重组菌低温冷冻保藏试验

综述了菌种保藏方法及研究进展。试验对比了不同浓度甘油冷冻保存不同重组大肠杆菌菌株的效果。冷冻保存360 d后测试表明,含质粒菌活细胞数15%甘油组25%甘油组8%甘油组,其中P38活细胞数GFP活细胞数4T-1活细胞数,8%甘油组与15%甘油组的质粒含量大小无差异;而无质粒菌活细胞数25%甘油组15%甘油组8%甘油组,且BL21的活细胞数TOP10的活细胞数。37℃培养菌落时,含质粒菌需20～22 h,无质粒菌只需16～18 h。-20℃冷冻保藏重组大肠杆菌时,宜在菌液OD600值为1.0,甘油终浓度保持15%～25%为佳。     

大肠杆菌感受态细胞保存条件的研究

研究了保存时间、温度和抗冻剂对大肠杆菌感受态细胞保存的影响。结果表明：在4℃-、40℃、-70℃条件下,大肠杆菌感受态细胞转化效率在保存前期随保存时间增加呈上升趋势,转化效率在第1天或第7天达到最大值,此后随保存时间增加而呈下降趋势;在保存前期,保存于4℃的大肠杆菌感受态细胞转化效率高于保存在-70℃、-40℃的大肠杆菌感受态细胞的转化效率,在保存后期低于保存在-70℃、-40℃的大肠杆菌感受态细胞的转化效率;在相同保存温度和保存时间下,保存在甘油的大肠杆菌感受态细胞转化效率高于保存在DMSO的大肠杆菌感受态细胞的转化效率。     

混合微生物对茶树叶片中氯氰菊酯的降解特性研究

[目的]研究混合微生物对茶树叶片中氯氰菊酯的最佳降解条件。[方法]以茶树叶片中的氯氰菊酯为靶标,以对该污染物具有较好降解效果的混合微生物为降解菌源,研究菌体水浴温度、喷洒时间、菌液浓度、作用时间对氯氰菊酯降解率的影响。[结果]菌体水浴温度为30℃时作用效果最好,氯氰菊酯降解率可达78％;菌液喷洒时间为17：00左右时,氯氰菊酯降解率最高;菌液OD600=0．8时,氯氰菊酯降解率可达73％以上;喷洒菌液3、5、7d后,氯氰菊酯的降解率分别为55％、78％和90％。[结论]混合微生物降解氯氰菊酯的最优条件为：菌体水浴温度30qC,喷洒时间下午5：00,菌体浓度DD600=0．8。     

乳糖诱导酸性木聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

[目的]以融合酸性木聚糖酶基因的大肠杆菌（E．coli）B121（DE3）为研究对象,研究以乳糖作为诱导剂时重组目的产物的表达规律。[方法]以重组木聚糖酶比酶活为评价指标,利用单因素试验和k（3。）正交试验考察摇瓶发酵条件下诱导剂浓度、诱导时机、诱导培养时间和诱导培养温度对木聚糖酶表达的影响。[结果]各因素影响程度依次为：诱导时机〉诱导温度〉诱导时间〉诱导剂浓度;最优表达条件为：诱导剂浓度5∥L、诱导时机0．5h、诱导培养时间4．5h、诱导培养温度32℃;在此工艺条件下,重组木聚糖酶比酶活可达49．69U／mg。[结论]乳糖作为诱导剂能够成功诱导酸性木聚糖酶在大肠杆菌中的表达。     

