新疆枣疯病植原体tuf基因的克隆与序列分析

[目的]枣疯病是一种重要的植原体病害,了解新疆枣疯病植原体的系统发育关系及遗传分化,获取其分子特征信息.[方法]利用植原体tuf基因通用引物fTufu/rTufu对新疆枣疯病病株总DNA进行PCR扩增,对部分扩增片段克隆、测序及相似性分析.[结果]获得新疆枣疯病阿克苏株系(JWB-ASZ)和喀什株系(JWB-KHZ)的tuf基因片段分别为841和814 bp.经同源性比较分析,新疆枣疯病阿克苏株系(JWB-ASZ)与喀什株系(JWB-KHZ)均隶属于16S rV-B亚组枣疯病植原体.其中JWB-KHZ株系与枣疯病植原体河北株系的tuf基因核苷酸及氨基酸同源性最高,分别达到90.2;和81.5;;JWB-ASZ与枣疯病植原体陕西株系的tuf基因核苷酸及氨基酸同源性最高,分别达到94.2;和94.6;,而与16S rV其它亚组的核苷酸及氨基酸同源性均低于70;.枣疯病阿克苏株系与喀什株系的tuf基因核苷酸及氨基酸序列之间存在明显差异,同源性仅为为73.5;和63.5;.[结论]研究报道了新疆枣疯病植原体tuf基因序列,为揭示新疆枣疯病植原体不同株系的分子特征、分子变异和遗传多样性提供了基础.     

基于secY基因对山东临沂枣疯病植原体的分子鉴定

利用FD9f／r引物对采自山东临沂的枣疯病样品进行secY基因的PCR扩增,并进行了序列测定,结果表明,该特异片段大小为1421bp。对获得的序列与NCBI数据库中相关植原体序列进行同源性分析、构建系统进化树和模拟RFLP分析,结果显示山东临沂枣疯病植原体属于secYV—C亚组,与secYV—B亚组的樱桃致死黄化株系（CLY5）和secYV—N亚组的桃树致死黄化印度分离株系（PY—IN）的亲缘关系最近,在亚组水平上进一步明确了山东临沂枣疯病植原体的分类地位。     

小麦蓝矮病植原体核糖体蛋白基因片段序列分析

采用nested-PCR技术对小麦蓝矮病植原体核糖体蛋白基因片段进行扩增,并对扩增片段进行了序列测定及分析。结果表明,nested-PCR扩增得到约1.2kb的特异片段,经核苷酸序列测定获得小麦蓝矮病植原体核糖体蛋白基因序列(1136bp);小麦蓝矮病植原体(WBD)与16Sr组中的各亚组代表植原体亲缘关系均达到96%以上,其中与三叶草变叶病植原体(CPh株系)亲缘关系最近,核苷酸同源性为99.7%,归为翠菊植原体(CandidatusPhytoplasmaasteris)16Sr-C亚组,该结果与以前报道的利用16SrDNA的分组结果一致,从亚组水平上进一步确定了小麦蓝矮病植原体的分类地位。     

苦豆子丛枝病植原体的分子检测与鉴定

[目的]对苦豆子丛枝病植原体做出分子检测与鉴定.[方法]通过PCR扩增技术,分别利用植原体16S rRNA基因,16S-23S rRNA间区及tuf基因序列的通用引物对表现丛枝病症状的苦豆子总DNA进行扩增,得到约1.2、0.3和0.8 kb特异片段.将所得片段分别进行克隆、测序及序列同源性分析.[结果]苦豆子丛枝病植原体(SAWB)上述3序列与榆树黄化组B亚组(16SrV-B)的枣疯病植原体(JWB)相应序列的同源性最高.[结论]苦豆子丛枝病植原体为16Sr V-B亚组成员.     

北京地区枣疯病植原体16SrDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段.对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%.序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组.     

