那霉素对抗性胚性愈伤起到有效筛选的最佳浓度。通过本研究实现了对受体材料、农杆菌侵染浓度、侵染时间和共培养条件的进一步摸索,棉花抗性胚性愈伤再生培养体系得到进一步的优化。     

超级稻沈农9741的组织培养体系的构建

以超级稻沈农9741的成熟胚为外植体,通过筛选基本培养基、优化激素组合和调节培养基渗透压,构建了适合水稻特定品种的高效再生体系.试验结果表明:愈伤组织诱导培养采用13(NBB 2.0mg·L-12,4-D)培养基可获得95%的愈伤诱导率;愈伤组织继代培养采用S3(NBB 1.5 mg·L-12,4-D 0.2 mg·L-16-BA 500 mg·L-1脯氨酸)的培养基能使愈伤快速增殖,并且保持良好的胚性;愈伤组织分化培养采用D2(NBB 3.0 mg·L-16-BA 0.5 mg·L-1NAA 500 mg·L-1脯氨酸)的培养基可获得85%的幼苗分化率.该体系可用于超级稻沈农9741的遗传转化和基因工程育种研究中.     

根癌农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系的研究

采用根癌农杆菌介导法将苏云金氏芽孢杆菌毒蛋白B.t基因cryIA转入甘蔗胚性愈伤组织中,建立农杆菌转化甘蔗的遗传转化体系,获得13棵再生植株。经GUS及PCR检测,cryIA确实已转移到甘蔗幼苗中,GUS在再生植株中也得到瞬时表达。     

反义AcInv基因转化马铃薯方法的研究

马铃薯反义AcInv基因,采用农杆菌介导法,选用生产上推广的9个普通四倍体栽培种,对影响转化的各个因素进行了优化研究。结果表明:在愈伤组织诱导过程中,卡那霉素(Km)的适宜浓度为100 mg/L;生根过程中为50 mg/L。外植体的预培养为:茎段2 d,叶盘3 d效果较好;农杆菌浓度当OD600值为0.5时对茎段和叶盘的转化效果均较佳;茎段和叶盘侵染时间分别达8 min和10 min时转化率较高;外植体与农杆菌共培养时间分别为2 d和3 d时,茎段和叶盘的转化率较高;各个品种的外植体在卡那霉素抗性培养基上均能形成愈伤组织,但只有1号(“大西洋”)最后从愈伤组织上分化成苗,形成正常植株,植株再生率为11.2 %,PCR扩增检测表明大部分转基因植株为阳性。     

农杆菌介导的紫穗槐茎段愈伤组织遗传转化研究

采用农杆菌介导法对紫穗槐茎段诱导的愈伤组织进行遗传转化研究。确定了卡那霉素临界耐受浓度为40mg/L。菌液浓度与侵染时间的正交试验结果表明:侵染菌液OD600为0.8、侵染时间为30min时转化效率最高,达17.95%。GUS染色检测分析表明:含pBI121-GUS质粒DNA农杆菌侵染转化的愈伤组织其抗性不定芽和再生植株根和叶均呈蓝色。转化植株叶PCR检测结果表明外源GUS基因已整合到紫穗槐基因组中。以上结果表明建立了以茎段诱导愈伤组织为转化受体、农杆菌介导的紫穗槐高效遗传转化体系。为了验证其可重复性,又进行了pBI121-GFP基因的转化,T0代再生植株PCR检测整合率达85%,在488nm蓝光源激发下转化株的顶芽产生绿色荧光,说明转入的基因在35S启动子下过量表达。此遗传转化体系可应用于转基因育种。     

用农杆菌介导将WCMV基因导入白三叶的研究

以白三叶Trifolium repens L.吸胀种子的子叶为转化体,用农杆菌介导将外源的白三叶花叶病毒外壳蛋白基因WCMV转入白三叶,经过筛选、分化和再生,得到了具有卡拉霉素抗性的转基因植株.对这些植株进行PCR、Southern 和Northern分析,结果表明,外源目的基因已经整合到白三叶基因组中并且得到了表达.     

反义Waxy基因转化籼稻9311的初步研究

以籼稻品种9311为材料,研究了不同诱导培养基对籼稻9311的诱导率,以及农杆菌浓度、浸染时间和干燥处理时间对抗性愈伤率的影响,进而采用农杆菌介导的共转化方法将含有反义Waxy基因的p13W8质粒和含有潮霉素抗性标记基因的p1300质粒同时转化受体材料.结果表明:籼稻9311成熟胚在含质量浓度为3.0 mg/L的2,4-D的N6基本培养基上具有较高的愈伤组织诱导率,且愈伤的胚性性状良好;愈伤组织在OD600值为0.6的农杆菌菌液中浸染10 min、干燥1.5～2.0 h处理后能够获得较多的抗性愈伤组织;对转化水稻的再生植株进行PCR检测表明,反义Waxy基因已整合进T0代水稻基因组中.     

农杆菌介导的薰衣草愈伤组织遗传转化

选用带有天山雪莲冷诱导蛋白基因的栽体pCAMBIA1304,通过根癌农杆菌EHA105介导,将其转到薰衣草愈伤组织中.经潮霉素筛选,获得抗性愈伤组织,抗性愈伤率为35.3%.经GFP瞬时检测和PCR检测,表明外源基因已经整合到薰衣草基因组中.从而有可能提高薰衣草的抗寒性.     

棉花accD基因植物表达载体的构建与遗传转化的研究

乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)催化脂肪酸合成的第一步,是脂肪酸合成的限速酶.采用PCR方法分别从陆地棉和拟南芥基因组中扩增出ACCase基转移酶β-CT亚基编码基因αccD,ACCase羧基转移酶α-CT亚基编码基因CAC3的定位于叶绿体的转运肽序列.将CAC3基因转运肽序列与αccD基因进行体外重组,构建融合植物表达载体pBI-CAC3tp-αccD.重组质粒通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101.渗透法转化拟南芥,收种子,在含卡那霉素的MS培养基中发芽筛选.用叶盘法转化烟草,经不定芽诱导、生根培养,荻转基因烟草植株.T1代转基因拟南芥和转基因烟草植株经卡那霉素检测、PCR、RT-PCR检测后,初步表明目的基因已在植株中转化成功,并可以正常转录.     

农杆菌介导法遗传转化巴西橡胶树转化条件的研究

用包含GAI基因的EHA105农杆菌,对巴西橡胶树海垦2花药愈伤组织进行侵染,对多项转化条件进行了梯度实验。结果表明选择培养30d的橡胶花药愈伤组织,农杆菌菌液浓度OD600为0．6时侵染3min,20℃共培养2d,Cef浓度为200mg／L进行抑菌培养是比较合理的转化条件。     

玉米Ubiquitin启动子的克隆及功能鉴定

根据Cornejo发表的Ubiquitin启动子的序列,设计引物从玉米自交系18红中克隆出该启动子,测序证明与发表的序列具有98%的同源性,并构建了带有该启动子和GUS基因的植物表达载体,将重组质粒导入农杆菌LBA4404,用农杆菌介导法转入烟草和小麦愈伤中,通过GUS染色反应,证明克隆的启动子在单子叶和双子叶植物中均有活性。