山羊精液冷冻保存技术研究

[目的]探索山羊精液的冷冻方法。[方法]以甘油为冷冻保护剂,采用细管法冷冻保存山羊精液,探讨甘油浓度和添加时间、冻结方法和解冻温度对山羊精液冷冻效果的影响。[结果]在稀释液中添加6%和7%甘油的处理组中,冻后精子活率与复苏率均显著高于添加3%、5%甘油的处理组。配液时添加6%甘油的处理组中冻后精子活率与复苏率均显著低于在4℃平衡后添加的处理组。把平衡的山羊精液分别在离液氮面3 cm处熏蒸9 min和-80℃冰箱中冻结9 min,前者的精子复苏率显著低于后者。在解冻温度分别为40、45和50℃的处理组中精子冻后活率与复苏率显著高于解冻温度为55和60℃的处理组,说明解冻温度以40～50℃为宜。[结论]在山羊精液冷冻保存中,甘油的最佳添加时间为4℃平衡后冻结前。     

不同诱导培养条件对重组绵羊β2-AR第二细胞外环在大肠杆菌中表达的影响

[目的和方法]研究对不同诱导时间、诱导剂IPTG终浓度、培养温度和振荡培养箱转速等4个诱导培养条件对绵羊β_2-肾上腺素能受体(β_2-adrenoceptor,β_2-AR)第二细胞外环重组质粒pET32C-AR/Se在大肠杆菌BL21(DE3)中表达水平的影响进行了研究,以筛选其最佳培养条件.[结果]随着IPTG诱导时间的延长,重组绵羊β2-AR第二细胞外环的相对表达量逐渐增加,在2 h时相对表达量达到最大值,为菌体总蛋白的30.1;.IPTG终浓度在0.01～2 mmol/L时,重组绵羊β_2-AR第二细胞外环的相对表达量水平均在27;～30;;当IPTG终浓度为0.01 mmol/L时,重组绵羊β_2-AR第二细胞外环的相对表达量最高,占菌体总蛋白的30.5 ;.在设置的4个诱导温度中,25℃时重组绵羊β_2-AR第二细胞外环的相对表达量最高,占菌体总蛋白的35.5;.在振荡培养箱不同转速条件下,重组绵羊β_2-AR第二细胞外环的相对表达量在33;～40;波动;在200 r/min时,相对表达水平最高,为细菌总蛋白的40.0;.[结论]绵羊β_2-AR第二细胞外环基因在大肠杆菌中的表达最佳条件为:重组菌株在LB液体培养基中生长至OD_(600) 0.5左右时,加入IPTG至终浓度0.01 mmol/L,于25℃、200 r/min诱导120 min.     

蝴蝶兰·文心兰遗传转化体系的初步研究

[目的]优化蝴蝶兰和文心兰的遗传转化条件。[方法]以培养3周的蝴蝶兰原球茎和文心兰愈伤组织为试材,以大肠杆菌为生长培养基,研究3种农杆菌菌株的侵染力,以及菌液浓度、侵染时间、酚类诱导物(AS)和共培养时间对转化的影响。[结果]以蝴蝶兰原球茎为农杆菌介导的外植体进行遗传转化的优化条件为:预培养时间3d,菌液侵染浓度OD600=0.3,菌液侵染时间10min,pH值5.4,菌液侵染后,与农杆菌共培养5d并添加100μmol/LAS,此条件下的瞬间表达率最高。将蝴蝶兰遗传转化的条件运用于文心兰,得到的转化率较低。3种农杆菌菌株中,EHA105菌株侵染力最强,其次是AGL1,LBA4404最弱。[结论]该研究为进一步研究蝴蝶兰和文心兰的遗传转化体系提供理论依据。     

纳豆固体发酵和液体发酵条件的研究

[目的]确定纳豆固体发酵和液体发酵的最佳条件。[方法]以纳豆芽孢杆菌BN-4菌株为试材,研究纳豆固体发酵中大豆破碎程度、发酵时间和接种量等因素对纳豆芽孢杆菌的生长和酶活的影响,探讨液体发酵中细胞浓度、蛋白质浓度和酶活变化,确定纳豆固体发酵和液体发酵的最佳条件。[结果]纳豆固体发酵最佳条件为：大豆破碎2瓣、接种量8%、发酵时间24 h,纳豆激酶活力最高为976IU/g。在纳豆激酶液体发酵中,发酵最佳时间48 h时,纳豆激酶的蛋白浓度为178 mg/L,纳豆激酶酶活力为174 IU/g;纳豆杆菌活菌浓度、蛋白质浓度和纳豆激酶酶活之间具有很好的相关性,可以通过测定活细胞浓度来监控发酵进程。[结论]为纳豆的生产和纳豆激酶的纯化提供参考。     

