核酸适配体生物传感技术在沙门氏菌定量检测中的应用

沙门氏菌是一种重要的人畜共患病病原菌,在世界各地的食物中毒中,该菌引起的中毒事件数量位居前列。目前,基于抗原/抗体、核酸适配体、细胞等传感元件的生物传感技术已被广泛应用于沙门氏菌的定量检测中。其中,核酸适配体是一种短的核酸序列,具有特异性强、亲和力高、合成速度快、重现性好、修饰方便等优点。核酸适配体的这些优点可能会取代抗体,成为分析领域中的潜在识别探针。因此,核酸适配体生物传感技术在沙门氏菌定量检测中具有独特优势。主要综述了核酸适配体生物传感技术在沙门氏菌定量检测中的应用研究。首先对沙门氏菌及其常用检测方法进行简单介绍,其次介绍沙门氏菌核酸适配体的SELEX筛选方法,重点对基于核酸适配体的比色、荧光、表面增强拉曼散射(SERS)、电化学等生物传感技术在沙门氏菌定量检测中的应用进行详细论述,最后对核酸适配体生物传感技术应用于沙门氏菌定量检测的发展前景进行展望。     

适配体制备技术及其在农产品化学污染物检测中的应用

通过指数富集配体系统进化技术筛选的核酸适配体,依靠其特定的三维结构可以和包括小分子、蛋白、核酸,甚至细胞、组织等在内的各种靶分子高亲和力高特异性结合。与传统识别分子抗体相比,具有制备简单、性能稳定、便于标记等优点,成为分析化学领域一种新的分析工具。本文综述了适配体制备技术以及适配体在农产品中农兽药残留、违禁添加物、生物毒素检测方面的应用研究进展。     

基于适配体的金黄色葡萄球菌流式细胞术检测方法

本研究以金黄色葡萄球菌为对象,旨在建立一种基于荧光标记核酸适配体的流式细胞术检测方法。通过优化流式细胞仪检测参数、适配体用量及折叠方式,观察适配体针对不同方式处理细菌的识别效果建立检测方法,并对该方法的特异性和灵敏性进行了验证。结果显示:不经高温变性处理的适配体检测结果最佳,适配体最佳使用浓度为250 nmol/L,对活菌识别效果最强。本实验建立的基于适配体的流式细胞术检测方法特异性强、过程简单,40 min于混合细菌中特异性检测、鉴别靶细菌,为金黄色葡萄球菌的检测提供了一种有效方法。     

特异性识别草鱼呼肠孤病毒感染细胞的ssDNA核酸适配体筛选与鉴定

[目的]筛选出能高特异性和高亲和性识别草鱼呼肠孤病毒(GCRV)感染细胞的核酸适配体,为研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的GCRV检测技术打下基础,同时为提高水产疫病检测及防控效率提供技术支持.[方法]以草鱼呼肠孤病毒I型(GCRVI)感染的宿主细胞为靶标,采用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)进行特异性核酸适配体筛选,并通过激光共聚焦显微技术和流式细胞术对筛选获得的核酸适配体性质进行系统分析.[结果]筛选获得的核酸适配体GVIK1能特异性识别并结合在GCRVI感染的草鱼肾脏组织细胞系(CIK)表面,但不识别正常的CIK细胞及石斑鱼神经坏死病毒广西株(GNNV)感染的石斑鱼脾细胞(GS);其二级结构具有独特复杂的茎环结构,吉布斯自由能(△G)为-32.93 kJ/mol,无细胞毒性.核酸适配体GVIK1结合靶标细胞的亲和常数(Kd)为148.22 nmol/L,即核酸适配体GVIK1与靶标细胞间的亲和力极强,达纳摩尔级别.核酸适配体GVIK1在靶标细胞表面的结合位点是细胞膜蛋白或膜蛋白相关结构,其在靶标细胞表面的结合位点出现在病毒感染后的第5h.临床试验结果表明,筛选获得的核酸适配体GVIK1可作为高特异性分子探针用于诊断GCRV感染所致的草鱼出血病.[结论]基于SELEX技术筛选获得能特异性识别GCRVI感染宿主细胞的核酸适配体GVIK1,可作为核酸分子探针用于研发操作便捷、成本低、耗时短、准确度高的GCRV快速检测技术,实现实时监测和有效防控.     

