免疫增强剂提高禽用二联苗免疫效力的研究

为评价免疫增强剂(VA5)对禽用联苗的免疫增强作用,将VA5分别与市售鸡新城疫-传染性法氏囊(新法)二联苗合用免疫SPF鸡和蛋鸡、与新城疫-H9亚型禽流感(新流)二联苗合用仅免疫SPF鸡,评价免疫后的抗体效价和SPF鸡攻毒后的保护效力。结果显示,SPF鸡或蛋鸡免疫含VA5的新法二联苗、新流二联苗后,新城疫血凝抑制(HI)抗体效价比常规苗组提前1周达到6 log2,禽流感HI抗体效价比常规苗组提前1周达到7 log2,法氏囊血清琼扩抗体和中和抗体比常规苗组均提前1周合格,且3种抗体持续高于常规疫苗组。免疫含VA5疫苗组的SPF鸡对新城疫强毒攻毒,以临床症状判断,可达全保护;以囊病变和临床症状判断,对法氏囊的攻毒提供全保护;H9变异株攻毒后不排毒。对上述3种病毒的保护力均高于常规苗。上述结果表明,VA5免疫增强剂能够提高鸡新法二联苗、新流二联苗对鸡的免疫效力,具有很好的应用前景。     

禽霍乱-新城疫二联油乳剂灭活疫苗研究 (Ⅳ报)——疫苗的田间试验

[目的]评价禽霍乱-新城疫二联油乳剂灭活疫苗的临床应用效果,为联合防制禽霍乱和新城疫提供条件。[方法]将禽A型多杀性巴氏杆菌1502强毒株与鸡新城疫病毒La Sota弱毒株混合,制备成5批合格的二联油乳剂灭活苗,用于鸡、鸭和鹅的田间安全性和免疫保护试验。[结果]田间安全性试验表明,免疫鸡、鸭和鹅均未出现不良反应;鸡的田间免疫效力试验表明,7～14日龄雏鸡和60～90日龄青年鸡免疫3周后新城疫血凝抑制（ND-HI）抗体效价均比对照组高2～3 log2,可持续4个月以上,禽多杀性巴氏杆菌攻毒保护率均达到75.0%以上,免疫效力可持续6个月;鸭和鹅的田间免疫效力试验表明,接种3周后免疫组ND-HI抗体效价均≥4.2 log2,对照组均≤2 log2;鸭、鹅的禽多杀性巴氏杆菌攻毒保护率分别在75.0%和62.5%以上。[结论]该二联苗免疫禽类安全可靠,具有良好的免疫效果。     

新城疫La Sota疫苗对不同基因型流行株的免疫保护

选取国内2001—2003年发生的5株NDV毒株,经CEF蚀斑纯化和SPF鸡胚增殖,克隆其融合蛋白（F）和血凝素—神经氨酸酶（HN）基因。利用F基因为Ⅱ型的疫苗La Sota活疫苗在隔离器中免疫SPF鸡,每7 d 采血监测NDV抗体,免疫后2周,利用经过鉴定的新城疫病毒（NDV）基因Ⅶ流行株潍坊毒SGM01,昌乐毒SCL03,东营毒SKY和莘县毒SSX03;基因为Ⅱ型日照毒SRZ03和基因为Ⅲ型经典强毒F48E9分别进行攻毒试验,同时设SPF 鸡对照。每天观察,及时剖检发病鸡,检查鸡群病变,观查疫苗的保护性,便于对常规生产中的免疫失败原因进行分析。     

斗鸡新城疫病毒DQ株融合蛋白基因序列分析

从越南斗鸡暴发的病例中分离出1株新城疫病毒（NDV），命名为贵州分离株（DQ）。采用RT—PCR方法扩增分离株（DQ）的整个F基因片段，并将其克隆到pMD-18T载体中。序列分析结果表明，DQ株F基因分子长为1662bp，编码553个氨基酸。该毒株与国内2株分离株（CH2000、TW2000）之间的亲缘关系较近，其核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95．7％-96．6％和96．6％-96．8％；但与LaSota、B1及1748E9等常见毒株的核苷酸和氨基酸同源性仅为84．0％-86．5％和87．2％-89．9％。DQ分离株在F蛋白裂解住点的氨基酸顺序为^112R—R—Q—K—R—F^117，与NDV强毒株特征相符，且具有101处的K（赖氨酸）和121处V（缬氨酸）2个特征性氨基酸，与NDV基因Ⅶ型的特性完全相符。利用MegAlign软件绘制NDV的系统发育进化树表明该分离株为基因Ⅶd亚型。     