1株产耐盐碱高温淀粉酶嗜盐菌的筛选和鉴定

[目的]研究极端嗜盐菌SYM菌株的形态和生理生化特点及其所产胞外淀粉酶性质。[方法]从江苏省盐城市射阳盐场筛选得到1株极端嗜盐菌SYM菌株,对其进行形态、生理生化和分子水平的鉴定,并对其产生的淀粉酶部分酶学性质进行研究。[结果]SYM菌株能在饱和NaCl浓度下生长,菌体细胞壁含有嗜盐古细菌特征性的甘油二醚衍生物,菌体形态为球状,菌落显橙红,经生理生化和16 SrD-NA基因序列同源性分析鉴定为嗜盐古细菌嗜盐深红菌属。SYM菌株淀粉酶最佳反应条件为1.15 mol/L NaCl、pH值7.0和温度70℃。NaCl浓度为2.65 mol/L时,酶活可以保持最高酶活的61%;80℃时,酶活可保持最高酶活的69%;pH值13.0时,酶活可保持最高酶活的76%。[结论]SYM菌株产生的淀粉酶是一种能耐受高盐高碱高温的极端酶。     

β-甘露聚糖酶产生菌的分离·鉴定及酶学特性研究

[目的]筛选产β甘露聚糖酶的优良菌株,并对其进行分类鉴定和酶学特性的测定。[方法]运用单因子分析对β甘露聚糖酶的酶学特性进行研究。[结果]筛选到的产β甘露聚糖酶鉴定为枯草芽孢杆菌（Baccillus subtilis）。所产酶的最适反应温度和pH值分别为65℃和5．5。在45—70℃内酶活稳定,65℃保温15min,残留酶活仍有70％左右;在pH值4．5—6．5内酶活相对稳定,pH值5．0条件下保存3h,残留酶活仍有75％以上。低浓度的Co^2＋、Mg^2＋等金属离子对该酶有强烈的激活作用,提高浓度后则对酶活有抑制作用。[结论]该酶具有良好的酶学特性,有应用于大规模生产的潜质。     

不同温度下蓝舌病病毒的毒价变化研究

[目的]为蓝舌病病毒的长期保存奠定基础。[方法]在70、-20、4和20℃下保存蓝舌病病毒1个月后,测定其毒价变化,研究不同温度对蓝舌病病毒毒价的影响。[结果]在室温和4℃下保存1个月后蓝舌病病毒毒价保持不变。在-70℃下保存1个月后蓝舌病病毒毒价从原来的5.5降至4.2。在-20℃下保存1个月蓝舌病病毒毒价变化最大,从原来的5.5降至2.8。[结论]长期保存时,应将蓝舌病病毒在-20℃下保存。     