北京地区枣疯病植原体16S rDNA基因序列分析

利用植原体16S rDNA基因保守序列通用引物R16F2n/R16R2对北京昌平区西峰山村小枣患病植株总DNA进行PCR扩增,结果得到约1.2 kb的特异性DNA片段。对克隆扩增获得DNA片段测序,结果表明,北京昌平地区枣疯病植原体16S rDNA基因片段长1 248 bp,与韩国枣疯病植原体同源性最高,为99.51%。序列同源性比较的结果表明克隆到的植原体归属于榆树黄化组16SrV-C亚组。     

海南苦楝丛枝病植原体核糖体蛋白基因片段序列分析

【目的】利用分子生物学方法分析采自海南儋州的苦楝丛枝病植原体核糖体蛋白(rp)基因,从亚组水平上确定苦楝丛枝病植原体的分类地位。【方法】利用植原体核糖体蛋白基因通用引物对rpF1/rpR1,应用PCR技术对苦楝丛枝病植原体的核糖体蛋白基因进行扩增,对其核苷酸序列进行测定并分析。【结果】通过PCR扩增得到约1.2 kb的特异片段,测序结果表明该片段长1 240 bp,包括rps19基因的3′区域,rpl22和rps3基因的全部区域。进一步分析发现,该片段与苦楝丛枝病贵州株系(Chinaberry witches’-broom,CWB-GZh)的亲缘关系最近,核苷酸同源性达99.9%。基于核糖体蛋白基因核苷酸序列,构建了海南苦楝丛枝病植原体与其他18个已知分类地位植原体的系统分类树状图,结果表明,引起海南苦楝丛枝病的植原体与16SrⅠ-B亚组植原体越南苦楝黄化、苦楝丛枝贵州株系和苦楝丛枝云南株系在同一条进化枝上。【结论】报道了海南苦楝丛枝病植原体的核糖体蛋白基因序列,海南苦楝丛枝病植原体属于16SrⅠ-B。     

不同症状矮牵牛植株植原体16SrDNA 片段的克隆及序列分析

应用植原体16SrRNA基因通用引物,分别对表现矮化和扁茎症状的矮牵牛植株进行巢式PCR检测,均得到约1．2kb的特异片段。将此特异片段与pGEM-T Easy载体连接并转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中,通过PCR鉴定,序列测定及同源性比较分析,结果表明：这2个植原体株系16SrDNA片段G C含量分别为47．1％和47．0％,具有其他柔膜菌纲原核生物16SrRNA基因碱基组成特征;与16Sr组中的代表株系(西方翠菊黄化,SAY)同源率达到最高,分别为99．1和98．6％,故认为这2个株系为该组成员之一。     

枣疯病植原体的分子检测与同源性鉴定

[目的]采用植原体16S通用引物建立枣疯病植原体PCR检测体系.[方法]采用植原体16S rDNA通用引物R16mF1/R16mR1,对陕西和山西具有枣疯病的枣树植株总DNA进行PCR扩增,获得了相关的枣疯病植原体序列.采用DNAMAN软件分析其同源性,绘制系统进化树.运用pDRAW32软件对17种具有16S rDNA分组的典型的限制性内切酶进行计算机模拟RFLP,确定枣疯病植原体同源性关系.[结果]从陕西和山西的枣疯病的植株中,分别得到1 433 bp和1 432 bp的条带,与已报道的枣疯病植原体比较,同源性达到99;以上,而与其他植物的植原体16S rDNA同源性多低于93;,并且与16S rDNA V-B组的遗传距离最近.pDRAW32软件模拟RFLP结果表明它们和已报道的JWB的RFLP图谱相似.[结论]枣疯病植原体归属于16SrDNA V-B,为枣疯病植原体PCR检测体系提供了理论基础.RFLP分析进一步验证了枣疯病植原体属于16SrDNA V-B,具有随地域变异性较小的特性,这将有利于不同地区枣疯病检测技术的建立.     

枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和tuf基因的序列同源性分析

 【目的】枣疯病是枣树上由植原体引起的一种毁灭性病害，遍布于中国华北、西北、华东、华南等25个省(市)的枣区，造成了巨大的经济损失。【方法】经PCR扩增，分别对中国陕西的彬县、阎良、武功、佳县、杨凌，河北沧州和山东德州7个枣区的枣疯病样品和杨凌4个酸枣丛枝病样品植原体16S rDNA基因保守序列和延伸因子tuf基因进行克隆和测序。【结果】获得枣疯病和酸枣丛枝病植原体的16S rDNA基因片段均为1 239 bp，tuf基因均为851 bp。通过序列同源性比较，结果表明中国陕西、河北、山东的枣疯病的病原一致，归属于植原体16S rⅤ-B组。由于枣疯病和酸枣丛枝病的植原体16S rDNA有5个碱基的差异，tuf基因的同源性为99.6%，推测为同一个种的不同寄主生物学型。【结论】首次报道了中国枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和延伸因子tuf基因的序列，确定了枣疯病和酸枣丛枝病植原体的分类地位，为研究枣疯病植原体的致病分子机理、遗传本质提供理论依据。     

赞皇大枣枣疯病植原体分子分类

 【目的】枣疯病是一种重要的植原体病害,本试验旨在明确惟一已知的天然三倍体品种--赞皇大枣枣疯病植原体的分类地位,为赞皇大枣枣疯病植原体分类研究提供参考。【方法】利用植原体16S rDNA通用引物对赞皇大枣枣疯病病株的DNA进行PCR扩增和克隆测序,通过BLAST比对进行序列分析,利用临位相连法构建16S rDNA系统演化树,并应用DNAstar软件进行虚拟RFLP分析。【结果】获得的赞皇大枣枣疯病植原体16S rDNA序列长度为1 850 bp（GenBank登录号GU184180）,包括1 529 bp的16S rDNA基因全序列、264 bp的邻近间隔区序列及57 bp的23S rDNA部分基因序列。同源分析表明,赞皇大枣枣疯病病原16S rDNA序列与其它植原体的相似性在87%—98%,其中与榆树黄化 Elm yellows（EY）(GenBank登录号l33763)最高相似性为98%;与大多数二倍体枣品种的植原体序列相似率达99%以上;其虚拟RFLP图谱与4个16SrⅤ亚组的代表序列图谱差异显著,赞皇大枣枣疯病植原体延伸因子tuf基因的序列(GenBank登录号JN001985) 比对结果表明,与其它亚组序列同源性为52.3%—76.7%。【结论】三倍体赞皇大枣枣疯病病原属于榆树黄化组(16Sr V),并与其中的B亚组亲缘关系最近;与二倍体品种的病原分类地位一致,说明枣疯病植原体在系统进化上比较保守。     

四川斑竹丛枝病植原体检测及16S rDNA片断序列分析

丛枝病是竹子的一类常见的重要病害,除瘤座菌外,很多报道认为植原体也是丛枝病的病原。笔者提取斑竹丛枝部位和健康组织中的总DNA,选用通用引物对植原体的16S rRNA基因进行巢式PCR扩增,得到一条约1.2kb的目的片段,而在健康植株内却没有此特异片断,表明患病植株中有植原体存在,将此植原体株系命名为PhB-WB。通过16S rDNA片断核酸序列同源性比较,结果表明斑竹丛枝病植原体是一种属于16SrⅠ组的植原体,基本确定了其分类地位。     

枣疯病植原体越冬后向枣树不同类型新生组织转移特性研究

为明确枣疯病植原体越冬后向新生组织的转移扩散特点,从而指导枣疯病预防和控制,本研究采用PCR和DAPI荧光显微技术,比较枣疯病植原体向枣树不同类型新生组织的转移情况。结果表明:室内水培的疯枣枝在萌芽30d后,新生叶片可以检测到植原体;自然栽培枣树的枣股新生叶片生长发育至24d出现植原体;枣树根蘖在萌芽后12d即可检测到植原体。嫁接试验表明,嫁接于染病冬枣砧木上的易感品种接穗‘唐星’,‘阜星’,其萌发的新生幼叶在第34天即可检测到植原体,而抗病品种‘星光’接穗在第119天才检测到植原体。由此可见,枣疯病植原体在地上和地下部分均可以越冬,越冬的植原体向枣树不同类型和不同品种新生组织中的转移扩散速度存在差异,由快到慢为根蘖>自然生枝条>离体水培枝条>嫁接接穗。     