表达传染性法氏囊病毒超强毒流行株VP2基因重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建

 【目的】重组新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV）作为新型的活病毒载体疫苗具有巨大的优势和应用前景,本研究旨在探讨新城疫病毒作为防制传染性法氏囊病超强毒（very virulent infectious bursal disease virus,vvIBDV）及新城疫重组二联活病毒载体疫苗的可行性。【方法】采用单股负链RNA病毒反向遗传操作技术,救获野生型NDV LaSota疫苗株rLaSota及表达vvIBDV Gx株VP2基因的重组疫苗株rLaSota-VP2,分别经滴鼻点眼途径免疫SPF雏鸡,免疫后21 d分别以vvIBDV Gx超强毒和新城疫强毒进行攻击。【结果】rLaSota及表达vvIBDV－VP2基因平均鸡胚致死时间均大于120 h,脑内致病指数（ICPI）分别为0.4和0.36,静脉内致病指数（IVPI）均为0;接种后72～96 h每毫升尿囊液EID50则分别达到109.0以上。rLaSota-VP2以106.0 EID50一次免疫7日龄SPF鸡雏,免疫后3周对新城疫强毒致死攻击100％保护,对vvIBDV攻击免疫保护率达90％以上。 【结论】重组病毒rLaSota-VP2保持了LaSota亲本疫苗株高滴度的鸡胚生长特性和低致病性及遗传稳定性,免疫雏鸡对新城疫强毒和传染性法氏囊病毒超强毒株的致死均形成有效免疫保护。本研究为研制传染性法氏囊病－新城疫重组二联活载体疫苗奠定了基础。     

减蛋综合征病毒HSH23株与AV127株免疫效力比较研究

[目的]比较本室分离EDS75VHSH23毒株与AV127参考毒株的免疫效力。[方法]采用本室制备的ND—IB—EDS（HSH23株）三联灭活疫苗和市售ND—IB—EDS（AV127株）三联灭活疫苗,分别免疫海兰褐商品蛋鸡,免后采血测定EDSHI抗体,并于免后7周用AV127株强毒攻击。[结果]免后4、7周,本室三联苗EDSHI抗体分别为8．9、8．05log2,而市售三联苗分别为7．6、5．95log2,对照鸡抗体为阴性。攻毒后,疫苗免疫鸡产蛋率始终保持90％以上,而对照组鸡产蛋率急剧下降到40％左右,蛋质量变差;攻毒后第26天对照组试验鸡产蛋开始有所恢复,产蛋率达60％,攻毒后第32～42天产蛋率约75％,仍未恢复到正常水平。统计3组试验鸡攻毒后6周内平均每只鸡的产蛋个数,本室三联苗组、市售三联苗组及对照组分别为39．48、38．41和26．60枚,每只免疫组鸡比对照组多产鸡蛋12枚。[结论]EDS76VHSH23株、AV127株均具有良好的免疫原性。     

运用锚引物扩增新城疫病毒鹅源分离株基因组末端序列

在T4 RNA连接酶的作用下,将人工合成的锚引物直接与新城疫病毒（NDV）鹅源毒株ZJ1株的基因组5′末端的反转录产物及NDV基因组3′末端直接相连,然后用聚合酶链反应（PCR）和RT－PCR分别快速扩增基因组5′末端和3′末端,测序结果表明：3′末端的Leader序列为55nt,5′末端的trailer序列为114nt。将该序列与GenBank报道的NDV鸡源毒株的相应序列相比,XJ1株与6个鸡源NDV毒株的Leader和trailer序列的同源性分别为83.6%-92.7%和60.5%-63.2%。序列比较结果表明：该鹅源毒株与鸡源毒株在基因组3′端调控区有较高的同源性,而在基因组5′端的调控区同源性则较低。     

抗独特型单克隆抗体在鸡中诱导的抗新城疫病毒保护性免疫——新城疫单克隆抗独特型疫苗研究(Ⅲ)

