玉米淀粉分支酶sbe Ⅱ b基因启动子的克隆与特异表达

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子的克隆与特异表达（英文）

[目的]构建玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。[方法]LA-PCR扩增了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因启动子序列,并克隆到pMD18-TVector上。再将启动子克隆到pBI121载体上,构建植物表达载体pBI121-sbeⅡb。把GUS基因连到pBI121-sbeⅡb上构建pSBE-GUS后利用农杆菌介导法转化烟草。分别进行PCR和Southern杂交检测,并对经基因枪轰击和农杆菌介导的烟草种子、根、茎及叶进行GUS组织化学分析和荧光检测。[结果]测序结果与GenBank中发表的玉米sbeⅡb基因启动子同源性达98.52%。共培养和筛选培养后获得4株转pSBE-GUS植株,叶片仅有少量蓝斑出现,而根和茎部未见蓝斑,但烟草种子有大量蓝斑显出,初步推断sbeⅡb基因启动子能启动GUS在种子中特异表达。[结论]成功构建了玉米淀粉分支酶sbeⅡb基因种子特异表达启动子。     

含有MAR序列的STI-STII-LTB融合基因在苜蓿中的表达

产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)LT和ST是导致人和动物腹泻的主要病原菌。利用三引物PCR法和酶切实现了STI、STII、LTB基因的融合,LTB基因的5′位于STII基因的3′端,三者在同一阅读框。将融合基因STI-STII-LTB构建到带有核基质结合区序列(MARs)的植物表达载体pBI121-MARs中GUS基因的位置。同时构建不含MARs序列的重组质粒。重组质粒pBI121-MARs-STI-STII-LTB、pBI121-STI-STII-LTB通过冻融法转化根癌农杆菌,并通过农杆菌介导法转化杂花苜蓿。转基因苜蓿植株经PCR检测、Southern-blotting分析表明,转基因苜蓿植株基因组中可检测到STI-STII-LTB融合基因;提取转基因苜蓿植株总蛋白质,SDS-PAGE结果显示,转基因植株表达了重组抗原蛋白,且含MAR序列的蛋白表达量要高于不含MAR序列的表达量;Western-dotting免疫检测证实转基因植株表达的重组抗原具有免疫原性。     

马铃薯prp1-1启动子的克隆及转基因研究

采用PCR技术，从云南马铃薯叶片DNA中分离克隆到了马铃薯病程相关蛋白（prpl-1)基因启动子，与国外文献报道序列完全一致。将这一启动子亚克隆到中间载体pUC18中，再构建到植物表达载体pBI121上，以取代其原有的CaMV35S启动子，得到重组植物表达载体pBI121M；用电脉冲法将pBI121M转入农杆菌LBA4404。应用农杆菌介导法，将携带有pBI121M重组质粒的农杆菌转化烟草，经卡那霉素筛选，得到了一批转基因植株。转基因植株的PCR鉴定表明，启动子整合到了烟草植株基因组中。本研究为下一步通过X－Glu染色法检测启动子下GUS基因的表达情况，研究该启动子的病原菌特异性诱导活性，并建立新的植物转基因系统奠定了基础。     

茶树ATP硫化酶和硒半胱氨酸甲基转移酶基因植物表达载体的构建

采用能有效转化双子叶植物的表达载体pBI121构建植物硒营养代谢关键酶基因的表达载体,将原载体中GUS基因用茶树ATP硫化酶基因(APS1和APS2)替换,将硒半胱氨酸甲基转移酶基因(CsSMT)连接到pBI121载体上直接与GUS基因相连,分别构建了目的基因植物表达载体pBI-APS1、pBI-APS2和pBI-CsSMT.通过三亲杂交法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,获得转化工程菌,为通过植物基因工程获得富硒农产品打下基础.     