薄壳山核桃‘马汉’雄蕊发育特性及花粉储藏活力

为解决薄壳山核桃Carya illinoensis花期花粉的采集和有效保存等问题,系统观测雄蕊开花习性,采用荧光染色反应（FCR）法研究了不同散粉期花粉生活力差异,以及不同储藏条件（室温密封、室温密封干燥;4℃密封、4℃密封干燥;-70℃密封、-70℃密封干燥）和储藏时间对花粉活力的影响.结果表明：①4月26日薄壳山核桃雄蕊花萼开裂,5月6日花药由绿变黄,5月7-9日雄蕊进入散粉期,5月8日散粉量最大,占花粉总量的75％,至5月10日花粉基本散尽,花药变黑、小花开始脱落;②散粉期花粉生活力大小依次为即将散粉期（花药由绿变黄）＞散粉初期＞散粉盛期＞散粉末期,花粉耐储藏性亦是即将散粉期最优,即将散粉期＞散粉初期＞散粉盛期＞散粉末期.③储藏条件对花粉活力的保持有显著影响,利于花粉生活力保持的储藏条件依次为-70℃密封干燥＞-70℃密封＞4℃密封干燥＞4℃密封＞室温密封干燥＞室温密封;在任一储藏条件下,花粉活力均随储藏时间而下降,干燥与不干燥差异不显著.室温下花粉活力下降最快,50 d后花粉已经完全丧失活力;4℃下花粉活力次之,120d后花粉已经完全丧失活力;-70℃超低温条件下保存效果最好,与常温、低温储藏差异极显著,储藏360 d花粉还保持43.55％的活力.     

仔猪大肠埃希氏菌、C型产气荚膜梭菌的灭活及脱毒方法研究

[目的]研究仔猪大肠埃希氏菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的质量及产品的安全性。[方法]对大肠埃希氏菌和C型产气荚膜梭菌浓缩菌液,用不同浓度甲醛溶液经不同灭活时间、灭活温度进行了灭活和脱毒试验。[结果]大肠埃希氏菌培养物在37～38℃条件下用0.4%的甲醛溶液灭活48h,可以使细菌全部灭活;C型产气荚膜梭菌培养物在37～38℃,采用0.5%～0.8%的甲醛溶液进行灭活和脱毒7～14d,或者采用2次灭活和脱毒方法,7d可以达到完全灭活和脱毒。[结论]在37～38℃条件下,用0.4%的甲醛溶液对大肠埃希氏菌培养物灭活和采用0.5%～0.8%的甲醛溶液对C型产气荚膜梭菌进行灭活和脱毒,可以达到理想效果。     

一种简捷有效的大肠杆菌感受态细胞制备方法

[目的]探索建立简捷快速有效的大肠杆菌感受态细胞制备方法。[方法]在已有的TSS法基础上进行了进一步的改进,建立了一个只需一步室温离心便能够获得与常规方法效价相近,能够长期保存的大肠杆菌感受态细胞的制备方法。[结果]新方法制备的感受态细胞每微克转化菌落数达105~106个,可以满足在质粒中进行的常规克隆需要。不同冻存时间对新方法制备的感受态细胞转化效率无显著影响。新方法制备的感受态细胞可以立即使用也可以于-80℃下长期保存至少9个月不会影响其转化效价。这也与常规CaC l2法制备的感受态细胞性能相当。[结论]该方法为一次大量制备并长期保存使用感受态细胞奠定了基础。     

缢蛏无水保活技术研究

[目的]研究温度、湿度和氧气等因素对缢蛏无水保活效果的影响。[方法]分别将缢蛏置于6种温度条件下（-1.5～0、5±1、10±1、18±1、24±1℃、冰藏（淡水冰、海水冰））进行保藏,每组分别加湿、充氧,研究不同试验组缢蛏的存活情况。[结果]缢蛏在冰温条件下（-1.5～0℃）的保活效果最好,保存10d时存活率仍可达100%,随着温度的升高,缢蛏存活率逐渐降低;加湿、充氧可提高缢蛏的存活率。[结论]该研究促进了缢蛏保活技术的进一步发展。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因在大肠杆菌中表达条件优化