用AFE_8Id_(16-6)和ALA_(15-6)Id两株新城疫病毒(NDV)的抗独特型单抗(MAb_2)分别免疫接种一组(18只)无HI抗体鸡,并以一组(7只)Lasota苗常规免疫鸡和一组(12只)不免疫的易感鸡分别作为免疫阳性和阴性对照。在两株MAb_2末次免疫后8天,用微量血凝抑制(HI)试验检测了4组鸡的血清中HI抗体水平。结果:两株MAb_2和Lasota苗免疫的鸡全都产生了HI抗体,非免疫鸡均未测到HI抗体。AFE_8Id_(16-6)免疫鸡的HI滴度为1～5log_2;ALA_(15-6)Id免疫鸡的HI滴度为1～4log_2;Lasota苗免疫鸡的HI滴度高达7～10log_2。在HI抗体检测后2天,用100LD_(50)F_(48)E_8株NDV强毒攻击4组鸡,隔离观察10天,AFE_8Id_(16-6)和ALA_(15-6)Id免疫鸡的保护比值分别为17/18和10/18,Lasota苗免疫鸡保护比值达7/7,而非免疫对照鸡在攻毒后6天全部死亡。试验结果证明,上述两株MAb_2是NDV保护性抗原的模拟物,在多次注射后可诱导鸡产生抗NDV的血凝抑制抗体,并能使鸡抵抗NDV强毒的人工感染。因此,这两株抗独特型单抗,尤其AFE_8Id_(16-6)有希望用作新城疫抗独特型疫苗。     

禽霍乱·新城疫二联油乳剂灭活疫苗研究(Ⅲ报)——疫苗对鸭和鹅的安全性及免疫效力试验

[目的]为禽霍乱、新城疫二联油乳剂灭活疫苗免疫鸭和鹅等水禽提供理论依据。[方法]将禽A型多杀性巴氏杆菌接种固体培养基收获的菌液与鸡新城疫病毒弱毒株La Sota接种易感鸡胚收获的感染鸡胚液混合,用甲醛溶液灭活后制备成5批二联油乳剂灭活苗,用于鸭和鹅的安全性及免疫效力试验。[结果]5批二联苗对鸭和鹅的安全性试验表明,免疫鸭和鹅均未出现任何不良反应;免疫效力试验表明,免疫后3周,鸭和鹅的新城疫血凝抑制抗体效价均≥4 log2,新城疫攻毒保护率均为100%,禽霍乱攻毒保护率为66.7%~83.3%。[结论]该二联苗用于免疫鸭和鹅安全可靠,免疫效果良好。     

SYBR GreenI模式荧光RT-PCR鉴别新城疫病毒毒力

 【方法】根据NDV的F蛋白裂解位点附近的序列，设计分别对应于NDV强毒和弱毒的两对引物，然后用SYBR Green I模式的荧光RT-PCR方法比较两对引物对同一NDV的RNA扩增效率以及扩增产物的Tm值，来区分NDV的毒力。【结果】对8株NDV进行检测并测定其鸡胚平均致死时间（MDT），荧光RT-PCR方法的检测结果和MDT测定的结果完全一致，说明此荧光RT-PCR法可用于NDV毒力检测。     

不同来源的5株新城疫病毒的分离·鉴定与基因型分析

[目的]分离鉴定不同来源的5株新城疫病毒（NDV）,并对其基因型进行分析。[方法]从江苏和广西发病孔雀、鸡、鹅群分离到5株NDV。参照文献合成1对引物P1和P2,用于扩增基质蛋白基因（M）1161nt至融合蛋白基因（F）889nt之间长约970nt的片段。用TrizolRNA试剂盒抽提5株NDV基因组,再按照Promega说明书,用上游引物P1合成F基因cDNA,合成的cDNA作为聚合酶链式反应（PCR）的扩增模板,用PCR反应扩增F基因目的片段。将所得产物进行序列测定,获得这5株NDVF基因5′端约890nt序列。采用DNAMAN软件对F基因47～420nt间的片段进行序列分析,并推导出相应的氨基酸序列。在此基础上,从GenBank中选取32个参考毒株与这5个分离株进行遗传变异分析,并绘制系统发育进化树。[结果]同源性分析比较表明,5株NDV分离株之间的差异性很小,它们之间的同源性为95.00%～97.00%,其中2株广西分离株之间的同源性为97.07%,3株鹅源分离株之间的同源性为96.43%。所有毒株F蛋白裂解区氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株裂解区位点特征。这5株NDV分离株均属于基因Ⅶ型和Ⅶd亚型。[结论]近几年流行的NDV的主导基因型为基因Ⅶ型,且来自不同宿主的毒株之间的差异性较小。     

