仔猪大肠杆菌·C型产气荚膜梭菌菌液的培养工艺

[目的]研究仔猪大肠杆菌、C型产气荚膜梭菌菌液的培养工艺。[方法]分别试验不同的培养时间、培养温度和接种剂量对大肠杆菌纤毛表达量和C型产气荚膜梭菌产生毒素的影响。[结果]大肠杆菌在接种剂量为3%～5%,在36～37℃条件下培养7 h,可产生较高含量的纤毛抗原;当接种剂量为1%～2%,C型产气荚膜梭菌C59-2菌株在35℃条件下培养16～20 h,可产生大量致死性毒素。[结论]该研究为研制具有较好效果的仔猪红痢、黄痢预防疫苗提供了依据。     

仔猪大肠埃希氏菌病、C型产气荚膜梭菌病二联灭活疫苗的效力和安全试验

将带有K88、K99和987P纤毛抗原的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)菌株(C83549、C83644和C83710)和免疫原性良好的C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C)菌株(C59-2、C59-37和C59-38)第10代基础种子制备的原液进行浓缩、甲醛溶液灭活和脱毒后,按抗原含量,加氢氧化铝胶制成3批二联灭活疫苗。经过对免疫怀孕母猪所产仔猪的攻毒测定,得到疫苗最小的免疫剂量为每头2mL,确定使用剂量为每头4mL。疫苗的免疫攻毒试验结果表明,疫苗在怀孕母猪中采用颈部肌肉注射进行免疫,二次免疫才能使仔猪通过吮吸初乳获得80%以上的被动免疫保护能力,与单苗具有相似的免疫保护力;单剂量、单剂量重复和超剂量的安全性试验结果显示,3批二联灭活疫苗不会引起母猪的全身不良反应和明显的局部反应,无流产,胎儿发育完全正常。     

酸化剂及其衍生物与植物精油复合对常见致病菌体外抑菌效果研究

为了探讨酸化剂及其衍生物(辛酸、单辛酸甘油酯、月桂酸、单月桂酸甘油酯、丁酸和苯甲酸)与植物精油(主要成分有香芹酚、百里香酚及肉桂醛等)复合对常见致病菌的体外抑菌效果,试验采用二倍稀释法将酸化剂及其衍生物与植物精油复合,并对4种常见致病菌的标准菌进行抑菌试验,测定最小抑菌浓度(MIC)。结果显示:植物精油与辛酸质量比为1.5时对致病性大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌的抑菌效果最好;植物精油与单辛酸甘油酯质量比为1.5时对金黄色葡萄球菌、致病性大肠埃希氏菌的抑菌效果最好;植物精油与月桂酸质量比为1.3时对致病性大肠埃希氏菌、产气荚膜梭菌的抑菌效果最好。说明酸化剂及其衍生物与植物精油复合能起到更好的抑菌效果,存在协同作用。     

A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51的原核表达及活性检测

【目的】原核表达A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51并研究其对A型产气荚膜梭菌Clostridium perfringens的体外抗菌活性。【方法】合成噬菌体裂解酶Cp51基因,并构建了pET-32a-Cp51原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),经终浓度为0.5 mmol·L~(-1)的IPTG诱导以及镍柱纯化后,获得了可溶性的Cp51重组蛋白;用比浊法检测Cp51重组蛋白的杀菌活性。【结果】噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白能够有效降低7株A型产气荚膜梭菌的浊度,裂解酶质量浓度在5μg·m L~(-1)以上、作用30 min对A型产气荚膜梭菌的杀菌率可达到99.99%以上,而对其他种类细菌无杀菌效果。【结论】A型产气荚膜梭菌噬菌体裂解酶Cp51重组蛋白对A型产气荚膜梭菌有较强的体外杀菌活性和特异性,研究结果为后续裂解酶Cp51的临床应用奠定基础。     