烟草MARs的分离及功能鉴定

【目的】研究烟草MARs序列对外源基因表达的影响,从中筛选出能明显提高目的基因表达水平的强MARs序列。【方法】用PCR方法从烟草基因组中克隆得到3个MARs序列(TM1、TM2和TM3),将这3个MARs序列分别顺向构建到植物表达载体pBI121 GUS基因表达盒两端,经农杆菌介导转化烟草,对获得的转基因植株体内的GUS酶活性进行了定量检测,分析MARs对GUS酶活性的影响。【结果】(1)序列分析表明,TM2和TM3是两个新的MARs序列;(2)GUS酶活性的定量检测表明,TM1、TM2、TM3可以使GUS基因的平均表达活性分别提高1.4,5.1和1.3倍,但不同转化个体之间的表达水平有明显差异。【结论】虽然克隆到的3个MARs序列均可提高外源基因GUS的表达,但其并未降低转基因植株个体间外源基因表达水平的差异。     

大豆豆荚特异性启动子的克隆及功能分析

【目的】克隆大豆豆荚特异性启动子,并对其进行功能分析,为研究抗病虫基因在大豆荚中的特异性表达奠定基础。【方法】利用PCR技术克隆得到豆荚特异性启动子(Pod Specific Promoter,PSP)的核心序列,用PSP序列取代质粒pBI121中的CaMV 35S启动子,构建与GUS基因融合的豆荚特异性报告载体pPSP-GUS,通过农杆菌介导法转化烟草"NC89",对转基因植株进行分子生物学检测,将鉴定为阳性的植株经GUS组织化学染色,验证PSP片段的功能。【结果】所获得的豆荚特异性启动子PSP大小为1 270bp,与已报道序列的同源性为98%,具有多种典型的启动子表达调控元件,如A/T-rich core、CAATBOX、TATABOX、GATABOX等。将pPSP-GUS质粒转化烟草后,经PCR和Southern blot检测结果显示,成功获得了转基因阳性烟草植株。GUS活性检测结果显示,在转pPSPGUS质粒的烟草根和叶片中均未检测到GUS活性,在萼片中可检测到低水平的GUS活性;而在花荚中可检测到高水平的GUS活性,且明显高于转pBI121质粒的对照植株。【结论】克隆得到的豆荚特异性启动子PSP片段具有启动基因在豆荚中特异性表达的功能。     

农杆菌介导的烟草瞬时表达试验条件优化

以烟草叶片为试材,用转入植物表达载体pBI121的根癌农杆菌EHA105进行遗传转化。通过分析菌液不同浓度、侵染时间、乙酰丁香酮浓度及共培养时间对GUS基因表达的影响,研究其瞬时表达的最佳条件。结果显示:用OD600值为0.6的农杆菌侵染6min,在培养基中添加120μmol.L-1的乙酰丁香酮,共培养2d,能够得到高效的GUS基因瞬时表达。     

雪花莲凝集素基因(GNA)植物表达载体的构建及其对烟草的遗传转化

将雪花莲凝集素基因(GNA)取代GUS基因正向插入到Ti质粒载体pBI121的35S启动子之下,构建成植物表达载体pBI121/GNA,并将其导入农杆菌LBA4404中.通过该农杆菌介导转化烟草红花大金元,得到卡那霉素抗性植株159株,PCR检测表明其中102株为阳性.对8株PCR阳性植株进行了抗蚜虫生物活性检测,抑制蚜虫密度为25%～90%.     

拟南芥抑芽基因SPS的克隆及植物表达载体的构建

通过PCR方法从拟南芥基因组DNA中克隆了SPS基因,序列分析表明,与Genebank公布的序列完全一致。然后,将该基因亚克隆到植物表达载体pBI121上,并将载体pBI121上的CaMV35S启动子替换为烟草伤诱导启动子POD,构建成植物表达载体pBISPSPOD。     

马铃薯sgt3基因启动子克隆及其功能鉴定

【目的】克隆马铃薯茄啶鼠李糖基转移酶基因(sgt3)的启动子序列并对其进行功能鉴定.【方法】采用染色体步移技术(genome walking)进行启动子的克隆,构建了该启动子驱动报告基因gfp::gus的植物双元表达载体p1304sgt3p,以pCAMBIA1304为阳性对照表达载体,采用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达及稳定遗传转化,结合GUS组织化学染色对其进行功能鉴定.【结果】电泳图表明为1条长约2 500bp的特异扩增条带,瞬时表达和稳定遗传表达的烟草叶片的GUS组织化学染色结果均显示gus基因在转化烟草叶片中高效表达,并且低于阳性对照,非转化烟草叶片中无表达.【结论】成功克隆到sgt3基因起始密码子上游2392bp的启动子序列并且该启动子具有活性.     

轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因转化苎麻的研究

利用套叠PCR技术对轮状病毒外壳抗原蛋白VP4基因进行了定点突变,将改造后的基因插入pBI121构建植物表达载体。在设计PCR引物时,引入植物表达载体pBI121具有的克隆位点BamH I和Sac I,利用BamH I和Sac I切除pBI121上的GUS基因并使载体质粒线性化,用同样的2种酶消化pTVP4克隆载体获得VP4基因片段,使之形成与线性化pBI121质粒相同的粘性末端。在T4DNA连接酶的作用下,将线性化pBI121质粒和酶切后的VP4基因片段连接成新的重组质粒pBI121/VP4,通过直接转化法转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumefaciens)EHA105菌株中,获得农杆菌工程菌株。采用叶盘转化法转化苎麻(Boehmeria.nivea L.Guad)栽培品种圆叶青,以卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记获得抗性植株。经PCR、PCR Southernblot分析表明,初步获得了轮状病毒外壳蛋白VP4的转基因苎麻植株。     

SV40启动子在烟草体内的驱动特性研究

根据SV40启动子序列设计引物,PCR扩增该启动子后,成功构建了具有SV40启动子和GUS报告基因的植物表达载体pLpPSG,并将重组质粒转化到烟草叶片中.通过SV40启动子驱动的GUS基因在烟草叶片内的瞬时性表达,研究了该启动子在植物基因表达中的驱动特性.结果表明:SV40启动子可启动GUS基因在烟草体内的表达,其提高基因表达水平达到2×35S启动子的(88.5±19.2)%.     

黑果枸杞及其白色果实F3′5′H基因启动子克隆及活性分析

通过3次染色体步移克隆出黑果枸杞及其白化果实F3′5′H基因的启动子片段并测序。分析发现2个启动子序列的同源性高达90.3%,对启动子序列进行预测,发现两者中均具有TATA-Box、CAAT-Box、TCrich repeats、WUN-motif、Sp1、Box I、G-box、skin-1motif及ARE元件。另外在黑果枸杞启动子中预测到与茉莉酸甲酯响应相关的元件TGACG-motif,而在黑果枸杞白化果实启动子中没有预测到。将2个启动子片段与GUS报告基因融合构建植物表达载体,利用农杆菌介导的瞬时转化法转化烟草叶片,通过组织化学染色来确定启动子的启动活性。结果表明2个启动子均具有启动活性,利用荧光定量对2个启动子所驱动的GUS基因的表达量进行了分析,结果表明黑果枸杞启动子所驱动的GUS基因的表达量是黑果枸杞白化果实的3.09倍。     

可用于植物转化的RNAi载体构建方法

利用PCR方法扩增杨树Poptr;CYCD1;1基因的一段内含子序列,并克隆到pROKⅡ载体中,以构建可用于植物特定基因表达干扰的RNAi载体。为了验证载体的效果,构建pCAMBIA-1303载体转化烟草,经检测,转基因烟草能过量表达外源GUS与GFP融合蛋白。把GUS及GFP片段序列连接于RNAi载体,并导入pCAMBIA-1303载体转化烟草。试验结果表明,GUS及GFP干扰序列的导入均能大大降低外源GUS与GFP融合基因的表达。结果说明构建的载体能有效干扰特定基因的表达。     