SYBR Green Ⅰ模式荧光RT-PCR鉴别新城疫病毒毒力

【方法】根据NDV的F蛋白裂解位点附近的序列，设计分别对应于NDV强毒和弱毒的两对引物，然后用SYBR Green Ⅰ模式的荧光RT-PCR方法比较两对引物对同一NDV的RNA扩增效率以及扩增产物的Tm值，来区分NDV的毒力。【结果】对8株NDV进行检测并测定其鸡胚平均致死时间（MDT），荧光RT-PCR方法的检测结果和MDT测定的结果完全一致，说明此荧光RT-PCR法可用于NDV毒力检测。     

鸡传染性支气管炎及大肠杆菌病二联灭活油乳苗的研制和应用

用本地分离株及标准株筛选出４个ＩＢＶ强毒株（呼吸型和肾型）及７个至Ｅ．ｃｏｌｉ强毒菌株（血清型为Ｏ１，Ｏ２，Ｏ７８）作为制苗基础毒株和菌株，并加入发病鸡场的自家分离株，作为制苗毒种和菌种，并将制成灭活的尿囊液和菌液以及油佐剂配成鸡传染性支气管炎及大肠杆菌病二联灭活油甩苗。试验证明：该油苗可使鸡产生坚强的免疫力，二免后１０个月攻毒保护率达１００％，ＩＢＶ抗体的ＨＩ价为１：２５６，Ｅ．ｃｏｌｉ抗体直接     

2株山西IBV分离株的生物学特性研究

[目的]控制地方鸡传染性支气管炎病的流行。[方法]通过IBV-21、IBV-22半数感染量(EID50)试验,鸡胚矮小化试验,干扰NDV LaSota复制试验,鸡胚气管环试验测定2毒株生物学特性。[结果]试验结果显示IBV-21的EID50为5×10-4.616·mL-1、IBV-22为5×10-6.5·mL-1;接毒胚明显病变,2株毒对鸡胚均有矮小化作用,对NDV LaSota有明显干扰,对鸡胚气管环试验病变明显,RT-PCR的方法扩增2分离株的S1基因的特异条带大小约为293bp。[结论]该生物学特性显示分离的2株病毒对鸡胚有明显致病作用且2毒株不是现存疫苗毒,为地方IBV疫苗研发奠定基础。     

NDVF基因真核表达质粒的构建及其与鸡IL-18基因联合免疫的初步研究*

 为了探索鸡新城疫病毒(NDV)F蛋白的免疫原性及鸡白细胞介素-18(IL-18)的免疫增强作用,通过PCR和酶切方法将NDV F基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒pcDNA-F。用质粒pcDNA-F单独或与鸡IL-18重组真核表达质粒pIL-18联合免疫14日龄SPF鸡。首免后每周采取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第14 d用NDV强毒F48E9株进行攻击。结果表明,质粒pcDNA-F与pIL-18联合免疫显著提高鸡体的细胞免疫水平,并且提供了50%免疫保护,这为ND的防治开辟了新的途径。     

不同新城疫分离株的毒力测定与单克隆抗体分群研究

采用传统方法对15株新城疫分离毒株进行毒力测定，根据鸡胚平均死亡时间（MDT）与3日龄雏鸡脑内接种指数（ICPI）测定结果，Fw、F48属E8于速发型毒株；ND98、P1、P2，鸽NDV、Ⅰ系、H2、BY属于中发型毒株，Ⅱ系、L2、P3、ND99，ND89 Lasota属于缓发型毒株。同时对这些毒株的表型特征进行观察发现，病毒血凝解脱速率、血凝素对热的稳定性、对不同动物红细胞的血凝谱等表型特征与NDV毒力没有相关性。通过问接酶联免疫吸附试验，采用针对NDVHN基因的单克隆抗体对贵州ND不同分离株进行分群研究，表明A群为速发型强毒株；B群为缓发型弱毒与某些中等毒力株；C群分离物的毒力介于速发型强毒与中等毒力之间。     

单抗夹心ELISA检测免疫鸡群新城疫病毒

用SPF鸡胚将送检的免疫鸡群泄殖腔棉拭样品盲传一代，再用新城疫单抗夹心ELISA对F1代尿囊液进行新城疫病毒(NDV)快速检测，同时用世界动物卫生组织(OIE)推荐的NDV分离及鉴定的方法加以验证。通过对3423份样品的检测，检出阳性样品453份，阴性样品2959份，可疑样品11份，两种方法的阳性符合率为99．3％，阴性符合率为99．7％。对全部阳性样品进行病毒分离，经血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验证明均含有新城疫病毒(NDV)，再将全部阳性样品分离物进一步作毒力鉴定，结果有强毒力株、中等毒力株及弱毒力株，因此用新城疫单抗夹心ELISA检测免疫鸡群泄殖腔棉拭样品F1代尿囊液新城疫病毒快速、准确率高，呈阳性者不全是NDV强毒力株感染，还有NDV中等毒力株或弱毒力株感染。     