牛乳中产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测法

建立牛奶乳样中产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测方法。根据产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A基因序列分别设计了2对特异性引物,分别从产气荚膜梭菌和金黄色葡萄球菌参考菌株的肉汤培养物中提取DNA,进行PCR扩增,并进行特异性、敏感性试验和临床样品检测。经过PCR反应条件的优化,建立了产气荚膜梭菌α毒素和金黄色葡萄球菌肠毒素A的双重PCR检测方法,均扩出了相应的目的条带。该方法将参考菌株的肉汤培养物稀释1 000倍后仍可扩出目的条带,且对大肠埃希菌等的PCR检测为阴性。对临床采集的50份乳品样本分别用细菌分离培养法和PCR方法进行检测,两种方法的符合率达90%以上,但双重PCR检测方法具有特异性强和敏感性高的特点。     

不同诱导剂及培养条件对C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因表达的影响

对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)β2毒素基因的表达载体p ETXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定,并用SDS-PAGE检测了不同培养条件下,该毒素基因在埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)工程菌株中的表达情况。结果表明,p ETXB2重组质粒中的β2毒素基因位于p ET-28c(+)表达盒中,且阅读框架和基因序列正确。以IPTG为诱导剂时,重组菌株BL21(DE3)(p ETXB2)的最佳培养条件为37℃,p H7.0,IPTG终浓度0.8 mmol·L-1,诱导4 h;以乳糖为诱导剂时,其最佳培养条件为37℃,p H 7.0,乳糖终浓度0.5 g·L-1,诱导5 h。     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列的测定与分析

[目的]研究C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列的遗传变异特点。[方法]设计产气荚膜梭菌α毒素基因特异性引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后测定核苷酸序列并与NCBI登录的参考序列通过DNAStar软件进行同源比对。[结果]序列分析表明,所测菌株α毒素基因核苷酸组成中腺苷酸含量较高,胞苷酸含量较低。所测菌株与13、C57-1、CER 89L43、S01、S08、T01以及T16菌株的核苷酸序列同源性分别为98.7%、98.7%、98.6%、98.8%、98.7%、97.0%、98.6%,推导的氨基酸序列同源性分别为98.6%、98.6%、98.9%、98.9%、98.9%、98.6%、98.6%。[结论]所测C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考序列同源性均较高。     

江苏地区临床健康肉羊的产气荚膜梭菌感染分析

为揭示临床健康肉羊的产气荚膜梭菌感染概况,于2018年4-6月选择江苏地区肉羊养殖场30个,采集3～5月龄肉羊肛拭子样品892份.所有样品接种至梭菌增菌液,于厌氧条件下增菌培养后,以PCR进行产气荚膜梭菌的检测,并对部分检测为产气荚膜梭菌阳性的样品进行细菌分离.结果表明:175份(19.62％)肛拭子样品为产气荚膜梭菌阳性,提示临床健康肉羊的消化道可携带产气荚膜梭菌.数据分析表明,3、4、5月龄羊差异不显著,免疫羊与未免疫羊差异不显著.通过对分离的68株产气荚膜梭菌进行α、β、ε和ι毒素基因检测,确定了其中43株(63.24％)为A型产气荚膜梭菌,25株(36.76％)为D型产气荚膜梭菌,提示A、D型是江苏地区肉羊感染的主要产气荚膜梭菌类型.     

鸡屎藤与鱼鳅串和抗生素联合抑菌试验研究

[目的]考察鸡屎藤、鱼鳅串水提物的体外抗菌活性及其与常用抗生素的联合抑菌效果。[方法]以金黄色葡萄球菌CMCC29178和大肠埃希氏菌ATCC25922标准菌株为检测菌,采用微量肉汤稀释法测定其最小抑制浓度(MIC)和联合抑菌指数(FIC)。[结果]鸡屎藤、鱼鳅串水提物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌都具有一定的抑菌效果,与常用抗菌药物合用表现出不同程度的协同或相加效应。[结论]水提法可广泛用于对具有抗菌活性的植物药材的初步筛选。     

秋季严防仔猪“三痢”

仔猪在秋季容易患黄、白、红三痢,分别是由溶血性大肠肝菌、致病性大肠肝菌以及C型产气荚膜菌引起的,均会引起仔猪的严重腹泻,并会导致病猪的高死亡率。一、仔猪红痢1.症状红痢是由C型魏氏梭菌引起的急性传染病,又称仔猪传染性     