[目的]为提高植原体膜蛋白Imp基因在E.coli BL21(DE3)中的表达量,优化Imp基因的原核表达条件。[方法]通过设计正交试验,考察不同的培养条件对工程菌E.coli BL21(DE3)-pET-28a(+)-Imp的影响。在获得最佳培养条件的基础上考察不同诱导条件对Imp蛋白表达量的影响。利用SDS-PAGE和Gene Tools凝胶分析软件分析融合蛋白Imp的表达量。[结果]表达条件优化结果表明,最佳培养条件为:温度37℃,pH 7.0,装液量20%,振荡速度200 r/min;最佳诱导条件为:温度37℃,起始OD600≈1.5,IPTG终浓度0.1mmol/L,诱导培养时间6 h。[结论]在最佳条件下Imp表达量达70.98 mg/L,确定了Imp融合蛋白在大肠杆菌的优化表达条件。     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因在大肠杆菌中表达条件优化(英文)

[目的]为了提高植原体膜蛋白Imp基因在E.coliBL21(DE3)中的表达量,优化Imp基因的原核表达条件。[方法]通过设计正交试验,考察不同的培养条件对工程菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-Imp的影响。在获得最佳培养条件的基础上考察不同诱导条件对Imp蛋白表达量的影响。利用SDS-PAGE和GeneTools凝胶分析软件分析融合蛋白Imp的表达量。[结果]表达条件优化结果表明,最佳培养条件为:温度37℃,pH7.0,装液量20%,振荡速度200r/min。最佳诱导条件为:温度37℃,起始OD600≈1.5,IPTG终浓度0.1mmol/L,诱导培养时间6h。[结论]在最佳条件下Imp表达量达到70.98mg/L,确定了Imp融合蛋白在大肠杆菌的优化表达条件。     

丁香属12种植物花粉保存方法研究

丁香属植物是重要的园林观赏植物。 试验测定了丁香属12种植物鲜花粉在室温(25℃)、冰箱(4℃)、液氮罐(－196℃)中保存不同时间的花粉活力。研究结果表明,在25℃保存条件下,11种花粉可保存至7 d,其中有5种保存30 d后仍有活力;在4℃条件下,12种丁香花粉均可保存至30 d,其中红丁香和紫丁香保存180 d后仍有生活力,但萌发率显著低于新鲜花粉萌发率,分别为219%和15%;在－196℃条件下,有11种花粉能够保存至180 d,且基本与新鲜花粉萌发率无显著差异。因此,超低温保存是较长期保存丁香属植物花粉活力的有效途径。     

仔猪大肠杆菌·C型产气荚膜梭菌菌液的培养工艺

[目的]研究仔猪大肠杆菌、C型产气荚膜梭菌菌液的培养工艺。[方法]分别试验不同的培养时间、培养温度和接种剂量对大肠杆菌纤毛表达量和C型产气荚膜梭菌产生毒素的影响。[结果]大肠杆菌在接种剂量为3%～5%,在36～37℃条件下培养7 h,可产生较高含量的纤毛抗原;当接种剂量为1%～2%,C型产气荚膜梭菌C59-2菌株在35℃条件下培养16～20 h,可产生大量致死性毒素。[结论]该研究为研制具有较好效果的仔猪红痢、黄痢预防疫苗提供了依据。     

保存温度与时间对动物组织DNA提取质量的影响

［目的］研究不同保存温度、不同保存时间对蟹肉总DNA提取质量的影响，为同类研究提供借鉴。［方法］将样品在4、-20和-40℃下分别保存4、8和15 d，提取螯足内肌肉总DNA，测定总DNA的紫外吸收值，并设计引物扩增其mtDNA ND6基因，采用琼脂糖凝胶电泳分别对提取的总DNA及PCR结果进行检测。［结果］由鲜活蟹组织提取的DNA A260与A280的比值因蛋白污染而较低；15 d内4 ℃与-40 ℃条件下保存的DNA提取率和条带检出率均无明显差异，而-20 ℃下的保存效果受时间影响明显。各处理组合总DNA的 A260与A280比值在1.79～2.00；利用上述DNA作模板，扩增其特定基因mtDNA ND6均可获得预期长度的PCR条带。［结论］短期保存组织宜选择4 ℃，若需较长时间保存时则宜选择-40 ℃以下的低温。