七彩山鸡新城疫病毒的分离鉴定与免疫保护试验

用SPF鸡胚从疑似七彩山鸡新城疫病鸡群中分离到一株病毒,进行HA及HI试验以及病毒中试验。结果表明,血凝作用可被NDV阳性血清所抑制,而不能被AIV（H9亚型）、EDS76所抑制,经ND标准阳性血清处理的病料接种的鸡胚未见死亡,证明分离毒为NDV。动物回归试验表明,分离毒肌肉注射非免疫七彩山鸡能使之发病、死亡,出现与自然病例一致的症状与病变,但肌注SPF鸡只感染,不出现临床症状。其生物学特性NHAT为快、HOT为8min、ICPI为1．73、IVPI为1．45、MDT为44h。表明该七彩山鸡NDV分离株与鸡F48E9株在生物学特性上表现出不同的特性。用分离毒株制成油乳剂灭活疫苗,分别以分离毒株和Lasota株的灭活苗免疫广西麻鸡和七彩山鸡,进行疫苗免疫效果比较和交叉免疫保护试验。结果表明,分离毒株灭活苗免疫组鸡各个时期所产生的HI抗体效价和Lasota灭活苗免疫纽鸡的抗体效价相差不明显,各组的升降规律也基本一致;Lasota灭活苗免疫七彩山鸡对分离毒株的攻击只能80％保护。而其他各免疫组的无论是对分离毒株还是F48E9株的攻击均能100％保护。说明NDV不同毒株之间的毒力和抗原性存在一定的差异。     

藏鸡NDV的分离鉴定及F基因的遗传进化分析

【目的】探讨藏鸡NDV的毒力和F基因的遗传进化特征。【方法】从采集的藏鸡病料中分离鉴定NDV,通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）和1日龄雏鸡脑内接种致死指数（ICPI）来确定分离株的毒力。采用RTPCR方法克隆藏鸡NDV分离株F基因,测序后进行序列分析,并进行进化分析。【结果】共分离鉴定出F5、FX10、F20、F74、F75、F17、F72、FH2等8株NDV,其中F17、F72、FH2为强毒株,其余5株为弱毒株。8株病毒F基因ORF均为1 662 bp,编码553个氨基酸,强毒株ORF编码产物含有12个半胱氨酸残基,弱毒株有13个半胱氨酸残基,比强毒株在27位(强毒株C²⁷变为R²⁷)多了1个半胱氨酸残基;有6个潜在的糖基化位点。分离的8株NDV与GenBank中发表的20株NDV参考毒株比较结果表明,F蛋白氨基酸序列变异位点较多,主要集中在8-30,97-124,45,385-386,402-403,479-494,509-520位氨基酸处,强毒株AA替代较集中,而弱毒株保守区较多且AA替代较分散。分离NDV株之间F基因编码区核苷酸序列同源性为83.5%～99.9%,其中强毒株之间同源性为95.2%～99.4%,弱毒株之间同源性为99.4%～99.9%。分离NDV株之间F基因编码的氨基酸同源性为87.5%～99.5%,其中强毒株之间同源性为95.3%～98.2%,弱毒株之间同源性为98.6%～99.5%。进化分析显示,3株强毒株均为基因Ⅶ型,5株弱毒株均为基因Ⅱ型。【结论】分离了8株藏鸡NDV,其中3株为强毒株,属于基因Ⅶ型;5株为弱毒株,属于基因Ⅱ型。     

鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备及检验

[目的]制备鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感[ND-IB-AI（H9亚型）]三联灭活疫苗。[方法]以NDV La Sota株、IBVM41株、AIV（H9亚型）WD株为毒种,分别接种鸡胚,制备NDV、IBV及AIV（H9亚型）抗原液;采用病毒超滤系统浓缩病毒抗原液,并用甲醛溶液进行灭活;将浓缩灭活后的3种抗原液按一定比例混合（1∶1∶1）,以司本80及吐温80为乳化剂,10号白油为佐剂,乳化制成ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗;对制备的疫苗进行无菌检验和物理性状观察。[结果]共制备了3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗实验室制品,经无菌检验为阴性,外观为乳白色,剂型为油包水型（W/O型）,粘度6.36.8 s,离心和37℃放置21 d均不分层。[结论]所制备3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗均无细菌污染,其物理性状均能达标。