新生仔猪红黄痢二联灭活疫苗的研制与应用Ⅰ——C型魏氏梭菌生物学特性研究

[目的]研究C型魏氏梭菌C59-2菌株的生物学特性。[方法]将该菌株接种于适宜培养基,进行毒素致死性试验和免疫原性试验。[结果]C型魏氏梭菌C59-2菌株在厌气肉肝汤和血液琼脂平板上生长良好,生化特性与魏氏梭菌一致;该菌在厌气肉肝汤中培养物的上清液0.0001ml静脉注射可致小鼠100%死亡,0.2ml静脉注射可使家兔全部死亡;免疫原性试验表明,该菌株制备成疫苗后免疫家兔,攻毒保护率可达75%。[结论]C型魏氏梭菌C59-2毒株适合于疫苗生产。     

C型魏氏梭菌外毒素产生的主要影响因素研究

从不同菌株、不同培养基、不同培养温度和不同培养时间对C型魏氏梭菌在培养过程中毒素产生的影响及不同菌株的交叉保护力方面进行了研究.结果表明,在3株C型魏氏梭菌中.C_(59-2)株在相同培养条件下产生的毒素最高,肉肝胃酶消化汤更有助于该菌株产生高滴度的致死性毒素,并且在35℃培养16-20 h后可产生较高滴度的致死性毒素,1μL魏氏梭菌培养物上清液即可致8/8小鼠死亡,不同菌株之间具有较好的交叉免疫力,这些结果为研制C型魏氏梭菌高效疫苗打下了基础.     

益生菌酪酸菌CB-7的生物学特性研究

[目的]考察酪酸菌CB-7的生物学特性。[方法]对菌株的耐酸、耐胆盐、耐高温性能及其对动物肠道致病菌大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌的抑制作用,对肠道有益菌嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和粪链球菌生长的促进作用进行了研究。[结果]酪酸菌CB-7在pH值为3.0的培养基中37℃培养4 h后,存活率达90.0%;在含0.3%牛胆盐的培养基中37℃培养4 h后,存活率达到91.8%;经90℃水浴处理10 min、100℃水浴处理5 min后,存活率均在90.0%以上;对大肠杆菌、志贺氏菌、沙门氏菌均有显著的抑制作用,其发酵提取物可显著促进嗜酸乳杆菌、双歧杆菌和粪链球菌的生长。[结论]酪酸菌CB-7具有较强的耐酸、耐胆盐和耐高温性能,对肠道致病菌具有较强的抑制作用,且可显著促进肠道有益菌的生长,因此是一株性能优良的饲用菌株。     

乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白C端片段的克隆及原核表达

[目的]为进一步研制检测乙脑抗体试剂盒奠定了基础。[方法]以本实验室已构建的重组质粒pET-E(E为乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白)为模板,利用PCR扩增乙型脑炎病毒E蛋白基因3′端部分片段,克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE电泳分析表达产物。[结果]所表达的融合蛋白分子量约为38KD,表达产物以水溶形式存在,37℃,诱导4 h的诱导培养条件最佳,表达量约占茵体总蛋白的20?。表达产物经Ni-NTA亲和层析法纯化,获得了纯度较高的目的蛋白。ELISA检测表明,表达的蛋白能与猪乙脑病毒抗体血清发生特异性反应,具有很好的抗原性。[结论]基因工程表达的JEV E蛋白有望成为重要的实验室诊断抗原。     

牛粪堆肥中添加抑菌剂对大肠杆菌杀灭效果的研究

[目的]研究牛粪堆肥中添加抑菌剂（石灰氮）对大肠杆菌的杀灭效果,为牛粪的无害化处理提供理论依据。[方法]试验组添加2.0%的抑菌剂,对照组不加抑菌剂,分别在不同的温度（20、303、75、06、0℃）条件下进行堆肥试验,确定适宜堆肥温度;并在30℃条件下添加不同剂量（0、2.0%、2.5%、3.0%）的抑菌剂,确定抑菌剂的最适添加量。[结果]305、0、60℃是杀灭大肠杆菌较理想的温度;在30℃条件下,添加2.5%和3.0%的抑菌剂可在堆肥48 h时检测不到大肠杆菌,说明为达到杀灭牛粪中大肠杆菌的目的至少要在牛粪堆肥中添加2.5%的抑菌剂。[结论]在堆肥（特别是冬季堆肥）中添加石灰氮对提高牛粪中大肠杆菌杀灭效果具有重要意义。     