枣疯病病树中内源激素的变化研究

【目的】揭示枣疯植原体对枣树内源激素的影响，弄清枣疯病病树中内源激素的变化趋势。【方法】应用HPLC法分别对健株、病株和盐酸土霉素治疗后转健植株中的细胞分裂素（玉米素，Zeatin）、生长素（吲哚乙酸，IAA）、赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）的含量进亚周年检测。【结果】在根部，健株、治疗株和病株中IAA、GA3和ABA的含量没有明显区别，但在7、8月份病株根部中Zeatin的含量要明显高于健株；在叶部，健株、治疗株和病株中的IAA、GA3和ABA的含量也没有明显区别，但在生长后期病株叶片中Zeatin含量显著高于健株。不同患病程度叶片中激素的比较结果表明，患病程度越重，Zeatin/IAA（C/A）比值越高。【结论】植原体侵染枣树植株后致使其内源激素失衡，主要是细胞分裂素含量的增加，最终导致了枣疯病症状表现。     

玉兰黄化病病原的分子检测与鉴定

对表现叶片黄化的玉兰植株,利用植原体16S rRNA基因通用引物进行巢式PCR检测,得到1.4 kb的特异片段,将此片段克隆后进行序列测定、分析及构建系统关系树.结果表明,该片段与16SrI组中的各植原体同源率均达到99%以上,而与其他组的植原体16S rDNA序列的同源率均低于97%,认为该植原体株系为翠菊黄化植原体组中的成员之一.     

小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白（Imp）基因的克隆和分子特性分析

 【目的】探讨小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白在介体-病原-寄主互作的分子机理。【方法】通过植原体免疫膜蛋白基因序列两侧的保守区设计引物对Imp 1051/Imp 2265,用PCR方法扩增小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因;对扩增片段的最大开放阅读框和基因的同源矩阵、系统发育树分析;对克隆基因所编码蛋白进行跨膜区、亲疏水区和前导信号序列分析。【结果】从小麦蓝矮病病株和接种长春花中均扩增到约1.0 kb的特异片段,其中小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白基因长495 bp,推导的编码蛋白含有164个氨基酸。与10种植原体的免疫膜蛋白基因进行序列同源性分析,小麦蓝矮与三叶草绿变植原体同源性最高,核苷酸和编码的氨基酸序列的同源率分别为98.4％和95.1％。蛋白质结构分析结果表明：小麦蓝矮免疫膜蛋白N端有一个跨膜的前导信号序列,C端为跨膜锚定区,中间为膜外亲水区。【结论】小麦蓝矮植原体与三叶草绿变、翠菊黄化、洋葱黄化和泡桐丛枝植原体的免疫膜蛋白为同型蛋白。     

许昌泡桐丛枝病植原体的分子鉴定

对采自河南许昌的表现丛枝症状的泡桐样品进行了病原鉴定,并通过序列同源性分析确定了其分类地位。采用16SrDNA基因的通用引物R16mF2/R16mR1、R16F2n/R16R2和延伸因子(EF-Tu)tuf基因的通用引物fTufu/rTufu,对样品总DNA进行PCR扩增,分别得到了约1.2kb和840bp的特异条带。经克隆测序,并在NCBI网站比对分析,确定所得序列分别为植原体特定的16SrDNA和tuf基因序列。将测得序列与已报道的翠菊黄化组植原体序列进行同源性比对,并构建系统进化树,显示河南许昌的泡桐丛枝病植原体属于16SrⅠ-D亚组。