北京地区枣疯病植原体16S rDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段。对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1 248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%。序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组。     

大连枣树丛植病病原鉴定

针对辽宁大连地区首次发现的枣树丛枝病病原进行了鉴定,利用植原体16S rDNA通用引物对R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2对枣疯病(jujube witches’- broom phytoplasma,JWB - DL)植株总DNA进行巢式PCR扩增,并且通过软件pDRAW32进行RFLP电子酶切,根据分析结果构建系统发育树.结果表明,该病原序列与榆树黄花组( 16SrV)中的各亚组植原体同源率为99％以上,其中与16S rV -B亚组樱桃致死黄化(Cherry lethal yellow,CLY)同源性高达100％,而与其他组的植原体16S rDNA序列的同源率均低于96％,由此推断引起大连枣树丛枝病的为16SrV-B亚组的枣疯病植原体.     

北京地区枣疯病植原体16SrDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段.对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%.序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组.     

苦豆子丛枝病植原体的分子检测与鉴定

[目的]对苦豆子丛枝病植原体做出分子检测与鉴定.[方法]通过PCR扩增技术,分别利用植原体16S rRNA基因,16S-23S rRNA间区及tuf基因序列的通用引物对表现丛枝病症状的苦豆子总DNA进行扩增,得到约1.2、0.3和0.8 kb特异片段.将所得片段分别进行克隆、测序及序列同源性分析.[结果]苦豆子丛枝病植原体(SAWB)上述3序列与榆树黄化组B亚组(16SrV-B)的枣疯病植原体(JWB)相应序列的同源性最高.[结论]苦豆子丛枝病植原体为16Sr V-B亚组成员.     

新疆枣疯病植原体tuf基因的克隆与序列分析

[目的]枣疯病是一种重要的植原体病害,了解新疆枣疯病植原体的系统发育关系及遗传分化,获取其分子特征信息.[方法]利用植原体tuf基因通用引物fTufu/rTufu对新疆枣疯病病株总DNA进行PCR扩增,对部分扩增片段克隆、测序及相似性分析.[结果]获得新疆枣疯病阿克苏株系(JWB-ASZ)和喀什株系(JWB-KHZ)的tuf基因片段分别为841和814 bp.经同源性比较分析,新疆枣疯病阿克苏株系(JWB-ASZ)与喀什株系(JWB-KHZ)均隶属于16S rV-B亚组枣疯病植原体.其中JWB-KHZ株系与枣疯病植原体河北株系的tuf基因核苷酸及氨基酸同源性最高,分别达到90.2;和81.5;;JWB-ASZ与枣疯病植原体陕西株系的tuf基因核苷酸及氨基酸同源性最高,分别达到94.2;和94.6;,而与16S rV其它亚组的核苷酸及氨基酸同源性均低于70;.枣疯病阿克苏株系与喀什株系的tuf基因核苷酸及氨基酸序列之间存在明显差异,同源性仅为为73.5;和63.5;.[结论]研究报道了新疆枣疯病植原体tuf基因序列,为揭示新疆枣疯病植原体不同株系的分子特征、分子变异和遗传多样性提供了基础.     

赞皇大枣枣疯病植原体分子分类

 【目的】枣疯病是一种重要的植原体病害,本试验旨在明确惟一已知的天然三倍体品种--赞皇大枣枣疯病植原体的分类地位,为赞皇大枣枣疯病植原体分类研究提供参考。【方法】利用植原体16S rDNA通用引物对赞皇大枣枣疯病病株的DNA进行PCR扩增和克隆测序,通过BLAST比对进行序列分析,利用临位相连法构建16S rDNA系统演化树,并应用DNAstar软件进行虚拟RFLP分析。【结果】获得的赞皇大枣枣疯病植原体16S rDNA序列长度为1 850 bp（GenBank登录号GU184180）,包括1 529 bp的16S rDNA基因全序列、264 bp的邻近间隔区序列及57 bp的23S rDNA部分基因序列。同源分析表明,赞皇大枣枣疯病病原16S rDNA序列与其它植原体的相似性在87%—98%,其中与榆树黄化 Elm yellows（EY）(GenBank登录号l33763)最高相似性为98%;与大多数二倍体枣品种的植原体序列相似率达99%以上;其虚拟RFLP图谱与4个16SrⅤ亚组的代表序列图谱差异显著,赞皇大枣枣疯病植原体延伸因子tuf基因的序列(GenBank登录号JN001985) 比对结果表明,与其它亚组序列同源性为52.3%—76.7%。【结论】三倍体赞皇大枣枣疯病病原属于榆树黄化组(16Sr V),并与其中的B亚组亲缘关系最近;与二倍体品种的病原分类地位一致,说明枣疯病植原体在系统进化上比较保守。     