不同处理方法对马蔺种子萌发的影响

[目的]提高马蔺种子的萌发率。[方法]采用酸蚀处理、碱蚀处理、热水处理与种子切胚等处理马蔺种子的种皮,以5℃中存放1个月的种子为对照,放置于25℃的恒温箱中,测定培养20 d的发芽率。[结果]98%的浓硫酸处理可使马蔺种子表皮完全氧化成炭,保湿催芽20 d后,种子萌发率达到36%~42%。40%的NaOH处理也同样可使马蔺种子表皮氧化成炭,种子发芽率达到48%~52%。热水处理对马蔺种子萌发的效果不明显,与对照组相比,萌发率只提高了2%~4%。种子切胚处理对马蔺种子萌发的影响与对照组相比很明显,可使种子发芽率达到24%~38%。[结论]98%的浓硫酸和40%的NaOH处理可以显著提高马蔺种子的萌发率。     

山苦荬标准提取物的制备与质量控制方法

[目的]制定山苦荬标准提取物的制备工艺并建立其质量控制方法。[方法]采用正交试验设计建立山苦荬标准提取物的制备工艺;采用紫外分光光度法、TCL、微生物法建立山苦荬提取物的质量控制指标。[结果]制备工艺为原料药材的处方量用20倍量水连续提取3次,100℃,每次1 h,减压浓缩温度与干燥温度均为65℃;山苦荬提取物在30~70μg/m L的浓度与吸光度线性良好,回收率为98.4%,RSD为0.64%。标准提取物溶液在198与294 nm紫外波长最大吸光度比值为4.1,干燥失重为0.4%,灰分为0.8%,酸碱度为5.2,细菌菌落总数为12个/g,霉菌总数无,大肠杆菌无,沙门氏菌无。[结论]优选溶剂水及相应的温度提取和控制是山苦荬标准提取物制备的安全有效方法。建立的检测项可以用于山苦荬标准提取物的指标控制。     

不同保存方法对重组大肠杆菌菌株活性的影响

[目的]探讨不同重组大肠杆菌菌株保存的方法,找出其保存的最适条件。[方法]以携带质粒pcDNA3的大肠杆菌DI-lSct为研究对象,分析了4oC冷藏和一70℃冷冻保存对菌株活性的影响。[结果]4℃条件下,高稀释度的菌液中活细胞教随着时间的延长而逐渐上升,到第7天时达到最高峰,随后呈现逐渐下降的趋势-70℃条件下,菌液OD600值为0．8,甘油终浓度为8％的处理组,在各保存时间段的活细胞数均显著高于其他组.[结论]4℃短期保存重组菌株时,菌液最佳存放时间为7d左右;-70℃长期保存时,宜采用对数生长期的细菌,且保持甘油工作浓度8％为宜。     

SBR法处理亚胺法造纸废水研究

[目的]为亚胺法造纸废水的处理提供科学依据。[方法]通过自行培养活性污泥,结合试验条件,确定控制工艺参数,研究SBR法(间歇式活性污泥法)处理亚胺法造纸废水的效果。[结果]在温度20~25℃,污泥龄18~23 d,进水0.5 h,曝气8 h,沉降1 h,排水0.5 h,闲置8 h,1个周期共18 h前提下,经8 h限制性曝气,SBR法对亚胺法造纸废水中CODcr的去除率达80%~90%,色度降低了1000度左右,pH值更趋向中性,SVI值在60~100 L/mg之间。与其他处理方法(延时曝气、混凝法)相比,SBR法对废水中CODcr、TKN、氨氮和总磷的去除率均在80%左右,对COD的去除率也较好。[结论]SBR法是一种较理想的废水处理工艺。