基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A方法与酶联免疫法的对比研究

[目的]比较基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A(OTA)方法与酶联免疫法。[方法]建立核酸适配体检测OTA标准曲线,进行样品加标回收率试验,并与酶联免疫法进行比较。[结果]核酸适配体法检测OTA在0.05～10.00 ng/mL具有较好的线性,饲料样品中添加OTA的回收率为92.0%～93.5%,与酶联免疫法相比,2种方法之间具有较好的一致性。[结论]该研究建立的基于核酸适配体检测OTA方法灵敏度高、准确度好,为研究饲料中OTA的快速检测方法奠定基础。     

基于核酸适配体-荧光染料EvaGreenTM快速检测ATP的研究

目的利用荧光嵌入染料EvaGreenTM在单双链DNA溶液中不同的荧光性质构建基于核酸适配体的ATP检测体系,建立一种简单、高效的检测ATP的新方法。方法利用ATP核酸适配体双链DNA(dsDNA)和核酸绿色荧光染料Eva GreenTM嵌合作用,实现了对ATP的检测。考察了ATP的孵育温度、pH、浓度等因素对荧光强度的影响,并对该方法的特异性进行了验证。结果反应体系在12℃,pH 7.5条件下具有最佳实验效果,在最优条件下,最低能检测10-6mol/L的ATP,并具有较高的特异性。结论本研究为ATP的快速检测提供了一种易于操作、低成本的新方法。 更多还原     

利用PicoGreen作为检测探针建立基于核酸适配体识别的玉米赤霉烯酮快速检测方法

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种能对动物和人类产生毒性的真菌毒素。研发灵敏而准确的玉米赤霉烯酮快速检测技术对于保障食品动物安全至关重要。该研究以PicoGree荧光染料为检测探针,利用其仅与dsDNA结合后才发出荧光的特性(激发波长:480nm,发射波长:520nm),当ZEN不存在时,适配体能够与其互补链结合而形成dsDNA,导致荧光强度增强;当ZEN存在时,适配体与ZEN结合而不能形成dsDNA,导致荧光强度减弱。建立了一种基于核酸适配体识别的ZEN快速检测方法。灵敏度试验表明:该方法的最低检测限为0.1μg/L(0.1ppb),线性范围为0.1~1μg/L(0.1~1ppb)。检测时间可以控制在40min内。特异性试验结果表明:ZEN核酸适配体与桔青毒素(CTN)、赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B_1(AFB_1)和伏马毒素B_1(FB_1)等真菌毒素不会出现交叉反应。本研究与传统的基于抗体识别的ELISA快检方法进行比较,Kappa值为0.805,表明二者一致性相当。由于核酸适配体价廉,检测时间短,因此本文开发的ZEN检测方法较常用的ELISA方法更具有推广和应用价值。     

牛冠状病毒N蛋白的原核表达及核酸适配体筛选

[目的]对牛冠状病毒N蛋白进行原核表达,利用指数富集的配基系统进化技术筛选N蛋白的核酸适配体,为该病诊断方法的建立奠定基础.[方法]根据牛冠状病毒基因序列,设计N蛋白编码基因特异性引物,扩增目的基因并通过酶切、连接、转化构建原核表达载体pET-28a-N,优化N蛋白表达条件,镍柱纯化获得高纯度高浓度的N蛋白.利用微孔板法,经过包被、封闭、加文库、洗脱、提取、PCR、胶回收和反筛等步骤从原始核酸适配体文库中筛选出N蛋白特异性适配体,连接T载体转入DH5a感受态细胞后,经菌落PCR鉴定和测序获得与N蛋白特异性结合的适配体序列,测定其结合常数,并利用在线软件预测其二级结构.[结果]成功表达出约55 kD的重组蛋白;经微孔板法筛选出67条适配体序列,其中N-12、N-33和N-45出现多次重复,经测定3条核酸适配体均具有环状、发卡结构,利于与目标蛋白稳定结合.[结论]筛选的3条核酸适配体有望用于牛冠状病毒病早期诊断用酶联适配体方法的建立.     

基于适配体的光学和电化学法对食源性致病菌检测的研究进展

由于食品的多样性和食品基质的复杂性,食品安全问题已成为全社会共同关注的热点问题,其中微生物引起的食源性疾病居全球食品安全问题之首。食源性致病菌的检测是食源性疾病预防与控制的关键环节。平板计数法被评为微生物检测的金标准,但在致病菌检测过程中信号的放大需要通过单个细胞生长成菌落来实现,因此检测周期较长（3—7 d）。此外,现有的准确检测致病菌的技术有聚合酶链式反应（PCR）和酶联免疫吸附法（ELISA）等,但由于预处理时间长、操作复杂、检测结果存在假阳性等问题,不适合对致病菌进行现场快速有效的检测。核酸适配体是利用指数富集的配体系统进化技术（SELEX）从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段,具有良好的特异性、稳定性、易于修饰和亲和力高等特点,在毒素、抗生素、重金属和致病菌等其他小分子的检测中有很大的潜力。目前,国内外学者已开发了各种基于适配体的检测方法。本文综述了食品中常见的食源性致病菌及其传统的检测方法和近十年来用于致病菌检测的光学和电化学适配传感器,涵盖每种方法的检测策略、检测时间、检测范围和检测限等信息,也提出了适配体传感器在食品安全检测中存在的主要问题,并对其未来研究的发展趋势进行了展望,这些将为今后的研究工作提供一定的基础。     