大豆rbcS基因启动子的克隆及在转基因烟草中的功能缺失分析

【目的】进一步验证栽培大豆rbcS基因启动子功能,为植物基因工程相关研究提供启动子资源。【方法】从栽培大豆中克隆了rbcS基因5′端上游1 538bp的DNA序列,根据光诱导表达调控元件及顺式作用功能元件所在的位置,设计含1 089,712和190bp 3个5′端缺失体,并将rbcS基因启动子(1 538bp)及3个5′端系列缺失体序列分别与gus基因融合,构建植物表达载体并命名为pGmrbcS、pA、pB和pC,用农杆菌介导法转化烟草,通过gus基因活性变化检测不同缺失体的表达特性。【结果】克隆了1 538bp的大豆rbcS基因启动子序列及1 089,712和190bp的5′端缺失体启动子片段。GUS活性检测表明,在pGmrbcS转基因烟草的叶中GUS活性最高,且与pCAMBIA1301转基因烟草叶片中CaMV35S启动子驱使gus基因的表达量相当,而茎、根中GUS活性较低。GUS定量分析表明,T1代转基因烟草光下培养时,3种缺失体启动子叶片中的GUS表达活性均与CaMV35S启动子相当,其中pB活性最高,是CaMV35S启动子活性的1.4倍,pA、pC活性低于pB,分别为pB活性的84%和71%;含pA的转基因烟草于黑暗中萌发的幼苗叶片gus基因不表达,光下萌发幼苗叶片有gus基因表达,而含有pB、pC的转基因烟草,在黑暗和光下萌发的幼苗叶片中均有gus基因表达,且表达量以pB最高。【结论】含有长度为1 089bp(pA)光诱导元件的rbcS基因缺失体启动子具有光诱导和组织特异表达特性,长度为712bp(pB)的缺失体启动子的启动活性最高。     

GNA和α-PAP双抗表达载体的构建及对烟草的遗传转化

将带有启动子GaMV35S、终止子Nos-ter的雪花莲凝集素基因GNA插入到已构建好的植物表达载体pBI121/α-PAP上，构建成双抗表达载体pBI121/GNA α-PAP，并采用农杆菌介导法将其转化进入烟草红花大金元，获得了卡那霉素筛选的抗性植株，通过PCR扩增验证，烟草基因组中含有这两个抗性基因。     

红麻线粒体基因atp6过表达载体的构建与转化

【目的】构建红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系,为红麻线粒体基因的遗传转化及功能研究打下基础。【方法】以红麻UG93A花药cDNA为模板,通过同源克隆技术克隆atp6基因编码区(CDS)的全长序列;利用In-Fusion基因融合技术构建植物过表达载体,通过农杆菌介导法转化野生型烟草,并对转基因阳性烟草植株进行抗性筛选和PCR验证。【结果】红麻UG93A的atp6基因CDS全长为1182 bp,成功构建红麻atp6基因全长过表达载体pBI121-atp6-EGFP,并获得4株转基因烟草植株(B1、B2、B3和B4),使用过表达载体上3对不同位点的引物组合对转基因植株进行PCR验证,发现有2株转基因烟草植株在3对不同引物中稳定表达,即获得2株含pBI121-atp6-EGFP的T_0代转基因阳性植株(B1和B2)。【结论】构建的红麻线粒体基因atp6过表达载体遗传转化体系,可用于指导后续atp6基因调控红麻细胞质雄性不育(CMS)分子机理研究。     

一个烟草葡糖基转移酶基因启动子的克隆与诱导表达

利用笔者所在的实验室从烟草中克隆的一个葡糖基转移酶基因(GT-like),通过PCR扩增得到该基因开放阅读框5′端-1150~0上游调控区。序列分析表明该启动子序列含有多个基因表达调控元件。将GT-like基因启动子与gus报告基因连接,构建植物表达载体pGT-gus,经根癌农杆菌介导法转化W38型烟草。转基因烟草植株GUS组织化学染色结果表明:该基因上游-1150~0序列具有启动子活性,能启动gus基因在烟草叶片中表达,而在根中的表达受时间和环境影响。GUS诱导活性的定量分析结果表明,该启动子的表达不但受甲基茉莉酸的强烈诱导,而且也受水杨酸的强烈诱导。对这一启动子的诱导表达机理的分析将有助于进一步研究甲基茉莉酸和水杨酸之间拮抗作用的相互关系。     

将Pti5-VP16基因导入烟草的研究

以烟草叶片为外植体，通过根癌农杆菌叶盘转化法，将番茄Pti5-VP16基因导入烟草中。经卡那霉素筛选，获得了27株卡那霉素抗性植株，经PCR扩增和Southern杂交分析，证明抗性植株中整合了Pti5-VP16基因，表明所构建的含Pti5-VP16基因的植物表达载体pBI121UCH1具有正确的阅读框，并能在异源植物中表达。