枣疯病植原体新疆分离物16S rDNA基因克隆与序列分析

利用植原体16SrDNA基因保守序列通用引物对新疆阿克苏地区和喀什地区的疑似枣疯病植株总DNA进行常规PCR和巢式PCR检测,分别扩增出1.5kb和1.2kb的特异性片段。对片段进行克隆、序列测定分析及系统发育树构建,结果表明,新疆枣疯病阿克苏分离物和喀什分离物的16SrDNA基因序列同源性极高,达到100%,与16SrⅤ组植原体的同源性达到98.4%以上,并且与16SrⅤ-B亚组中的枣疯病山东莱芜株系、山东龙口株系同源性最高,达到99.5%,因此归属于榆树黄化组16SrⅤ-B亚组。首次报道新疆枣疯病植原体16SrDNA的序列,确定新疆枣疯病植原体的分类地位,为枣疯病的早期诊断和检测提供依据。     

安徽地方枣种质枣疯病植原体16S rDNA序列分析

为研究安徽地方枣种质枣疯病16S rDNA序列特性,以健康及表现枣疯病症状的繁昌长枣叶片DNA为模板,克隆枣疯病植原体16S rDNA序列,获得1条1 248 bp的片段,命名为JWB-FJP1。同源性分析结果表明,JWB-FJP1属于16Sr V-B组,与重庆地方枣枣疯病植原体JWB-Xch(JQ675716)同源性最高,达到99.92%;与河北枣枣疯病植原体JWB-Hebei(GU184186)同源性最低,为67.06%,说明不同地区枣疯病植原体存在一定的生物学特异性。本研究结果为安徽地方枣种质枣疯病病原分类及其快速鉴定提供了理论依据。     

枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和tuf基因的序列同源性分析

 【目的】枣疯病是枣树上由植原体引起的一种毁灭性病害，遍布于中国华北、西北、华东、华南等25个省(市)的枣区，造成了巨大的经济损失。【方法】经PCR扩增，分别对中国陕西的彬县、阎良、武功、佳县、杨凌，河北沧州和山东德州7个枣区的枣疯病样品和杨凌4个酸枣丛枝病样品植原体16S rDNA基因保守序列和延伸因子tuf基因进行克隆和测序。【结果】获得枣疯病和酸枣丛枝病植原体的16S rDNA基因片段均为1 239 bp，tuf基因均为851 bp。通过序列同源性比较，结果表明中国陕西、河北、山东的枣疯病的病原一致，归属于植原体16S rⅤ-B组。由于枣疯病和酸枣丛枝病的植原体16S rDNA有5个碱基的差异，tuf基因的同源性为99.6%，推测为同一个种的不同寄主生物学型。【结论】首次报道了中国枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和延伸因子tuf基因的序列，确定了枣疯病和酸枣丛枝病植原体的分类地位，为研究枣疯病植原体的致病分子机理、遗传本质提供理论依据。     

葡萄金黄化植原体16SrDNA检测与RFLP分析

[目的]对多种植原体16SrDNA基因序列进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析比较,以期区分葡萄金黄化植原体不同亚种,从而为葡萄金黄化植原体的鉴定提供新依据.[方法]用植原体通用引物R16mF2/R16mR1扩增7种不同植原体16SrDNA基因序列,得到约1.5 kb的DNA片段,将此片段克隆到PGM-T载体,并通过酶切鉴定,对重组阳性克隆进行核酸序列测定及同源性分析,利用限制性内切酶XmnⅠ、XspⅠ、TaqⅠ和Rsa Ⅰ对目的片段进行酶切电泳分析.[结果]所扩增2个不同亚种的葡萄金黄化植原体D型和C型序列同源性最高,达99.72;,但利用限制性内切酶可以将上述2个亚种从植原体榆树黄化组中区分.[结论]利用限制性内切酶分析通用引物R16mF2/R16mR1所扩增的基因片段,可以将葡萄金黄化植原体区分.     