硅包银纳米颗粒的制备及其光散射法检测腺苷

将腺苷的核酸适配体设计成两段DNA链,一段修饰在硅包银纳米颗粒上,另一段修饰在磁性颗粒上.利用腺苷与其核酸适配体的特异性结合,通过检测磁性分离后上清液中硅包银纳米颗粒的光散射信号变化,实现了腺苷检测.方法的线性范围为8.0×10~(-6)~5.0×10~(-4)mol/L,线性相关系数(r)为0.981 8,其他的核苷不干扰测定.     

In vitro Selection of DNA Aptamers and Fluorescence-Based Recognition for Rapid Detection Listeria monocytogenes

Aptamers are specific nucleic acid sequences that can bind to a wide range of nucleic acid and non-nucleic acid targets with high affinity and specificity. Nucleic acid aptamers are selected in vitro from single stranded DNA or RNA ligands containing random sequences of up to a few hundred nucleotides. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX) was used to select and PCR amplify DNA sequences (aptamers) capable of binding to and detecting Listeria monocytogenes, one of the major food-borne pathogens. A simplified affinity separation approach was employed, in which L. monocytogenes in exponential (log) phase of growth was used as the separation target. A fluorescently-labeled aptamer assay scheme was devised for detecting L. monocytogenes. This report described a novel approach to the detection of L. monocytogenes using DNA aptamers. Aptamers were developed by nine rounds of SELEX. A high affinity aptamer was successfully selected from the initial random DNA pool, and its secondary structure was also investigated. One of aptamers named e01 with the highest affinity was further tested in aptamer-peroxidase and aptamer-fluorescence staining protocols. This study has proved the principle that the whole-cell SELEX could be a promising technique to design aptamer-based molecular probes for dectection of pathogenic microorganisms without tedious isolation and purification of complex markers or targets.     

植原体病害的检测方法研究进展

综述植原体病害的主要检测方法,即电子显微镜检测法、组织化学技术检测法、血清学检测法、核酸杂交检测法、PCR检测法。     

环介导恒温扩增技术在植物病原物检测中的应用

环介导恒温扩增反应（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一种新型的核酸扩增方法,具有特异性强、灵敏度高、操作简单且适合于多种检测环境等优点,自开发以来,其作为一种分子生物学检测技术,被广泛应用于许多领域。简要介绍了该技术的原理,综述了其在植物病原物检测方面的应用,讨论了其在应用中出现的问题,并针对这些问题提出了相应的解决办法,最后展望了其应用前景。     

Adaptive recognition by nucleic acid aptamers

Nucleic acid molecules play crucial roles in diverse biological processes including the storage, transport, processing, and expression of the genetic information. Nucleic acid aptamers are selected in vitro from libraries containing random sequences of up to a few hundred nucleotides. Selection is based on the ability to bind ligand molecules with high affinity and specificity. Three-dimensional structures have been determined at high resolution for a number of aptamers in complex with their cognate ligands. Structures of aptamer complexes reveal the key molecular interactions conferring specificity to the aptamer-ligand association, including the precise stacking of flat moieties, specific hydrogen bonding, and molecular shape complementarity. These basic principles of discriminatory molecular interactions in aptamer complexes parallel recognition events central to many cellular processes involving nucleic acids.     

转基因大豆检测技术研究进展

基因工程技术的发展使转基因作物及其产品越来越多地进入人们的生活,转基因产品安全性在世界范围内引起广泛关注,对转基因检测技术的要求也越来越高.随着转基因作物品种的不断增加,现有的常规转基因检测方法已不能满足快速、灵敏、高通量及准确定量的要求,进而对转基因检测技术提出了更高的要求.文章通过对转基因作物蛋白质和核酸检测技术的研究进展进行综述,重点介绍ELISA、PCR和基因芯片技术在转基因大豆检测中的最新应用情况,并对不同方法的优缺点进行比较.近年来,蛋白质组学、生物分子互作及近红外光谱分析等新技术在转基因检测中逐渐兴起应用,其中质谱技术和同位素标记技术是今后转基因检测技术发展的方向;由于多重连接探针扩增(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA)技术可在单一反应管内同时检测多种转基因成分,实现了高通量转基因检测的目的,提高了转基因检测效率,今后需加强其在转基因大豆检测中的研究与应用.     

PCR－核酸试纸条法快速检测鸽子源性成分

[目的]提高动物源性成分检测效率,建立PCR-核酸试纸条快速检测技术体系。[方法]针对物种特异性DNA序列,设计并标记引物;建立并优化PCR反应体系;利用通用核酸试纸条进行结果判读。[结果]试验表明,PCR-核酸试纸条特异性高;绝对灵敏度为0.001 3 ng/μL,混合样品,实际灵敏度为0.01%;加工处理样品,实际灵敏度为0.1%;最低检测限检出率为100%,稳定性良好。[结论]综上,PCR-核酸试纸条方法是一种既有PCR反应的高灵敏度,又具有免疫学检测的特异性好的特点,同时操作简便的快速检测方法。     

基于NaCl高效聚集纳米金的比色适配体传感器检测多菌灵

植物体和水体中残留的多菌灵通过食物链进入生物体,最终对生物体健康造成威胁,已经引起了社会的广泛关注。现有的检测方法虽然具有一定的灵敏度和精确性,但往往需要昂贵的大型设备、专业的技术人员和较长的检测时间,因此建立快速、高效的检测方法具有重要的现实意义。在本文中,我们使用无标记的多菌灵特异性适配体作为传感探针,NaCl溶液作为聚集诱导剂,纳米金粒子作为颜色指示剂,开发了一种比色适配体传感器用于检测水溶液中的多菌灵。在没有多菌灵时,纳米金颗粒被多菌灵适配体包裹,在NaCl溶液中依然维持分散。当多菌灵存在时,多菌灵适配体与多菌灵特异性结合形成稳定的复合物,此时,溶液中裸露的纳米金在NaCl的作用下聚集,整个体系从红色变为蓝色。该比色法的检测限低至2.3nmol/L,线性检测范围为2.3~800nmol/L。加标水样中多菌灵的平均回收率为96.3%~111.2%,相对标准偏差为1.5%~8.9%。该比色适配体传感器操作简单,检测时间短,仪器要求低,因此具有在水环境中快速检测多菌灵的潜力。     

马铃薯X病毒黑龙江分离物外壳蛋白基因克隆与序列分析

马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)是重要的马铃薯病毒之一,几乎分布于全国所有马铃薯种植区域,严重影响马铃薯的产量和品质。对其建立RT-PCR分子检测体系以及对其外壳蛋白(CP)基因进行序列分析尤为重要。根据已报道的PVX的核苷酸序列设计合成1对引物,以带毒植株总RNA为模板,应用RT-PCR方法,克隆了PVX黑龙江分离物(P2)全长CP基因序列。序列分析表明:P2CP基因全长711 bp,编码237个氨基酸残基,与GenBank中17个不同分离物的CP核苷酸序列同源性为75.5%~96.3%,氨基酸序列同源性为89.4%~99.2%。依据PVXCP氨基酸序列建立系统进化树,将PVX不同分离物划分为两大类群,P2与PVX中国分离物亲缘关系较近,同属于类型Ⅱ,表现一定的地域相关性。同时,应用该RT-PCR分子检测体系进行马铃薯样品检测。     

石斑鱼虹彩病毒SGIV感染致病的细胞分子基础及免疫防控对策

虹彩病毒(Iridovirus)是目前海水和淡水养殖鱼类最严重的病毒性病原之一,已从100多种鱼类中分离鉴定出该病毒。石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)是从新加坡养殖的患病石斑鱼中分离鉴定的高致病性虹彩病毒,是虹彩病毒科Iridoviridae蛙病毒属Iridovirus 1种新的病毒。本文从以下几个方面对SGIV的研究进行综述:SGIV的形态、超微结构及其在石斑鱼细胞中的复制和装配过程;SGIV病毒基因组、转录组、囊膜蛋白质组及miRNAs的解析;SGIV感染宿主靶标组织的鉴定;病毒侵染的入侵方式、运动轨迹和胞内运输的实时追踪;SGIV感染宿主引起类凋亡的死亡机制及介导的信号通路的揭示;多种宿主免疫抗病基因对病毒感染的调节作用;多种SGIV的检测技术,包括基于抗体的流式细胞技术、微流控芯片检测技术、环介导等温扩增技术及核酸适配体检测方法等;SGIV的灭活疫苗、亚单位疫苗和DNA疫苗的研制等。以期为深入阐明SGIV感染致病机理奠定坚实的理论基础,为发展抗病毒对策提供技术支撑。     

转基因作物食品基于核酸检测技术研究进展

随着转基因作物的迅速发展,转基因作物食品大量涌向市场,由于其安全性没有定论而受到广泛关注。本文对国内外转基因作物食品基于核酸检测技术进行概述,着重介绍目前使用较广泛的检测技术的特点及其存在的主要问题,为转基因作物食品严格管理提供技术参考。