中国马铃薯疮痂病病原菌16S rDNA的遗传多样性分析

 【目的】利用16S rDNA序列对来自中国8个省（区）的34株马铃薯疮痂病菌和15株参比菌株进行系统发育分析。【方法】采用链霉菌通用引物对34株测试菌株的基因组进行16S rDNA序列扩增,测序后在GenBank中进行BLASTn比对,选取同源性较高的菌株构建系统发育树。【结果】34个测试菌株均为链霉菌属,其中Streptomyces scabies 12株、S. galilaeus 8株、S. bobili 6株、S. turgidiscabies 1株、S. acidiscabies 1株、S. diastatochromogenes 2株、S. setonii 1株、S. enissocaesilis 3株。其中S. galilaeus、S. bobili和S. enissocaesilis等种均为新发现的疮痂病病原。对各菌株的分布分析发现,山东省的疮痂病菌有4种,内蒙古自治区和陕西省有3种,四川省、河北省和山西省均有2种,黑龙江省为1种。【结论】中国马铃薯疮痂病菌存在明显的遗传多样性,且分布较为复杂。     

骏枣不同株系间的枣疯病抗性多样性

【目的】揭示骏枣品种内枣疯病抗性多样性,筛选高抗枣疯病的骏枣株系。【方法】以骏枣的16个株系为试材,通过田间调查和PCR检测,研究不同株系在嫁接侵染枣疯病后的症状表现和病原侵染情况;利用“合成-合理满意度”和多维价值理论的合并原则,对不同株系果实的相对含水率、单果重、可食率、果形指数、Vc含量、可溶性糖和可滴定酸含量等性状指标进行综合评价;采用AFLP技术对不同株系进行基因组遗传多样性分析。【结果】不同株系对枣疯病抗性表现出显著差异,可分为感病型、延迟感病型、延迟抗病型和抗病型4种类型,T15、J2、J5、J8这4个骏枣株系高抗枣疯病,其中,T15、J5和J8的果实综合性状在骏枣株系中亦居于较高水平;进一步的AFLP分析发现,不同抗性类型间在基因组水平上存在一定差异。【结论】筛选出了4个抗枣疯病骏枣株系,其中3个株系果实综合品质良好。     

新疆加工番茄溃疡病的发生及其病原菌研究

[目的]番茄溃疡病是番茄上最严重、最具毁灭性的病害之一,2010年6～8月在新疆石河子、奎屯等地的加工番茄田问相继发现典型症状的病株和病果.旨在明确引起该病害的主要病原菌种类,为进一步的防治研究打好基础.[方法]对采集的病株、病果进行病原菌的分离纯化,应用注射法、剪叶法及喷雾接种测定菌株的致病性;通过供试菌株的形态学特征、培养特性、生理生化反应的测定、16S rDNA序列分析及番茄溃疡病菌特异性引物的PCR检测确定病原的归属.[结果]所有供试菌株对供试番茄都具有致病性,表现为茎秆爆裂,植株萎蔫死亡.菌株形态特征、培养特性及生理生化反应都与密执安棒形杆菌密执安亚种(Clavibactermichiganense subsp.michiganense)的特征相一致;供试菌株16S rDNA核苷酸序列与德国已报道的密执安棒形杆菌密执安亚种菌株的核苷酸序列同源性为99.86;;特异性引物检测也得到预期目标片段.[结论]因此,将此病害确定为番茄溃疡病,其病原为密执安棒形杆菌密执安亚种(C.michiganensis subsp.Michiganensis).     

菜豆普通细菌性疫病病原菌鉴定

【目的】明确中国北方地区菜豆普通细菌性疫病病原菌。【方法】应用菌落特征、油菜黄单胞菌菜豆变种诊断试剂检测、致病性测定、16S rDNA和16S-23S rDNA ITS序列分析、特异PCR检测、脂肪酸分析及生理生化反应特征对病原菌分离物进行鉴定。【结果】从病害样品和菜豆种子样品中均分离到类似黄单胞杆菌的细菌分离物,选取25个代表分离物进行致病性测定,有24个分离物在菜豆品种“英国红”上导致典型菜豆普通细菌性疫病症状。结合16S rDNA及16S-23S rDNA ITS序列比对分析、特异性PCR检测及生理生化反应的结果,24个分离物中7株被鉴定为地毯草黄单胞菌菜豆变种,17株为褐色黄单胞菌褐色亚种。【结论】中国北方地区发生的菜豆普通细菌性疫病由地毯草黄单胞菌菜豆变种或（和）褐色黄单胞菌褐色亚种引起;褐色黄单胞菌褐色亚种在中国属首次报道。     

大麦黄条点花叶病毒的分布及其分离物的遗传多样性

【目的】明确大麦黄条点花叶病毒（Barley yellow striate mosaic virus,BYSMV）在中国北方小麦主产区的分布及其种群遗传多样性,为病害流行预警和防控提供理论依据。【方法】2008-2016年,在河北、山东、江苏、安徽、河南、陕西和山西等7个省66个县/市/区田间,采集了864份疑似病毒病症状的植物样品。提取样品总RNA,利用一步法三重RT-PCR技术检测样品中的BYSMV、水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）和北方禾谷花叶病毒（Northern cereal mosaic virus,NCMV）。利用RT-PCR扩增获得BYSMV的L和N基因片段,克隆并测定核苷酸序列,应用MEGA、DnaSP和PAML等软件分析BYSMV分离物的系统进化和遗传多样性特征。【结果】从48个县/市/区采集的336份样品中检测到BYSMV,检出率为38.89%,该病毒主要分布于陕西、河北、山西和山东,另外,河南及安徽北部亦有分布,江苏徐州和邳州仅局部发生。基于BYSMV的L、N基因序列构建的系统发育树均可将分离物划分为2个亚组,亚组I中的分离物其来源涉及全部7个省份,而亚组II中的分离物仅来自陕西和山西2个省,基于L基因序列系统发育分析表明亚组II分离物与伊朗的分离物亲缘关系较近,BYSMV的遗传分化与分离物的地理来源相关,而与寄主植物、发生时间无明显相关性。运用RDP程序包的7个软件进行基因重组分析显示没有支持重组的证据。选择压力分析显示,亚组内和亚组间的ω（dN/dS）值（0.02-0.19）远小于1,表明群体正承受净化选择。L和N基因的单倍型多样性（Hd）值（0.90909和0.99524）均大于0.5、核苷酸多样性（π）值（0.01324和0.01224）均高于0.005,表明中国BYSMV群体遗传多样性丰富。基于L和N基因片段的遗传分化研究显示,东部和西部群体的遗传分化系数（F_ST）值（0.32201和0.37326）均大于0.25,且统计检验差异显著,表明东部和西部的BYSMV群体严重分化;基因流（Nm）值（0.53和0.42）均小于1,说明有限的基因流是促使群体发生遗传分化的主要原因。【结论】BYSMV在中国北方小麦主产区分布广泛,河北、山东、江苏、安徽、河南、陕西和山西等地均有不同程度的发生。BYSMV群体具有丰富的遗传多样性,且东部和西部群体之间存在严重的遗传分化。     

云南西盟蔗区发现检疫性病害甘蔗白叶病

研究旨在明确2018年在云南西盟蔗区发现的甘蔗病害是否为植原体引起的甘蔗白叶病。使用植原体16S rRNA基因序列通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2对10份采自云南西盟蔗区的疑似甘蔗白叶病样品进行巢氏PCR检测,并将巢氏PCR 产物进行克隆测序和序列分析。巢氏PCR结果表明,所有10份样品均能扩增得到1240bp左右的片段。测序结果表明所有获得的10条16S rRNA基因序列大小均为1247bp,序列间的核苷酸一致性为100%。BLASTN分析表明从病株扩增到的所有核苷酸序列与先前云南临沧甘蔗白叶病植原体分离物LC7和LC9的16S rRNA基因序列(Genbank登陆号：KR020691和KR020692)的核苷酸序列一致性为100%。虚拟RFLP分析表明西盟分离物的16S rRNA基因序列的酶切图谱与16SrXI-B亚组植原体相同。本研究结果表明云南西盟蔗区发现的甘蔗病害为16SrXI-B亚组植原体引起的甘蔗白叶病。